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鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的结构建模、内源抑制剂对接及其钙结合机制

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广东海洋大学学报 2023年第1期43卷 87-94页

作者：冯淳淞梁释介罗永康谭雨青洪惠中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083 中国农业大学食品胶体与功能递送研究中心北京100083

【目的】分析鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(Myofibril-bound serine proteinase,MBSP)结构的基础特性。【方法】使用AlphaFold2对鲢MBSP进行结构建模,通过保守性分析、静电势计算、分子对接等手段探讨鲢... 详细信息

【目的】分析鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(Myofibril-bound serine proteinase,MBSP)结构的基础特性。【方法】使用AlphaFold2对鲢MBSP进行结构建模,通过保守性分析、静电势计算、分子对接等手段探讨鲢鱼MBSP的结构特征,并借助分子动力学模拟研究钙结合对其结构的影响。【结果与结论】鲢鱼MBSP的活性酶形式含222个残基,有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的典型结构特征,但表面充斥着更多赖氨酸,使其表面“粗糙”且利于离子键形成。62Asn及61Glu是其关键的钙结合位点,钙结合导致的结构变动可传至C端,40His、自溶环、氧阴离子稳定环等关键区域的柔性变化是钙激活机制中的重要部分。葡萄糖-6-磷酸异构酶二聚体上的10Arg及17Lys是参与鲢鱼MBSP底物结合竞争的潜在关键位点。除催化活性口袋外,潜在的变构位点亦是MBSP抑制剂设计的可选出发点。

关键词：鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶结构建模钙结合

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大黄鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的研究

大黄鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的研究

作者：刘海燕集美大学

学位级别：硕士

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（myofibril-bound serine proteinase,MBSP）是一种与肌原纤维蛋白紧密结合的丝氨酸蛋白酶,对肌原纤维蛋白具有很强的降解作用,被认为是引起鱼糜凝胶劣化的主要内源性蛋白酶之一。目前关于MBSP的研究多为淡... 详细信息

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（myofibril-bound serine proteinase,MBSP）是一种与肌原纤维蛋白紧密结合的丝氨酸蛋白酶,对肌原纤维蛋白具有很强的降解作用,被认为是引起鱼糜凝胶劣化的主要内源性蛋白酶之一。目前关于MBSP的研究多为淡水鱼,对海水鱼MBSP的研究相对较少。本研究以大黄鱼（Larimichthys crocea）为研究对象,利用生物信息学技术从大黄鱼基因组中筛选出最可能为MBSP的基因序列（Lc-MBSP）,通过基因重组技术表达纯化出重组大黄鱼MBSP（Lc-rMBSP）,并分离纯化出大黄鱼胰蛋白酶（LcTrypsin）,分析两者的性质和结构差异,从而探究Lc-rMBSP作为工具酶的应用前景。前期实验中发现大黄鱼肌原纤维蛋白在50～60℃发生降解,丝氨酸蛋白酶抑制剂可以抑制这种降解,从而证实了MBSP在大黄鱼中的存在。从大黄鱼基因组中检索到16条注释为类胰蛋白酶的序列,通过与淡水鱼MBSP蛋白序列进行生物进化树分析和多序列比对,以及与狗母鱼MBSP的N端序列进行比对,得到亲缘性最近且同源性最高的序列,命名为Lc-MBSP,Lc-MBSP开放阅读框为735 bp,共编码244个氨基酸残基。对Lc-MBSP进行毕赤酵母表达得到分子量约28 kDa的Lc-rMBSP。Lc-rMBSP在40～60℃的中性条件下可以显著降解肌原纤维蛋白。为了比较Lc-rMBSP与胰蛋白酶之间的性质差异,通过硫酸铵盐析和柱层析法从大黄鱼肝胰腺中分离纯化出分子量约25 kDa的Lc-Trypsin。对Lc-rMBSP和Lc-Trypsin进行酶学性质分析,结果表明:Lc-rMBSP的最适温度和pH为50℃和8.0,具有较高热稳定性,Lc-Trypsin最适温度和pH分别为45℃和8.5,热稳定性较差。Lc-rMBSP的最适荧光底物为Boc-Leu-Lys-Arg-MCA,仅特异性切割精氨酸残基,而Lc-Trypsin的最适底物为BocPhe-Ser-Arg-MCA,对赖氨酸和精氨酸残基都具有水解作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂可以有效抑制Lc-rMBSP和Lc-Trypsin的活性,但PMSF对Lc-rMBSP的抑制效果不强。温度对Lc-rMBSP和Lc-Trypsin二级结构结构具有很大的影响,且热变性不可逆,经拟合得到Lc-rMBSP和Lc-Trypsin的热变性温度分别为（62.82±1.09）℃和（56.67±0.82）℃,说明Lc-rMBSP热稳定性高于Lc-Trypsin。比较分析Lc-rMBSP和Lc-Trypsin分别对原肌球蛋白和精氨酸激酶的降解情况,发现降解条带存在较大差异,说明两者底物特异性的不同。经同源建模得到Lc-MBSP和Lc-Trypsin的三级结构,发现Lc-MBSP的底物结合口袋（Ser-192、Gly-215、Ser-225）与Lc-Trypsin（Asp-190、Gly-213、Gly-223）存在较大差异,这可能是导致两者在底物特异性上存在差异的原因之一。本研究利用生物信息学技术筛选出最可能为大黄鱼MBSP的基因序列,并重组表达出Lc-rMBSP,与天然纯化的Lc-Trypsin进行性质和结构的比较与分析,为大黄鱼鱼糜质量的控制提供一定的理论指导,也为海水鱼MBSP的研究以及应用价值的开发提供一定的理论参考。

关键词：大黄鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶生物信息学基因克隆体外表达分离纯化性质分析

鲤肌肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的分子克隆(英文)

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水产学报 2007年第4期31卷 423-430页

作者：郭川梁银龙刘光明苏文金曹敏杰集美大学生物工程学院福建省高校水产养殖与食品安全重点实验室集美大学生物工程学院福建省高校水产养殖与食品安全重点实验室福建厦门361021

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)是最近发现的一种蛋白酶。该酶参与肌原纤维蛋白的降解及鱼糜制品弹性的下降。但是,对该酶一级结构的研究,迄今为止,未有报道。本文根据已测定的鲤MBSP N-末端氨基... 详细信息

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)是最近发现的一种蛋白酶。该酶参与肌原纤维蛋白的降解及鱼糜制品弹性的下降。但是,对该酶一级结构的研究,迄今为止,未有报道。本文根据已测定的鲤MBSP N-末端氨基酸序列以及丝氨酸蛋白酶活性中心保守序列设计兼并引物,结合RT-PCR技术实现了MBSP基因片段的扩增。再根据克隆到的MBSP片段序列设计基因特异引物,用于MBSP基因的5′和3′末端快速扩增。综合以上结果,鲤MBSP的全长被确定。序列分析表明,MBSP cDNA含有一732 bp的开放阅读框,编码243个氨基酸残基,其中信号肽长度为21个氨基酸残基。组成丝氨酸蛋白酶活性中心的氨基酸残基(His61,Asp107和Ser197)在MBSP中保守存在。成熟MBSP含有222个氨基酸残基,分子量为24.5 ku,比其天然蛋白的分子量30 ku略小。成熟MBSP的等电点为10.43。鲤MBSP与鲫MBSP,猪胰蛋白酶,牛胰蛋白酶,美洲鲽胰蛋白酶的同源性分别为80.6%,55.8%,55.3%和53.9%。而与仓鼠肌肉中具有胰凝乳蛋白酶性质的蛋白酶的同源性为39.2%。MBSP有高含量的赖氨酸残基(11.93%),此特性可能与该酶的肌原纤维结合特性有关。

关键词：鲤克隆肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶同源性

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鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶研究进展

食品科学 2013年第9期34卷 336-339页

作者：杜翠红曹敏杰集美大学生物工程学院福建厦门361021

本文综述鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)的分离纯化、酶学特性、分子生物学及基因重组表达等方面的研究进展。鱼类MBSP是一种弱碱性蛋白酶,它普遍存在于鱼类肌肉中。MBSP降解肌原纤维蛋白是... 详细信息

本文综述鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)的分离纯化、酶学特性、分子生物学及基因重组表达等方面的研究进展。鱼类MBSP是一种弱碱性蛋白酶,它普遍存在于鱼类肌肉中。MBSP降解肌原纤维蛋白是造成鱼糜凝胶劣化的主要原因。同时,由于鱼类MBSP具有良好的热稳定性及对精氨酸或赖氨酸残基羧基端特异分解的底物特异性,因此,该蛋白酶有望开发成为一种新颖的工具酶应用于蛋白质质谱鉴定等研究领域。

关键词：肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶分离纯化酶学特性分子克隆重组表达

鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的重组表达及其酶学特性研究

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鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的重组表达及其酶学特性研究

作者：韩龙集美大学

学位级别：硕士

鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）与胰蛋白酶的底物特异性类似，但其热稳定性优于哺乳动物的胰蛋白酶，可作为胰蛋白酶替代品。另外，在鱼糜加工过程中，MBSP降解肌原纤维蛋白是造成鱼糜凝胶劣化的主要原因之一。因此，对鱼类MBS... 详细信息

鱼类肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）与胰蛋白酶的底物特异性类似，但其热稳定性优于哺乳动物的胰蛋白酶，可作为胰蛋白酶替代品。另外，在鱼糜加工过程中，MBSP降解肌原纤维蛋白是造成鱼糜凝胶劣化的主要原因之一。因此，对鱼类MBSP的重组表达及其酶学特性研究，可为开发MBSP作为蛋白质质谱鉴定中的工具酶及研制鱼类MBSP抑制剂提供理论依据。本文以淡水鲫鱼为研究对象，以鲫鱼肌肉中总RNA为模板，采用RT-PCR技术获得了鲫鱼MBSP基因（MBSP）片段，其开放阅读框为729bp，编码242个氨基酸残基，在其N-末端存在一个含20个氨基酸残基的信号肽。因此，成熟鲫鱼MBSP基因（MBSP2）大小为669bp，编码222个氨基酸残基。通过基因重组技术将成熟鲫鱼MBSP基因片段（MBSP2）整合到毕赤酵母的染色体上，成功构建了重组酵母表达菌株GS115/pPIC9K-MBSP2。将该菌株在摇瓶中用1.0%甲醇进行诱导表达，在发酵液上清中可检测到分子量约36kDa的重组蛋白。Western blotting鉴定该重组蛋白为重组鲫鱼MBSP。同时，PAS染色证明了该重组鲫鱼MBSP为糖蛋白。在7L发酵罐中对重组酵母表达菌株GS115/pPIC9k-MBSP2进行高密度发酵，获得其适宜的工艺条件为：发酵温度在28.5-29.5℃之间、pH范围在5.2-5.8之间、溶氧量保持在30%以上、流加方式为溶氧控制、间断补加甲醇诱导32h。发酵结束时，发酵液OD600可达56.2，菌体湿重为123.9g/L。通过对不同分离纯化技术进行合理组合及其工艺条件的优化，建立了一套重组鲫鱼MBSP的分离纯化工艺流程：7L发酵罐中发酵→离心取发酵液上清→30-60%硫酸铵沉淀→透析→Q-Sepharose阴离子交换层析→超滤脱盐及浓缩→冷冻干燥。最终获得了重组鲫鱼MBSP的固体产品，可用于酶学性质分析及其应用研究。重组鲫鱼MBSP的酶学性质研究包括底物特异性、最适温度和温度稳定性、最适pH和酸碱稳定性、酶抑制剂和金属离子对其酶活的影响。底物特异性研究表明，重组鲫鱼MBSP可水解蛋白质中赖氨酸的羧基端肽键，而不识别精氨酸残基，这与蛋白质质谱鉴定中的工具酶Lys-C的水解特性相类似;其最适反应温度和pH分别为55℃和pH7.5;该酶具有较好的热稳定性和酸碱稳定性;丝氨酸蛋白酶抑制剂及高浓度金属离子可显著抑制其活性。此外，重组鲫鱼MBSP能快速降解鲫鱼肌原纤维蛋白，这与天然鲫鱼MBSP特性类似。将重组鲫鱼MBSP与蛋白质质谱鉴定中的工具酶Lys-C的酶学性质进行比较。结果表明，重组鲫鱼MBSP具有热稳定性高、pH适用范围宽、对底物的亲和力强及反应速度快等优势。另外，重组鲫鱼MBSP能有效降解如牛血清白蛋白（BSA）和精氨酸激酶等典型蛋白质。因此，重组鲫鱼MBSP有望作为蛋白质质谱鉴定中的工具酶。

关键词：鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶毕赤酵母表达系统酶学特性新型蛋白工具酶

白鲢肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶单域抗体文本库构建及淘选

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食品与生物技术学报 2020年第3期39卷 87-94页

作者：周文锦屈跃宽张林洪隋建新中国海洋大学食品科学与工程学院山东青岛266003

鱼肉中的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)在加工过程中可降解肌原纤维,引起鱼糜制品的凝胶劣化。一种新型特异性高的鲨源抗体——单域抗体(single-domain antib odies,sdAbs),能直接与抗原结合并... 详细信息

鱼肉中的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)在加工过程中可降解肌原纤维,引起鱼糜制品的凝胶劣化。一种新型特异性高的鲨源抗体——单域抗体(single-domain antib odies,sdAbs),能直接与抗原结合并抑制酶的活性。研究主要完成了针对MBSP单域抗体制备的前期工作:文本库建立及淘选过程,以克隆表达的MBSP为抗原免疫铰口鲨鱼(nurse shark,Ginglymostoma cirratum),构建鲨鱼单域抗体文本库,并从中淘选针对MBSP的特异性单域抗体噬菌粒,最终得到31个能与MBSP特异性结合的噬菌粒,为获得抗MBSP单域抗体鉴定了基础,以期抑制或消除MBSP的活性,解决现有鱼糜制品凝胶劣化的问题。

关键词：肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶铰口鲨单域抗体噬菌体展示技术

重组鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶制备罗非鱼胶原小肽的工艺条件优化

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重组鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶制备罗非鱼胶原小肽的工艺条...

鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶在毕赤酵母中的重组表达及其底物特异性研究

中国食品科学技术学会第十五届年会

作者：李梦思曹敏杰刘光明集美大学食品与生物工程学院福建省水产品加工工程研发中心

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）能特异性水解蛋白质精氨酸或赖氨酸羧基端肽键,与胰蛋白酶有相似的底物水解特性。本研究以鲫鱼（Crucian carp）为研究对象,通过总RNA提取,PCR扩增等技术克隆得到688bp的MBSP基因序列,进行酵母表达菌... 详细信息

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）能特异性水解蛋白质精氨酸或赖氨酸羧基端肽键,与胰蛋白酶有相似的底物水解特性。本研究以鲫鱼（Crucian carp）为研究对象,通过总RNA提取,PCR扩增等技术克隆得到688bp的MBSP基因序列,进行酵母表达菌株SMD1168-pPICZαA-MBSP的构建与表达,并利用表达获得的MBSP进行罗非鱼胶原小肽的制备。实验中采用单因素分析、甲醛滴定法以及正交实验等方法优化商业猪胰蛋白酶与重组MBSP酶解罗非鱼鱼皮胶原蛋白制备生物活性肽的工艺条件,并以酶解液的水解度和DPPH·清除率为指标衡量酶解效果。在最优条件下比对两种酶的酶解结果,显示重组MBSP的酶解液的水解度略低于商业胰蛋白酶,但其DPPH·清除率提高20%。因此,重组MBSP有望用于酶解明胶制备具有抗氧化活性、免疫调节、ACE抑制活性等特性的生物活性肽,并应用于功能性食品等行业中。

关键词：鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶酶解明胶工艺优化生物活性肽

来源： cnki会议评论

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鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶在毕赤酵母中的重组表达及其底物...

草鱼丝氨酸蛋白粗酶的提取、酶学特性及大豆胰蛋白酶抑制剂对其活性的影响

华东地区生物化学与分子生物学学会联合会2017年学术交...

作者：李梦思曹敏杰刘光明集美大学食品与生物工程学院福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室

鲫鱼肌肉中存在一种水解特性类似于胰蛋白酶的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound senne proteinase,MBSP),由于其在生物体内含量少、分离纯化困难,因此有必要利用基因工程技术来大量获得以便进行后续研究。目前,鲫鱼MBSP基因... 详细信息

鲫鱼肌肉中存在一种水解特性类似于胰蛋白酶的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound senne proteinase,MBSP),由于其在生物体内含量少、分离纯化困难,因此有必要利用基因工程技术来大量获得以便进行后续研究。目前,鲫鱼MBSP基因序列已被克隆得到并实现在毕赤酵母菌中的诱导表达。对于其底物特异性的研究,主要采用定点突变引入突变位点来获得突变基因;突变基因分别与克隆载体、表达载体连接,经两轮测序确保表达载体开放阅读框架以及目的片段的完整性后,对带有突变基因的表达载体进行线性化处理以及DNA纯化回收,并利用电转化法将DNA导入到酵母细胞中;直至单菌落长成后做酵母转化子表型鉴定(Mut),选择阳性转化子诱导表达;表达产物经底物特异性检测,再结合分子对接方法对其底物特异性发生变化的原因进行分析。SDS-PAGE与Western blot结果表明,鲫鱼MBSP突变体毕赤酵母表达菌株的成功构建及诱导表达;底物特异性检测结果发现,与野生型MBSP相比,突变体S171A丧失了对Lys残基的水解能力;分子对接结果显示,当底物与酶结合口袋以及催化活性中心相互作用时,酶水解底物的能力最强;而当底物与酶的作用部位彻底偏离口袋与活性中心时,酶就不能切割对应底物。由于重组MBSP与胰蛋白酶一样,能水解蛋白产生小肽,因此热稳定性优于胰蛋白酶的重组MBSP有望应用于未来的质谱鉴定。对于生物活性肽的多样性主要取决于不同底物特异性的蛋白酶,因此底物特异性变化的重组MBSP也具有较好的应用价值。

关键词：鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶底物特异性毕赤酵母重组表达

来源： cnki会议评论

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广东海洋大学学报 2024年第3期44卷 112-118页

作者：周佳怡洪惠罗永康谭雨青中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083

【目的】探究草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)粗酶的提取方法、酶学特性,以及大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对草鱼鱼糜凝胶品质的影响,为改善传统草鱼鱼糜制品品质提供理论基础。【方法】从草鱼背肌中提取M... 详细信息

【目的】探究草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)粗酶的提取方法、酶学特性,以及大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对草鱼鱼糜凝胶品质的影响,为改善传统草鱼鱼糜制品品质提供理论基础。【方法】从草鱼背肌中提取MBSP粗酶液,探究提取过程中漂洗次数(1~5次)、热处理温度(35、40、45、50、55℃)、酸洗脱pH值(pH 4.0、pH 5.5)对提取液酶活性的影响,获得最佳提取条件;设置梯度实验探究所得酶的最适温度、pH、稳定性等酶学特性,最后探究大豆胰蛋白酶抑制剂对粗酶酶活性的影响及其对草鱼鱼糜凝胶性能的调控。【结果及结论】经3次漂洗、45℃热处理、pH 4.0酸洗脱后得到的草鱼MBSP粗酶液酶活性最高(P肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶有可逆竞争性抑制作用,半抑制质量浓度为10.85μg/mL,抑制常数Ki=0.24μmol/L。

关键词：草鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶分离提取酶学特性大豆胰蛋白酶抑制剂

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