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第三军医大学学报 2014年第5期36卷 417-421页

作者：康志杰闫金松崔嵩李国辉黄斯勇梁亮尹郸丹梁英民第四军医大学第二附属医院血液科西安710038 大连医科大学附属二院血液科大连116021 大连医科大学附属中心医院SICU 大连116033 第四军医大学基础医学部医学遗传学与发育生物学教研室西安710032

目的研究癌基因BCR/ABL C末端肌动蛋白结合域(actin-binding domain,ABD)蛋白对白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法构建含有ABD基因的重组表达载体,应用蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)将蛋白转入白血病细胞内,应用West... 详细信息

目的研究癌基因BCR/ABL C末端肌动蛋白结合域(actin-binding domain,ABD)蛋白对白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法构建含有ABD基因的重组表达载体,应用蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)将蛋白转入白血病细胞内,应用Western blot与免疫荧光法确定蛋白是否进入白血病细胞,然后分别应用流式细胞仪及MTT法检测融合蛋白对白血病细胞凋亡及增殖的影响。结果成功构建PTD-ABD融合表达载体,获得高纯度PTD-ABD融合蛋白。同时构建PTD表达载体并获得高纯度表达蛋白。将PTD、PTD-ABD蛋白与白血病细胞K562、HL60共培养,Western blot与免疫荧光法确定PTD、PTD-ABD蛋白成功进入细胞内。与阴性对照比较,PTD-ABD蛋白能显著抑制HL60细胞的生长,并且对HL60细胞的凋亡具有明显的促进作用,差异具有统计学意义(P0.05);PTD蛋白对K562、HL60细胞的增殖及凋亡无影响,与阴性对照比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论PTD转导的ABD蛋白抑制HL60细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。

关键词： BCR ABL融合蛋白肌动蛋白结合域蛋白转导结构域 K562细胞 HL60细胞细胞增殖细胞凋亡

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ABD蛋白的表达及对K562，HL60细胞的作用研究

ABD蛋白的表达及对K562，HL60细胞的作用研究

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作者：康志杰第四军医大学

学位级别：硕士

研究背景慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是发生于造血干细胞的克隆性恶性肿瘤,1845年Craigie[1]和Bennet [2]在爱丁堡发现。在1960年,Nowell和Hunger-ford首先在费城发现CML病人具有获得性的染色体异常,将这个异常的... 详细信息

研究背景慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是发生于造血干细胞的克隆性恶性肿瘤,1845年Craigie[1]和Bennet [2]在爱丁堡发现。在1960年,Nowell和Hunger-ford首先在费城发现CML病人具有获得性的染色体异常,将这个异常的染色体命名为费城染色体(Philadelphia,Ph[3, 4])。1973年,Rowley发现它是9号和22号染色体长臂间交互易位的结果,即t(9,22) (q34;ql1)[ 5]。1983年以后,证实了9号染色体上c-abl与22号染色体上bcr基因交互易位,在22号染色体上形成了BCR—ABL融合基因,编码BCR—ABL融合蛋白,表达P190,P210,P230融合蛋白,具有很强的酪氨酸激酶活性,可使一系列信号蛋白发生持续性的磷酸化,导致白血病的发生[6]。 CML病人经历慢性期、加速期、急变期三个阶段,各自的中位数时间分别为3～4年;6～9个月;3～6个月[7]。目前,CML的治疗方法主要有化疗、干扰素治疗、STi571(甲磺酸伊马替尼)、干细胞移植等。传统的化疗手段虽能改善症状,缓解病情,但不能阻止疾病的转化,不能从根本上消除恶性克隆;干扰素治疗血液学缓解率70～80%,存活期延长72个月;异基因骨髓移植(allo-BMT)是目前最有希望治愈慢粒的方法,但有30%～35%患者移植后出现与移植物抗宿主病(GVHD)相关的致命性并发症,另外,患者本身的年龄要求以及不到1/3的患者可找到配型相一致的同胞骨髓供者等因素限制了其临床应用;自体骨髓移植(ABMT)相关并发症发生率较低,不受年龄限制,但缺乏有效的体外骨髓净化措施以预防残留白血病细胞导致的复发。STi571是一种bcr-abl融合蛋白酪氨酸激酶抑制剂,STi571单独或者联合干扰素治疗有效的CML患者,血液学缓解率可以达到90%,已经肯定能延长CML患者生存期,这为CML的靶向治疗开辟了一个新的领域,但是STi571的耐药性问题至今无法解决。目前,众多的临床及实验研究表明,bcr-abl融合基因及其表达产物bcr-abl融合蛋白是慢性粒细胞性白血病治疗上的特异性靶位[8, 9]。随着对bcr-abl癌蛋白的结构和功能的不断研究,人们逐渐认识到在不同的结构域水平对该蛋白的结构和功能进行干预,同样也可以抑制bcr-abl蛋白酪氨酸激酶的活性,这也提示人们继续探索更好的慢粒的治疗方法。ABD(肌动蛋白结合域,actin binding domain)区是bcr-abl融合蛋白上C末端的一个结构域[10],研究表明,ABD在BCR/ABL PTK介导的白血病生成中起重要作用[11-13],白血病的发生依赖于碳末端的ABD存在,ABD变异可以降低体外肿瘤细胞的生存活力[11],而在体内则延迟肿瘤的发病时间,因此如果能够有效调控ABD区,就有可能控制bcr-abl融合蛋白的转化活性,从而达到治疗CML的目的。本实验通过分子生物学方法得到ABD片断,进行融合表达,对ABD的功能进行研究,从而为白血病的靶向治疗奠定新的分子基础。实验目的体外获得bcr-abl融合基因的ABD区结构域,进行原核表达,并将融合表达蛋白作用于白血病细胞系,进一步探讨其对白血病的细胞周期和增殖的影响,为探索CML新的药物作用靶点和新的治疗药物奠定了基础。实验方法根据GenBank中人ABD结构域基因的碱基序列,按照引物设计原则,针对ABD基因设计引物。以带有人类慢性粒细胞白血病bcr-abl基因全长的PGD210质粒[14]为模板,应用PCR技术扩增出ABD基因的编码序列,测序结果证实与GenBank中完全一致;将ABD基因的插入到融合有PTD(蛋白转导结构域,protein tansductong domain)基因片段的原核表达载体pET32a中,以获得PTD-ABD融合基因。将构建重组原核表达载体pET32a-PTD-ABD转化感受态细胞大肠杆菌BL21后,予以IPTG诱导,改变诱导条件,使目的蛋白PTD-ABD在上清中有较大量表达。大量诱导细菌,用次氮基三乙酸镍琼脂糖(Ni-NTA agarose)亲和层析珠对可溶性目的蛋白进行纯化。将目的蛋白PTD-ABD与K562细胞和Hela,HL60细胞共培养,用免疫荧光和Western blot的方法观察和验证目的蛋白的跨膜转运情况;用光学显微镜和细胞计数研究细胞形态和生长曲线的变化;MTT、流式细胞仪技术研究PTD-ABD融合蛋白对K562细胞和HL60细胞的增殖和凋亡的作用。实验结果ABD结构域基因被有效的扩增,DNA序列分析表明所构建的PTD -ABD融合基因的表达质粒与预期设计相同,ABD、PTD、PTD-ABD融合蛋白得到正确的表达。且PTD-

关键词：肌动蛋白结合域 K562细胞 HL60细胞增殖凋亡

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