检索结果-南通市图书馆

作者：范如婷北京化工大学

学位级别：硕士

聚3-羟基丙酸(P3HP)是一种极具开发前景的聚羟基脂肪酸(PHA)。P3HP作为新型高分子生物材料,其不仅具有良好的生物兼容性、可降解性和较高刚性,还具较好延展性和拉伸性能等,被视为塑料最佳替代品。目前,自然界中尚未发现能够天然合成P3H... 详细信息

聚3-羟基丙酸(P3HP)是一种极具开发前景的聚羟基脂肪酸(PHA)。P3HP作为新型高分子生物材料,其不仅具有良好的生物兼容性、可降解性和较高刚性,还具较好延展性和拉伸性能等,被视为塑料最佳替代品。目前,自然界中尚未发现能够天然合成P3HP的微生物,且P3HP化学合成存在很大局限性,因此,利用微生物法生产P3HP尤为迫切。本课题选取肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniaeMGH78578)为宿主,甘油为底物,通过甘油脱水酶(DhaB)、辅酶A依赖的丙醛脱氢酶(PduP)和PHA合酶(PhaC)的催化完成P3HP的积累。研究以下内容：1、成功克隆了来源于罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha H16)的phaCl和来源于集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)的phbC,构建了两株重组菌K. p(pET-pk-phaCl)和K. p(pET-pk-phbC),发酵检测两重组菌中并无可测P3HP产生,推测可能由于P3HP前体物不足导致,需要强化前体物浓度。2、克隆来源于K. pneumoniae和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)辅酶A依赖的丙醛脱氢酶基因(pduPxp与pduPse)并在K. pneumoniae中表达,发现PduPse能够高效表达,其酶活为2.03 U/mg,相比于对照菌(K. pneumoniae与K.p(pET-pk))分别提高了7.58倍和5.31倍。pduPSe基因超表达对宿主菌生长、甘油消耗以及代谢流量产生了影响。重组菌K. p(pET-pk-pduPSe)能高效转化有害中间产物3-羟基丙醛,使得生物量的提高;且能够重排碳代谢流。3、构建了P3HP重组菌株K. p(pET-pk-pduPSe-phaC1)和K.p(pET-pk-pduPSe-phbC),研究PduP和PHA合酶串联表达重组菌P3HP的积累。结果表明,pduPSe与phaC1串联表达未明显增加宿主菌生长负荷,而不同来源的PHA合酶基因对宿主菌生物量影响具有差异。重组菌K. p(pET-pk-pduPSe-phaC1)代谢甘油速率较平稳,24 h时甘油剩余量为14.26 g/L,与对照菌比甘油消耗速率能力有所降低;重组菌K. p(pET-pk-pduPSe-phbC) 24 h时甘油剩余量为18.89 g/L,其甘油代谢能力低于重组菌K. p(pET-pk-pduPSe-phaC1)。4、为探究代谢流分向对P3HP合成的影响,构建了dhaT基因敲除的重组重组菌株K. p(pET-pk-pduPSe-phaC1-ΔdhaT)和K.p(pET-pk-pduPSe-phbC-ΔdhaT)。结果表明,该重组菌株生长减慢,甘油消耗速率大幅降低,表明dhaT敲除后并没有消除1,3-丙二醇代谢途径对P3HP合成的影响,反而干扰了甘油代谢网络。该改造策略不利于P3HP积累。成功用tac启动子替换原载体中pk启动子,构建重组菌K. p(pET-tac-pduPSe-phaC1)和K. p(pET-tac-pduPSe-phbC),经分析,tac启动子可使PduPSe与PhaC1蛋白均得以成功表达。

关键词：聚3-羟基丙酸肺炎克雷伯氏菌甘油 PHA合酶丙醛脱氢酶

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重组肺炎克雷伯氏菌转化甘油为聚3-羟基丙酸

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中国生物工程杂志 2017年第6期37卷 86-92页

作者：窦一涵李映赵鹏范如婷田平芳北京化工大学生命科学与技术学院北京100029 北京联合大学生物化学工程学院北京100023

聚3-羟基丙酸[Poly(3-hydroxypropionate),P3HP]是一种生物可降解及生物相容的新型聚羟基脂肪酸酯。目前已鉴定的生物均不能天然合成P3HP。采用PCR克隆鼠伤寒沙门氏菌的丙醛脱氢酶(Pdu P)基因及罗尔斯通氏菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶(Pha... 详细信息

聚3-羟基丙酸[Poly(3-hydroxypropionate),P3HP]是一种生物可降解及生物相容的新型聚羟基脂肪酸酯。目前已鉴定的生物均不能天然合成P3HP。采用PCR克隆鼠伤寒沙门氏菌的丙醛脱氢酶(Pdu P)基因及罗尔斯通氏菌的聚羟基脂肪酸酯合成酶(Pha C)基因,构建共表达载体,转化肺炎克雷伯氏菌后获得两株重组菌。以甘油为唯一碳源进行摇瓶发酵,pdu P和pha C共用tac启动子的工程菌K.p(p ET-tac-pdu P-pha C)产生0.054 g/L的P3HP,而pdu P和pha C各自独用tac启动子的工程菌K.p(p ET-tac-pdu P-tac-pha C)产生0.091 g/L的P3HP。

关键词：肺炎克雷伯氏菌聚3-羟基丙酸甘油丙醛脱氢酶聚羟基脂肪酸酯合成酶

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从甘油途径生物法合成P3HP和1,3-PDO

从甘油途径生物法合成P3HP和1,3-PDO

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作者：杨鹏大连工业大学

学位级别：硕士

石油基材料的产生给人类的生活带来了极大的便利,但随着人类对石油基材料的需求越来越大,其无法被环境降解的缺点也带来了严重的环境问题,同时,随着全球石油储量的下降,寻找一种能替代现行塑料性能,又不造成白色污染的塑料替代品——可... 详细信息

石油基材料的产生给人类的生活带来了极大的便利,但随着人类对石油基材料的需求越来越大,其无法被环境降解的缺点也带来了严重的环境问题,同时,随着全球石油储量的下降,寻找一种能替代现行塑料性能,又不造成白色污染的塑料替代品——可降解塑料成为当前的研究热点。聚3-羟基丙酸(P3HP)作为PHA家族中的一员,因其具有特殊的物理、化学性能而成为当前可降解塑料研究中的热点。本文利用基因重组技术,在大肠杆菌中构建了一套以甘油为底物合成P3HP的代谢途径,通过发酵生产成功的获得了P3HP。主要结果如下：(1)以甘油为底物合成P3HP。甘油脱水酶是控制甘油分解和产生P3HP的关键性限速酶,对P3HP的转化速率起着至关重要的作用。本文对甘油途径进行了改进,通过在大肠杆菌中引入肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶基因dhaB123及其辅助因子基因gdrAB代替丁酸梭菌的甘油脱水酶,使得整个代谢反应过程可以在有氧的条件下进行。单因素优化得到最适培养条件,最终得到了1.54 g/L的P3HP,占细胞干重的50%。(2)以甘油为底物发酵生产P3HP和1,3-丙二醇。以甘油为底物生物合成3-HP的代谢途径中,存在还原力不平衡的问题,限制了P3HP的产量。本文在P3HP的合成途径中引入1,3-PDO的合成,以平衡细菌体内还原力。通过自杀性载体系统介导的同源重组技术,将甘油脱水酶及其激活因子的合成基因整合到大肠杆菌基因组中,能够有效的降低质粒的丢失率,保持质粒稳定性。经过发酵条件优化后,最终构建的工程菌可以获得2.7 g/L的P3HP和2.4 g/L的1,3-PDO,相比此前研究中1.54 g/L的P3HP摇瓶产量,此代谢途径P3HP产量有了近两倍的提高,且同时能够获得1,3-PDO。

关键词：聚3-羟基丙酸甘油脱水酶大肠杆菌还原力同源重组技术质粒稳定性

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