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耻垢分枝杆菌中反式翻译报告体系的构建

微生物与感染 2019年第1期14卷 16-22页

作者：胡亚文白嘉诚葛文雪姚梦依张雪莲复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室上海200433

细菌在翻译过程中,mRNA受到损伤(如缺失终止密码子)时会使翻译提前终止,导致核糖体熄火,细菌自身会启动核糖体拯救途径。由tmRNA-SmpB介导的反式翻译系统是结核分枝杆菌中的核糖体拯救途径,对结核分枝杆菌的生长繁殖有重大影响。为探究... 详细信息

细菌在翻译过程中,mRNA受到损伤(如缺失终止密码子)时会使翻译提前终止,导致核糖体熄火,细菌自身会启动核糖体拯救途径。由tmRNA-SmpB介导的反式翻译系统是结核分枝杆菌中的核糖体拯救途径,对结核分枝杆菌的生长繁殖有重大影响。为探究分枝杆菌中反式翻译途径的启动及其功能特点,本研究选取耻垢分枝杆菌为实验菌株,分别以mCherry和egfp作为报告基因,通过在报告基因3′端添加大肠埃希菌终止子序列,构建能在菌体中反映反式翻译表达的报告体系,并初步探究该体系中报告基因的动态表达特点。结果显示,相比正常表达mCherry的对照菌株,实验菌株中表达的错误mCherry蛋白很快被水解,菌体颜色均明显浅于前者,增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)定量检测数据也显示错误EGFP水平显著低于正常表达的EGFP水平,表明两种反式翻译报告体系均构建成功。报告基因的动态表达数据显示,蛋白出现翻译异常时,耻垢分枝杆菌可在蛋白翻译过程中快速启动反式翻译途径,并于40～45h将不成熟错误蛋白完全水解。本研究构建的反式翻译报告体系可为后续开展分枝杆菌反式翻译途径的功能研究及抗结核药物筛选提供帮助。

关键词：耻垢分枝杆菌反式翻译反式翻译报告体系

LFLIU联合载不同抗结核药纳米粒对耻垢分枝杆菌及生物膜的损伤效应研究

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LFLIU联合载不同抗结核药纳米粒对耻垢分枝杆菌及生物膜的损伤效...

作者：李健虎重庆医科大学

学位级别：硕士

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)病原体引起的世界性传染病。MTB是一种胞内致病菌,其细胞壁厚、通透性差等,使得抗结核药物很难渗透到MTB菌体中,导致了大量耐药菌株出现,加之生物膜易形成,进... 详细信息

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)病原体引起的世界性传染病。MTB是一种胞内致病菌,其细胞壁厚、通透性差等,使得抗结核药物很难渗透到MTB菌体中,导致了大量耐药菌株出现,加之生物膜易形成,进一步加剧了结核分枝杆菌的难治性。本研究旨在制备载一线抗结核药利福平和载二线抗结核药左氧氟沙星聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid)-Polyethylene glycol,PLGA-PEG)纳米粒,运用低频低强度超声(Low frequency and low intensity ultrasound,LFLIU)的辐射力和声流作用等对药物进行控释,比较研究协同促进对MTB的模式菌株耻垢分枝杆菌(MS)及其生物膜的损伤效应及其杀菌机制。目的探讨LFLIU联合载不同抗结核药纳米粒在声动力作用下促进纳米粒高效进入MS菌体内并高效杀灭MS。且进一步研究LFLIU联合载药纳米粒对MS生物膜的损伤效应。方法1.载不同抗结核药纳米粒的制备及特性检测:采用双乳化法制备载利福平PLGA-PEG纳米粒(Rifampicin-loaded PLGA-PEG nanoparticles,RIF-NPs)和载左氧氟沙星PLGA-PEG纳米粒(Levofloxacin-loaded PLGA-PEG nanoparticles,LEV-NPs),利用马尔文激光粒度仪检测纳米粒的粒径、Zeta电位及分散性,电镜下观察纳米粒形态,紫外分光光度法测量载药纳米粒包封率和载药率,并分别通过溶血实验对纳米粒的安全性进行验证。2.LFLIU联合RIF-NPs与LEV-NPs对体外MS的杀菌效应:用超声设备(42 k Hz固定频率)输出声强为0--0.60 W/cm连续可调的LFLIU,实验参数选用声强0.45W/cm、辐照时间15min。用平板计数法、XTT法和LSCM观察探究超声联合RIF-NPs与LEV-NPs对体外MS细菌活性的影响,探究LFLIU联合两种载药纳米粒对MS的作用机制。使用活性氧试剂盒染色在激光共聚焦扫描显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)下观察活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生情况。3.LFLIU联合载药纳米粒对MS生物膜体外杀菌作用:采用细胞培养板法建立体外MS生物膜模型,LFLIU联合载药纳米粒对MS生物膜处理后,用结晶紫染色法检测生物膜活性。为探究LFLIU联合载药纳米粒对体外MS生物膜的损伤效应,利用激光共聚焦显微镜检测超声辐照后生物被膜中细菌的活/死情况。结果1.成功制备了物理特性良好的载左氧氟沙星纳米粒(LEV-NPs)和载利福平纳米粒(RIF-NPs):(1)扫描电镜下观察呈球形,形态均一、分散性良好。(2)载药纳米粒性能稳定,LEV-NPs和RIF-NPs粒径大小分别为298.267±12.413 nm、293.167±11.554 nm,ZATA电位均为负电荷。包封率分别为66.021±2.363%、65.740±1.094%,载药率分别为3.317±0.140%、3.042±0.257%。2.LFLIU联合两种载药纳米粒对浮游MS的杀菌效果:(1)用LFLIU联合LEV-NPs和RIF-NPs辐照MS悬液15分钟,与对照组相比,LFLIU联合两种载药纳米粒作用MS悬液15分钟后继续培养24小时,平板计数细菌存活显著低于其他实验组,统计学有明显差异(P<0.01)。(2)STYO9/PI荧光染色后LSCM观察:LFLIU联合LEV-NPs作用后,活细胞数(绿色荧光)明显减少,可以看到视野中主要以死细胞数(红色荧光)为主,表明LFLIU联合LEV-NPs能显著降低细菌的活性。(3)透射电镜观察显示对照组和非超声组细菌细胞壁未见明显损伤,在US+LEV-NPs组中,细菌细胞壁破裂,细菌结构不完整,MS受到了严重损伤。(4)LFLIU联合LEV-NPs辐照MS生物膜后,共聚焦显微镜及流式细胞仪检测结果表明,与其他组相比,LFLIU联合LEV-NPs组活性氧产量增加。3.LFLIU联合载药纳米粒对MS生物膜具有体外杀菌作用:(1)通过体外细胞培养板法建立MS体外成熟生物膜模型。(2)经LFLIU联合载药纳米粒对体外成熟生物膜模型进行辐照,结晶紫染色结果表明MS生物被膜活性显著降低(P<0.01)。(3)利用激光共聚焦扫描显微镜观察MS生物膜中细菌的存活情况,可以发现LFLIU联合LEV-NPs辐照后生物膜中细菌的存活率明显低于其他实验组。使用Image J对荧光强度进行定量分析,LEV-NPs组荧光强度显著高于其他组(P<0.001)。结论LFLIU联合载药纳米粒对MS均有显著的协同抗菌作用,但具有声敏剂特性的LEV联合LFLI

关键词：低频低强度超声耻垢分枝杆菌抗结核药物生物膜纳米粒

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耻垢分枝杆菌whiB3的功能研究

耻垢分枝杆菌whiB3的功能研究

作者：王文卿华中农业大学

学位级别：硕士

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是一种重要的人畜共患病原菌,它们在感染过程中不可避免地会面临宿主环境中诸如营养缺乏,氧化还原以及低pH等压力,因此结核分枝杆菌必须通过及时调控基因的表达来应对这些环境变化。近年来研... 详细信息

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是一种重要的人畜共患病原菌,它们在感染过程中不可避免地会面临宿主环境中诸如营养缺乏,氧化还原以及低pH等压力,因此结核分枝杆菌必须通过及时调控基因的表达来应对这些环境变化。近年来研究发现一类仅在放线菌中存在的whiB基因家族对于分枝杆菌应对环境压力有重要意义。本论文工作以模式分枝杆菌---耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)为材料,研究了whiB3基因对于菌株的生长和抗性等特征的影响,主要取得了以下几方面的结果： (1)构建耻垢分枝杆菌whiB3的敲除突变株,发现野生型Wt Msm和突变型MsmΔwhiB3菌株在形态和液体培养特征方面表现出明显的差异,MsmΔwhiB3菌体变长,且在液体培养过程中不容易聚集。(2)在H202(7.84mM)条件下,野生型的生长明显优于突变型,突变型几乎没有生长迹象;在pH 4.5的条件下,野生型和突变型也表现出较明显的差异,突变型的生长劣于野生型。(3)互补实验发现,结核分枝杆菌的MtbwhiB3full同源基因几乎不能回复耻垢突变株的抗性表型,而其他三种互补型MsmwhiB3full, MsmwhiB3ΔC, MtbwhiB3ΔC却表现出了互补效应。(4)突变频率的测定首次证明了MsmwhiB3full和MtbwhiB3full在保护耻垢分枝杆菌免遭诱变能力方面的明显差异,及在损伤剂H2O2 (7.84 mM)处理前后野生型,突变型及各种互补型表现出截然不同的突变率。 whiB3基因在分枝杆菌中具有广泛保守的特性,参与细菌的多种生理和基因表达调控。本研究发现耻垢分枝杆菌的突变株在许多表型方面其与已经报道的结核分枝杆菌whiB3突变株有明显的差异,这暗示病原菌的whiB3可能存在其他的调控机制。同时,本研究首次发现分枝杆菌的whiB3基因与其抗药性有直接关系。这些工作对于理解分枝杆菌的whiB3基因的功能及其在生理和病理中的作用具有重要意义。

关键词：结核分枝杆菌耻垢分枝杆菌环境压力 whiB3

病原微生物高通量测序检测确诊耻垢分枝杆菌感染1例

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新发传染病电子杂志 2023年第3期8卷 68-70页

作者：徐清浪车媛梅钟渊斌何颖杨丽霞朱滢邬小萍南昌大学第一附属医院感染性疾病科南昌330006

耻垢分枝杆菌属于Ⅳ型(快速生长型)非结核分枝杆菌,广泛分布于自然环境中,可以在皮肤黏膜正常存在,当机体免疫力下降或正常皮肤黏膜破损时可成为条件致病菌。耻垢分枝杆菌感染相关病例报道甚少,发病率低,临床上容易出现漏诊。应用病原... 详细信息

耻垢分枝杆菌属于Ⅳ型(快速生长型)非结核分枝杆菌,广泛分布于自然环境中,可以在皮肤黏膜正常存在,当机体免疫力下降或正常皮肤黏膜破损时可成为条件致病菌。耻垢分枝杆菌感染相关病例报道甚少,发病率低,临床上容易出现漏诊。应用病原微生物高通量测序技术(NGS)对感染性疾病的病原体筛查能更早期发现病原体,达到早诊断、早治疗的目的,极大提高了疑难性感染性疾病的诊断率。本文通过血液NGS检测确诊1例耻垢分枝杆菌感染病例进行报道并文献复习,拟提高对耻垢分枝杆菌感染的诊治水平。

关键词：发热待查非结核分枝杆菌耻垢分枝杆菌病原微生物高通量测序

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耻垢分枝杆菌作为免疫调节剂的研究

中华微生物学和免疫学杂志 2005年第9期25卷 752-755页

作者：徐苗陈保文沈小兵苏城罗永艾王国治中国药品生物制品检定所北京100050 重庆医科大学附属第一医院

目的探讨耻垢分枝杆菌制剂对不同免疫状态动物的免疫调节作用。方法注射环磷酰胺建立免疫功能低下的动物模型,以结核分枝杆菌感染(早期)或猪血清致敏建立免疫功能亢进的动物模型,然后将耻垢分枝杆菌制剂分别注射于正常、免疫功能低下和... 详细信息

目的探讨耻垢分枝杆菌制剂对不同免疫状态动物的免疫调节作用。方法注射环磷酰胺建立免疫功能低下的动物模型,以结核分枝杆菌感染(早期)或猪血清致敏建立免疫功能亢进的动物模型,然后将耻垢分枝杆菌制剂分别注射于正常、免疫功能低下和免疫功能亢进的动物,研究耻垢分枝杆菌制剂对不同模型动物T淋巴细胞增殖反应、迟发型超敏反应或速发型超敏反应的影响。结果耻垢分枝杆菌制剂可增强正常动物的T淋巴细胞增殖反应和迟发型超敏反应,促进免疫功能低下小鼠T淋巴细胞增殖功能的恢复,抑制免疫功能亢进豚鼠的迟发型超敏反应和猪血清致敏小鼠的速发型超敏反应。结论耻垢分枝杆菌制剂具有双向免疫调节作用。

关键词：耻垢分枝杆菌制剂双向免疫调节耻垢分枝杆菌免疫调节剂 T淋巴细胞增殖反应迟发型超敏反应分枝杆菌制剂速发型超敏反应免疫功能低下免疫功能亢进结核分枝杆菌感染

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耻垢分枝杆菌ligD和ku突变株的构建

耻垢分枝杆菌ligD和ku突变株的构建

作者：王莹莹华中农业大学

学位级别：硕士

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)可引起结核病,是微生物中人类最大的敌人,据世界卫生组织预测全球三分之一的人口感染了MTB, WHO的数据显示,2011年全球新发现有870万感染者患病,其中有110万患者同时感染艾滋病毒,估计有... 详细信息

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)可引起结核病,是微生物中人类最大的敌人,据世界卫生组织预测全球三分之一的人口感染了MTB, WHO的数据显示,2011年全球新发现有870万感染者患病,其中有110万患者同时感染艾滋病毒,估计有140万人死于结核病。因与艾滋病毒共同感染人体造成死亡的数目之巨,MTB已成为传染病中的头号杀手。虽然现已开发几种抗结核类药物但由于耐药性的产生,这些药物的控制效果远远达不到令人满意的效果。结核病是一个从未解决的麻烦。 DNA双链断裂是普遍存在的一种DNA损伤,但其对于细胞来说是致命的。修复DNA双链断裂的途径有同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(non-homologous end-joining, NHEJ)。NHEJ最早是在哺乳动物细胞中发现的,并一直被认为只存在于真核生物中,其在真核生物中对保持基因组的稳定性有很重要的作用。但之后的研究发现NHEJ也普遍存在于一些病原微生物中,且与耐药和免疫逃避相关。现已知NHEJ修复途径涉及两个蛋白LigD和Ku,同时对这两个蛋白的功能也有了一定的了解,而在NHEJ修复过程中,LigD同Ku的作用机制及调控方式还不是很明确。本实验室前期研究发现去乙酰化酶Sir2可能参与NHEJ修复途径,还发现Ku的29位赖氨酸有乙酰化修饰,这暗示了NHEJ修复的调控可能同Ku的K29乙酰化修饰有关。我们以耻垢分枝杆菌做为模式生物使用无标记基因敲除法来构建ligD和ku两个基因的不同突变体ligD ΔPolDom、TBku-his、ku-his、kuR29-his和kuQ29-his。无标记基因敲除需要两个质粒,一个质粒为p1NIL,为目的基因提供多克隆位点,第二个质粒pGOAL,含有一个两端为PacI酶切位点的标记基因盒。标记基因盒里有抗生素抗性基因、lacZ和sacB。构建成的自杀质粒含有pGOAL质粒的标记基因盒和修饰过的目的基因,最后经过两次筛选得到我们所要的突变体。实验结果发现同源臂的长度、碱处理质粒时碱的终浓度、沉淀DNA溶液的pH等条件和第二次筛选的扩增培养时间等都影响双交换法突变株的构建。同时也发现M. smegmatis Ku的C端加His标签不影响其参与的NHEJ活性,这为后面检测耻垢分枝杆菌ku突变株(kuR29-his和kuQ29-his)的NHEJ活性时,消除His标签引起NHEJ活性改变的影响。这些突变体为研究NHEJ修复的调控方式提供了重要的材料。

关键词：耻垢分枝杆菌非同源末端连接 Ku LigD 突变株

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耻垢分枝杆菌在抗酸染色实验教学中的应用

实验教学与仪器 2016年第10期33卷 21-22页

作者：郭永明魏红英王燕杨健四川省内江医科学校四川内江641000 川北医学院病原生物学与免疫学实验教学中心四川南充637000

从耻垢分枝杆菌的培养特性和染色特性,可以判断其是否可替代卡介苗成为实验教学中抗酸染色法的菌种。耻垢分枝杆菌接种脑心浸液固体培养基和液体培养基培养,分别于接种后24 h,48 h,72 h和96 h对培养物进行抗酸染色。耻垢分枝杆菌在脑心... 详细信息

从耻垢分枝杆菌的培养特性和染色特性,可以判断其是否可替代卡介苗成为实验教学中抗酸染色法的菌种。耻垢分枝杆菌接种脑心浸液固体培养基和液体培养基培养,分别于接种后24 h,48 h,72 h和96 h对培养物进行抗酸染色。耻垢分枝杆菌在脑心浸液固体培养基中培养24 h,48 h,72 h和96 h都能呈现较好的抗酸染色效果,且在培养48 h染色效果最佳,而在液体培养基中培养48 h,72 h和96 h能观察到抗酸染色阳性结果,但细菌形态逐渐变短小,在染色时间上,6 min染色效果优于4 min染色。实验证明,耻垢分枝杆菌可替代卡介苗作为抗酸染色的菌种使用,充足的染色时间能保证较好的染色效果。

关键词：耻垢分枝杆菌卡介苗抗酸染色

基于GlnR和RegX3介导的耻垢分枝杆菌胆固醇代谢调控机制研究

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基于GlnR和RegX3介导的耻垢分枝杆菌胆固醇代谢调控机制研究

作者：马衡石河子大学

学位级别：硕士

结核分枝杆菌仍然是巨大的公共卫生威胁。胆固醇作为结核分枝杆菌特征性碳源,对在其宿主巨噬细胞中的生存至关重要。GlnR作为氮代谢全局性调控因子,在响应环境氮源信号调控氮代谢的同时,也能调控碳、磷等营养元素的代谢。此外SenX3/RegX... 详细信息

结核分枝杆菌仍然是巨大的公共卫生威胁。胆固醇作为结核分枝杆菌特征性碳源,对在其宿主巨噬细胞中的生存至关重要。GlnR作为氮代谢全局性调控因子,在响应环境氮源信号调控氮代谢的同时,也能调控碳、磷等营养元素的代谢。此外SenX3/RegX3作为磷源感知双组分调控系统在调控磷代谢的同时,也能协调调控碳源代谢。因此,氮、碳和磷在维持机体正常生理功能及提供能量外,它们彼此之间存在着复杂而又精巧的协同调控作用。胆固醇是结核分枝杆菌在巨噬细胞中存活和保持毒力的关键碳源,而分枝杆菌中胆固醇代谢机制仍未被彻底了解。在这里我们基于课题组的前期探索研究为基础,以GlnR和RegX3为媒介,进一步深入解析分枝杆菌中碳、氮、磷等营养元素的协同调控机制。具体研究内容如下:（1）GlnR介导的环境氮信号对耻垢分枝杆菌中胆固醇代谢的调控机制研究。我们通过生物信息学分析在kstR的启动子区域发现了一个典型的GlnR结合基序（CCGAC-AACAGT-GACAC）,然后进行了电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）分析以确定体外结合。然后进行了实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR）以分析与野生型（WT）,glnR缺失的突变体（ΔglnR）和glnR补充性（ΔglnR::glnR）菌株在氮限制条件下与胆固醇降解相关的基因的差异表达。巨噬细胞ATP测试表明,GlnR-KstR的协同调节显著减少了耻垢分枝杆菌的侵袭。结果表明,参与胆固醇分解代谢的许多基因都通过KstR受到响应环境氮水平GlnR的调控,进而影响了耻垢分枝杆菌的入侵。（2）RegX3响应磷源信号对耻垢分枝杆菌中胆固醇转运的调控机制研究。首先采用生物信息学技术对RegX3蛋白的结构、功能及其结合motif进行预测分析,然后通过,EMSA实验初步证实RegX3可以直接结合mce4基因簇上游调控区的特征motif。然后进行了RT-qPCR实验分析了,与野生型（WT）,regX3敲低的突变体（i regX3）和regX3过表达菌株（OE regX3）在磷限制条件下胆固醇转运mce4基因簇转录表达差异。生长曲线及刃天青表型实验表明,RegX3促进了耻垢分枝杆菌的生长与存活。结果表明,胆固醇转运子mce4基因簇许多基因都受到响应环境磷水平RegX3的调控,从而影响了耻垢分枝杆菌的生长和存活。通过以上研究,我们揭示了耻垢分枝杆菌响应环境氮、磷信号对胆固醇转运、代谢的调控机制,这为分枝杆菌在宿主细胞内的生存控制提供了新的策略。

关键词：耻垢分枝杆菌胆固醇 GlnR RegX3

猪囊尾蚴特异性抗原cC1重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建与鉴定

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中国血吸虫病防治杂志 2014年第3期26卷 287-291页

作者：王雪梅骆江坤李倩李江艳陈勇陶志勇夏惠方强蚌埠医学院病原生物学教研室蚌埠233030 安徽省感染与免疫重点实验室蚌埠医学院免疫学教研室

目的构建表达猪囊尾蚴cC1抗原的重组耻垢分枝杆菌疫苗。方法提取pET28a-cC1质粒DNA,用xho I和BamH I双酶切,用Klenow酶补平xho I酶切末端,同时提取pMV261穿梭质粒载体,用Hind III和BamH I双酶切,用Klenow酶补平Hind III酶切末端,纯化后... 详细信息

目的构建表达猪囊尾蚴cC1抗原的重组耻垢分枝杆菌疫苗。方法提取pET28a-cC1质粒DNA,用xho I和BamH I双酶切,用Klenow酶补平xho I酶切末端,同时提取pMV261穿梭质粒载体,用Hind III和BamH I双酶切,用Klenow酶补平Hind III酶切末端,纯化后的酶切产物通过T4连接酶连接,构建pMV261-cC1穿梭质粒,测序验证正确后,将pMV261cC1穿梭质粒经电穿孔法转化耻垢分枝杆菌,构建重组耻垢分枝杆菌,经热诱导后,以猪囊尾蚴病患者血清为一抗进行Western-blotting鉴定。此外,比较正常耻垢分枝杆菌和重组cC1耻垢分枝杆菌生长状态并绘制生长曲线。结果构建的重组穿梭载体经酶切、测序验证正确。构建的重组耻垢分枝杆菌经热诱导后,SDS-PAGE电泳分析显示,在40 kDa处有外源性蛋白表达,与预期值相符。Western-blotting显示其可被猪囊尾蚴病患者血清识别,表明cC1抗原基因在耻垢分枝杆菌中表达成功。重组耻垢分枝杆菌与正常耻垢分枝杆菌的增殖特性无明显差异。结论成功构建了表达猪囊尾蚴特异性抗原cC1的重组耻垢分枝杆菌疫苗。

关键词：猪囊尾蚴 cC1 耻垢分枝杆菌疫苗