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河南师范大学学报（自然科学版） 2009年第6期37卷 99-102页

作者：董文举丁荣昌冯九菊河南师范大学化学与环境科学学院河南省高校环境科学与工程重点学科开放实验室河南新乡453007

采用循环伏安法制备了聚l-苯丙氨酸薄膜修饰玻碳电极,研究了对乙酰氨基酚在该修饰电极上的电化学行为,建立了循环伏安法测定对乙酰氨基酚的新方法.研究发现：在pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中,聚l-苯丙氨修饰电极对对乙酰氨基酚存在灵敏的氧... 详细信息

采用循环伏安法制备了聚l-苯丙氨酸薄膜修饰玻碳电极,研究了对乙酰氨基酚在该修饰电极上的电化学行为,建立了循环伏安法测定对乙酰氨基酚的新方法.研究发现：在pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中,聚l-苯丙氨修饰电极对对乙酰氨基酚存在灵敏的氧化作用,氧化峰电位负移50 mV.对乙酰氨基酚的浓度在2.0×10^-5-2.0×10^-4mol.l^-1和8.0×10^-7-2.0×10^-5mol.l^-1范围内与其峰电流呈良好的线性关系,检出限为5.0×10^-7mol.l-1.对1.0×10^-5mol.l^-1对乙酰氨基酚平行测定5次,相对标准偏差为1.6%.该法可用于药品中对乙酰氨基酚的测定,结果满意.

关键词：聚l-苯丙氨酸化学修饰电极对乙酰氨基酚循环伏安法

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木瓜蛋白酶的定向固定化研究

木瓜蛋白酶的定向固定化研究

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作者：李有花江南大学

学位级别：硕士

近年来,人们对固定化酶的研究虽然有了一定的进展,但是大多数固定化方法存在着固定化方向随机、固定化量低、酶容易失活等问题。本文以木瓜蛋白酶的三维结构为研究基础,利用基于分子对接的虚拟筛选技术,筛选并设计出所需要的分子配基,... 详细信息

近年来,人们对固定化酶的研究虽然有了一定的进展,但是大多数固定化方法存在着固定化方向随机、固定化量低、酶容易失活等问题。本文以木瓜蛋白酶的三维结构为研究基础,利用基于分子对接的虚拟筛选技术,筛选并设计出所需要的分子配基,从而实现对酶的定向固定化。具体内容阐述如下:（1）定向固定化小分子配基的筛选和设计。基于木瓜蛋白酶（PDB ID:1BP4）的三维结构,分析酶蛋白表面的凹陷分布、疏水性分布、电性分布、氢键供受体密度分布等特征,最终选择结构稳定且远离催化活性位点的结合口袋作为定向固定化位点（Glu-52、leu-53、Cys-56、leu-74、Tyr-78、Gly-79、Ile-80、His-81、Cys-95、Ser-97 和Tyr-103）,然后利用分子对接技术进行两轮虚拟筛选,筛选出与1BP4定向固定化位点有特异结合能力、与催化活性中心位点无特异性结合能力的小分子配基,并根据蛋白酶与配基的性质和形状互补关系,设计出固定化分子配基9,9-二（2,3-环氧丙基）芴（DDI）。（2）接枝分子配基的固定化载体制备、表征研究。以聚乙二醇（PEG）长链为间隔臂,将DDI接枝到氯甲基化聚苯乙烯微球（PS-C1）载体上,制备出Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型不同接枝配基密度的固定化载体（PS-PEG-DDI）,其环氧值（EV）分别为:0.42 mmol/g、0.69 mmol/g、0.96 mmol/g。热重分析（TGA）表明,在25～700℃温度内,失重率分别为48.5%、44.4%、36.3%,与PS-Cl载体的失重率74.0%相比,接枝配基和提高其EV值均可使提高载体的热稳定性。（3）木瓜蛋白酶的定向固定化研究。定向固定化实验研究表明,当使用PS-PEG-DDI（Ⅱ）载体作为固定化载体时,其酶固载量和酶活力分别为120.95 mg/g、79.33 U/mg,与PS-Cl载体相比,均能提高10倍以上。最佳固定化实验条件:初始酶量为2.0 mg/ml、时间为4 h、温度为40℃、0.2 M磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0。与自由酶相比,固定酶的酶学性质（如酸碱稳定性、热稳定性、贮存稳定性等）均有一定程度的提高,震荡洗涤12 h后,剩余酶活力仍保持70%以上。（4）酶催化合成O-Phe实验研究表明,自由酶在2.5 h时达到最大产率34.57%,而固定酶在4 h时才能达到最大产率38.82%,核磁共振和质谱分析O-Phe结构发现,自由酶催化合成O-Phe的聚合度主要为6,固定酶催化合成O-Phe的聚合度主要为3,最大可达到8。利用响应面分析法（RSM）,得到催化合成的最适工艺条件:酶量为8.0 mg（自由酶）和8.3 mg（固定酶）,反应时间为2.4 h（自由酶）和4.2 h（固定酶）,反应温度为45.4℃（自由酶）和46.9℃（固定酶）,pH为8.1（自由酶）和8.1（固定酶）。自由酶和固定酶催化合成O-Phe的最适DMSO浓度分别为10%、15%,产率分别提高了 4.6%、9.1%,固定酶的有机溶剂耐受性明显比自由酶的强。固定酶在重复使用五次后,催化产率仍能达到25.24%。

关键词：定向固定化木瓜蛋白酶聚l-苯丙氨酸分子对接

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