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耻垢分枝杆菌MSMEG-6402基因的克隆、表达及功能鉴定

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耻垢分枝杆菌MSMEG-6402基因的克隆、表达及功能鉴定

作者：蔡丽娜大连医科大学

学位级别：硕士

结核病(Tuberculosis，TB)主要是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的，多种耐药性结核菌株的出现以及临床抗结核药物的缺乏，致使结核病发病率呈逐年上升趋势，寻找新的药物靶点、开发能有效治疗多重耐药结核... 详细信息

结核病(Tuberculosis，TB)主要是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的，多种耐药性结核菌株的出现以及临床抗结核药物的缺乏，致使结核病发病率呈逐年上升趋势，寻找新的药物靶点、开发能有效治疗多重耐药结核的抗结核药物亟待解决。细胞壁是分枝杆菌赖以生存的重要屏障，而聚阿拉伯糖是细胞壁的核心组分。聚阿拉伯糖基的活性供体被证实是聚十异戊二烯磷酸阿拉伯糖(Decaprenyl-phospho-arabinose, DPA)。近几年，随着磷酸核糖转移酶(Rv3806c)和差向异构酶(Rv3790/Rv3791)功能的揭示，DPA特异的合成途径逐渐被阐明，是由三个连续反应组成：(1)Rv3806c催化5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)转移到聚十异戊二烯磷酸(DP)分子上形成5-磷酸核糖聚十异戊二烯磷酸(5-P-DPR);(2)磷酸酶催化5-P-DPR分子上的5-磷酸基团水解形成聚十异戊二烯磷酸核糖(DPR);(3)Rv3790/Rv3791催化DPR生成DPA。在此途径中，催化5-P-DPR脱磷酸的磷酸酶尚未被鉴定。而与Rv3806c处于同一启动子的Rv3807c通过蛋白结构域预测具有磷酸酶功能结构域，该蛋白被推测催化5-P-DPR生成了DPR。非致病菌耻垢分枝杆菌的MSMEG-6402基因是Rv3807c基因的同源基因，本论文通过在大肠杆菌BL21(DE3)中将MSMEG-6402基因克隆、可溶性表达并纯化，建立MSMEG-6402蛋白的体外酶活测定方法，对MSMEG402的功能进行阐明，这将有助于完善对于DPA合成代谢途径的认识以及寻找新型抗结核药物靶点。本研究的实验内容包括：1)构建pET16b-MSMEG-6402表达质粒，在BL21(DE3)中进行可溶性表达，并用镍-组氨酸亲和层析法对带有N-末端组氨酸标签的MSMEG-6402蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE和Western-blotting对表达蛋白和纯化蛋白进行检测鉴定;2)由于5-P-DPR反应直接底物的缺乏，需要偶联Rv3806c参与的酶促反应来完成酶活检测，因此我们采用与MSMEG-6402相同的表达载体和菌株对Rv3806c蛋白进行可溶性表达并纯化，通过SDS-PAGE和Western-blotting进行检测鉴定;3)根据底物DP/PRPP和产物DPPR/DPR的性质及其消耗产出量的变化，分别采用孔雀石绿-钼酸铵测磷法、薄板层析法(TLC)以及质谱法(MS)对MSMEG-6402纯化蛋白的功能活性进行检测。研究结果如下： 1)成功对MSMEG-6402基因和Rv3806c基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行可溶性表达，通过Ni-NTA纯化获得目的蛋白，分子量分别为20kDa和33kDa;2)建立MSMEG-6402蛋白功能活性的测定方法，对其磷酸酶活性进行鉴定：孔雀石绿-钼酸铵测磷法对反应生成的游离单磷酸进行检测，观察到MSMEG-6402蛋白参与的反应组明显的颜色和OD630值变化，阴性对照组与空白对照组结果相近;TLC法对反应产物DPPR和DPR进行检测，由于二者均为糖脂化合物，同时采用糖显色和脂显色，以DP和PRPP为底物对照，样品组有DPPR和DPR的生成，而阴性对照组只有DPPR的生成;MS法对底物DP/PRPP的消耗量和产物DPPR/DPR的生成量进行直接检测，结果显示DP/PRPP有一定量的消耗，同时DPPR/DPR有相应的峰出现。综上所述，本研究利用不同的方法对MSMEG-6402蛋白的功能进行了阐明，鉴定了其特异的磷酸酶活性，催化5-P-DPR生成DPR，进一步完善了DPA的合成代谢途径，在今后的研究工作中，我们将改善对MSMEG-6402蛋白的纯化方法，减少杂蛋白的含量，体外模拟DPA的合成通路，对MSMEG-6402蛋白在代谢网络中扮演的角色进一步阐述。

关键词：耻垢分枝杆菌 MSMEG-6402 功能检测

耻垢分枝杆菌黏膜接种对小鼠过敏性哮喘的免疫调节作用

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临床儿科杂志 2011年第3期29卷 255-260页

作者：郭盛吴良霞范小勇郝春莉马辉陈凌张建华上海交通大学附属第六人民医院儿科上海200233 复旦大学附属公共卫生临床中心科学研究部上海201508

目的观察耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)对过敏性哮喘小鼠防御素β-2(Defb2)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)、IFN-γ、IL-4及过敏原特异性IgE、IgG1、IgG2a表达的影响,探讨Ms黏膜接种干预哮喘的免疫调节机制。方法 SPF级BALB/c小... 详细信息

目的观察耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)对过敏性哮喘小鼠防御素β-2(Defb2)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)、IFN-γ、IL-4及过敏原特异性IgE、IgG1、IgG2a表达的影响,探讨Ms黏膜接种干预哮喘的免疫调节机制。方法 SPF级BALB/c小鼠随机分为哮喘组、干预组、对照组3组。以卵清蛋白(OVA)致敏,气道激发建立哮喘模型。OVA致敏前7 d鼻黏膜接种Ms进行干预。以Real-time荧光定量PCR法检测肺组织Defb2、MIP1、MIP2 mRNA的表达,ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)、纵膈淋巴结细胞培养上清中MIP1、MIP2、IFN-γ、IL-4的浓度,ELISA法检测血清总IgE以及OVA特异性IgE、IgG1、IgG2a水平。结果 Ms干预可以显著增高哮喘小鼠Defb-2 mRNA的表达(31.21±1.56对0.78±0.11,P0.05);Ms干预可使BALF和淋巴结培养上清中MIP1、MIP2降低,使BALF和淋巴结培养上清中IL-4降低(97.43±7.83对153.80±5.20,150.75±54.58对625.81±55.98,P均耻垢分枝杆菌有望继卡介苗之后成为哮喘预防的另一候选疫苗。

关键词：哮喘耻垢分枝杆菌巨噬细胞炎症蛋白防御素过敏原特异性免疫球蛋白

耻垢分枝杆菌引起臀部肌肉感染一例并文献复习

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中华检验医学杂志 2013年第8期36卷 752-754页

作者：魏宏莲杨靖温海楠王自辉杨永辉赵建宏河北医科大学第二医院检验科石家庄050000 河北医科大学第二医院中医外科石家庄050000 河北省胸科医院病理科

非结核分枝杆菌是指除结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，原称为非典型分枝杆菌。非结核分枝杆菌广泛存在于环境中，

关键词：耻垢分枝杆菌文献复习肌肉感染非结核分枝杆菌非典型分枝杆菌臀部麻风分枝杆菌牛分枝杆菌

MSMEG_0372基因敲除、回补及过表达耻垢分枝杆菌的构建与鉴定

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石河子大学学报（自然科学版） 2022年第5期40卷 620-626页

作者：刘仪牛宏红杨赛丽曹旭东袁俐石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室新疆石河子832000

目的为研究MSMEG_0372基因的功能,构建该基因敲除、回补及过表达耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.smegmatis)并鉴定。方法聚合酶链反应(PCR)扩增MSMEG_0372基因的左、右臂(即等位基因互换底物,allele exchange substrates,AES)。AES与p0004s经过酶切并连接,构建p0004s-AES质粒。p0004s-AES与phAE159经过酶切并连接,构建phAE159-AES噬菌粒。噬菌粒转化至M.smegmatis,30℃培养,扩增重组噬菌体。用重组噬菌体侵染M.smegmatis,37℃培养,发生基因同源重组,形成MSMEG_0372基因敲除菌株。筛选阳性菌落,PCR鉴定。PCR扩增MSMEG_0372基因,构建pMV361-MSMEG_0372质粒。将pMV361-MSMEG_0372质粒分别导入MSMEG_0372基因敲除菌株和野生型M.smegmatis,构建MSMEG_0372基因回补菌株和MSMEG_0372基因过表达菌株。筛选阳性菌落,PCR鉴定。结果PCR扩增出MSMEG_0372的左、右臂(AES),构建了p0004s-AES质粒和phAE159-AES噬菌粒,制备了高滴度的重组噬菌体并侵染M.smegmatis,从而成功构建了MSMEG_0372基因敲除菌株。构建了pMV361-MSMEG_0372质粒,成功构建了MSMEG_0372基因回补和过表达菌株。结论成功构建并鉴定了MSMEG_0372基因敲除、回补及过表达M.smegmatis,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

关键词：耻垢分枝杆菌 MSMEG_0372基因基因敲除基因回补基因过表达

耻垢分枝杆菌MurB蛋白的可溶性表达、纯化和多克隆抗血清制备

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中国科技论文 2015年第18期10卷 2157-2160页

作者：徐立铭郑琦康健步云钱磊马郁芳大连医科大学生物化学与分子生物学教研室辽宁大连116044 大连医科大学附属第二医院科研中心辽宁大连116027

获得耻垢分枝杆菌MurB纯化蛋白,制备小鼠源性MurB多克隆抗血清。首先,利用PCR技术扩增耻垢分枝杆菌murB基因,连接至pColdII载体并转化至E.coli BL21(DE3)菌株;然后,低温下以IPTG诱导MurB蛋白的表达,并利用Ni-His亲和层析技术纯化MurB蛋... 详细信息

获得耻垢分枝杆菌MurB纯化蛋白,制备小鼠源性MurB多克隆抗血清。首先,利用PCR技术扩增耻垢分枝杆菌murB基因,连接至pColdII载体并转化至E.coli BL21(DE3)菌株;然后,低温下以IPTG诱导MurB蛋白的表达,并利用Ni-His亲和层析技术纯化MurB蛋白;最后,将MurB纯化蛋白联合免疫佐剂注射BalB/c小鼠,经过初次免疫和2次加强免疫后分离抗血清,并分别利用ELISA和Western blot技术检测制备的抗血清对MurB蛋白的效价和特异性。结果显示:已获得具有理想浓度和纯度的MurB纯化蛋白;已制备具有较高效价的小鼠源性MurB多克隆抗血清,该抗血清能够特异性识别耻垢分枝杆菌可溶性蛋白组分中的MurB蛋白。因此,制备的MurB多克隆抗血清能够应用于分枝杆菌MurB蛋白的检测分析,为MurB功能研究奠定了基础。

关键词：微生物学耻垢分枝杆菌 UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸还原酶 MurB 多克隆抗血清

耻垢分枝杆菌MSMEG6935基因缺失株的构建及基因缺失对生物被膜产量的影响研究

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耻垢分枝杆菌MSMEG6935基因缺失株的构建及基因缺失对生物被膜产...

作者：金琨琪吉林大学

学位级别：硕士

结核病是种死亡率和感染率极高的慢性传染病，由结核分枝杆菌侵入人体引起，主要在肺部常见感染，称为肺结核。由于与艾滋病混合感染，三大传染病之的结核病在最近几年来有卷土重来之势。自然条件下，80%以上的细菌均能形成生物被膜。... 详细信息

结核病是种死亡率和感染率极高的慢性传染病，由结核分枝杆菌侵入人体引起，主要在肺部常见感染，称为肺结核。由于与艾滋病混合感染，三大传染病之的结核病在最近几年来有卷土重来之势。自然条件下，80%以上的细菌均能形成生物被膜。生物被膜的形成加强了细菌的耐药性和对环境的耐受性，从而引起严重的持续感染。在体外条件下，结核分枝杆菌也能形成生物被膜。本课题组研究发现：在金黄色葡萄球菌中，当自溶素基因被抑制时，细菌生物被膜产量会降低。结核分枝杆菌的Rv3915基因能编码cw1M蛋白，其为种肽聚糖水解酶(自溶素的种)，它的缺失可能也会导致生物被膜产量的降低。因此，本实验选择耻垢分枝杆菌mc2155作为模拟菌，研究MSMEG935基因(Rv3915的同源基因)的缺失对细菌生物被膜产量的影响。之所以选择耻垢分枝杆菌作为模拟菌，是由于结核分枝杆菌的传染性和致病性，加之其生物被膜形成需要特定的条件且生长较慢;结核分枝杆菌Rv3915基因与耻垢分枝杆菌MSMEG935基因同源性高达77%，且MSMEG935基因同样能编码肽聚糖酰胺酶(种水解酶)。本研究首先构建了耻垢分枝杆菌MSMEG935基因缺失株和回复株。以耻垢分枝杆菌mc2155的基因组DNA和pUC4K质粒为模板，通过PCR的方法扩增出MSMEG935基因上下游同源臂和替换基因kan基因。在获得这三个片段后，通过融合PCR的方法将三个片段连接成个长片段，然后将其连接到pMD18-T载体上，获得克隆载体18-T-RH。随后，再将长片段连接到温敏型穿梭载体pPR27上，构建同源重组质粒pPR27-6935。同源重组质粒pPR27-6935被电转入耻垢分枝杆菌mc2155感受态中，经过抗性、温敏实验筛选得到突变株。突变株经过PCR、序列测序以及实时定量PCR的鉴定，证明MSMEG935基因缺失株mc2155-6935构建成功。同时，我们还构建了营救质粒pVV16-6935，通过再次同源重组获得了MSMEG935基因的回复株mc2155-hf-6935。在获得MSMEG935基因缺失株mc2155-6935和回复株mc2155-hf-6935后，我们验证了MSMEG935基因的缺失对耻垢分枝杆菌生物被膜产量的影响。在本部分试验中，我们首先检测了基因的缺失是否对细菌生长和细菌自溶有影响。结果表明，37℃培养下，缺失株、原始株以及回复株的生长趋势基本致，但是原始株和回复株细菌的自溶程度大于缺失株。接着我们通过试管、6孔板以及12孔板在相同条件培养原始株mc2155、缺失株mc2155-6935和回复株mc2155-hf-6935，段时间后，可以观察到mc2155和mc2155-hf-6935的产膜量高于mc2155-6935，而mc2155与mc2155-hf-6935的产膜量无明显差异。我们通过结晶紫和硝酸银染色再次证明缺失株mc2155-6935产膜量低于原始株mc2155和回复株mc2155-hf-6935(P0.05)。通过实验证明，MSMEG935基因的缺失会使耻垢分枝杆菌的产膜量降低。本研究结果表明，MSMEG935基因的敲除使耻垢分枝杆菌的产膜能力下降。这将为结核分枝杆菌相关基因的研究、新药物标靶的筛选以及抗结核疫苗的研究奠定基础。

关键词：耻垢分枝杆菌 MSMEG6935 基因敲除生物被膜

耻垢分枝杆菌WecA蛋白的表达及wecA基因敲除对耻垢分枝杆菌内其他蛋白的影响

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耻垢分枝杆菌WecA蛋白的表达及wecA基因敲除对耻垢分枝杆菌内其他...

作者：王日晨大连医科大学

学位级别：硕士

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是结核病的致病菌，全球大约有1/3人口携带过这种杆菌。近年来，由于几种药物长时间使用，使得结核杆菌出现耐多药甚至广泛耐药特性。因此迫切需要寻找抗结核药物的新靶点。耻垢分枝杆菌(My... 详细信息

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是结核病的致病菌，全球大约有1/3人口携带过这种杆菌。近年来，由于几种药物长时间使用，使得结核杆菌出现耐多药甚至广泛耐药特性。因此迫切需要寻找抗结核药物的新靶点。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和结核分枝杆菌同属于分枝杆菌属，而对于结核分枝杆菌细胞壁的研究，通常利用与结核分枝杆菌有相同细胞壁结构，但生长快速且无致病性的耻垢分枝杆菌mc2155菌株作为实验模型。分枝杆菌细胞壁具有其独特的结构，它的核心结构由三部分组成的，由外至内依次是分枝菌酸（mycolic acid）、聚阿拉伯半乳糖（arabinogalactan, AG）和肽聚糖（peptidoglycan, PG）。其中聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖之间是由L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺（L-rhamnose-D-N-acetyl-glucosamine）衔接双糖共价连接起来的。 L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺衔接双糖分子是维持分枝杆菌细胞壁结构稳定的重要成分，也是分枝杆菌生存的必要条件。L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺双糖衔接分子的合成通过两步反应实现的：第一步，UDP-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）在WecA酶（N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶）的作用下，将基团N-乙酰葡糖胺-1-磷酸（GlcNAc-1-P）转移到受体C50-P （Decaprenyl phosphate）上形成C50-P-P–GlcNAc。第二步，产物再作为受体在WbbL酶（鼠李糖基转移酶)的作用下，接受一个来自于dTDP-鼠李糖（dTDP-Rhamnose）提供的鼠李糖基，最终生成L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺双糖衔接分子。L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺衔接双糖分子的合成过程中WecA酶起到重要的催化作用，找到WecA酶的基因有利于我们找到抑制WecA酶合成的方法，从而抑制L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺衔接双糖分子的合成，最终影响分枝杆菌生长。本实验室的前期的研究已经发现MSMEG4947基因为耻垢分枝杆菌的WecA蛋白编码基因wecA，同时证明了wecA是分枝杆菌生长必需基因。综上，WecA蛋白很可能是一个抗分枝杆菌尤其是结核分枝杆菌的潜在靶点。目的： 1．使用PCR方法从耻垢分枝杆菌基因组中扩增出Sm wecA，构建pMD18-Sm wecA克隆载体;2.构建pET29b-Sm wecA表达载体，并在E. coli BL2（1DE3）、CD41（DE3）和ER2566菌株中诱导表达;3.利用高效液相色谱（HPLC）技术对WecA酶活性进行鉴定;4.利用双向电泳技术，对敲除wecA基因前后，耻垢分枝杆菌中蛋白的变化情况进行比对，来分析与WecA酶相关的蛋白。结果： 1．使用PCR方法从耻垢分枝杆菌基因组中扩增出Sm wecA，构建pMD18-Sm wecA克隆载体使用根据Sm wecA（MSMEG4947）基因核苷酸序列设计出的上下游引物，以M. smegmatis mc2155基因组为模板，使用LA Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，然后用QIAEXⅡGel Extraction Kit对得到的PCR产物进行回收和纯化，电泳鉴定。将pMD18T克隆质粒与Sm wecA基因片段连接后，构建的pMD18-Sm wecA克隆载体，选取NcoⅠ和BamHIII对pMD18-Sm wecA重组质粒酶切鉴定，选取电泳鉴定正确的pMD18-Sm wecA重组质粒送于宝生物工程大连公司进行核苷酸序列的测定。 2．构建pET29b-Sm wecA表达载体，并在E. coli BL21（DE3）、CD41（DE3）、ER2566菌株中诱导表达使用NdeⅠ和XhoⅠ的双酶切体系分别对pMD18-Sm wecA质粒和pET29b载体进行酶切，将Sm wecA基因片段和酶切后的线形pET29b载体片段连接，构建了pET29b-Sm wecA表达载体。用pET29b-Sm wecA表达载体转化E. coli BL21(DE3)、CD41（DE3）和ER2566菌株，在37℃下用终浓度1mM的IPTG诱导将上清、沉淀和总蛋白进行Dot blot，SDS-PAGE和Western blot分析。在25℃条件下用终浓度1mM的IPTG诱导pET29b-Sm wecA/ER2566生长16h。超声破碎细胞后，把离心后的上清液再超速离心制备膜组分，然后用去污剂DDM（n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）处理，得到蛋白样品后进行Western blot分析。 3．利用高效液相色谱（HPLC）技术对WecA酶活性进行鉴定使用镍层析柱纯化WecA蛋白。建立反应体系，在反应底物UDP-GlcNAc和C50-P混合液中加入纯化的WecA蛋白共同孵育30min后，使用氯仿/甲醇/氨水萃取反应产物，使用含反应产物的水相进行HPL

关键词：耻垢分枝杆菌 L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺衔接双糖 WecA(N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶) 膜蛋白

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耻垢分枝杆菌应答H2O2的分子机制

耻垢分枝杆菌应答H2O2的分子机制

作者：韩娇四川农业大学

学位级别：硕士

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)是引起传染性结核病(TB)的病原菌,结核病是世界性的公共卫生疾病,我国每年有上百万新发病例。人体感染结核分枝杆菌后是否发病及发病后病情转归取决于结核分枝杆菌和宿主细胞的相互作用... 详细信息

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)是引起传染性结核病(TB)的病原菌,结核病是世界性的公共卫生疾病,我国每年有上百万新发病例。人体感染结核分枝杆菌后是否发病及发病后病情转归取决于结核分枝杆菌和宿主细胞的相互作用,先天免疫是宿主对抗病原菌入侵的第一道防线,其中由巨噬细胞产生的活性氧(ROS)是宿主先天免疫的重要组成部分。ROS主要包括由巨噬细胞膜上的NADPH巨噬细胞氧化酶(phox)能以O2为底物反应生成的02-·,02-·在超氧化物歧化酶(SOD)作用下生成的H2O2, H2O2在过氧化物酶作用下生成的HO。 phox产生的ROS对抑制结核分枝杆菌在宿主细胞内的繁殖在临床上有重要意义。当人类编码NADPH巨噬细胞氧化酶几个亚基的基因发生突变或缺失时就会患上慢性肉芽肿疾病(CGD),这种患者对结核分枝杆菌非常敏感,一旦被感染便很容易死亡。当侵入巨噬细胞内的结核分枝杆菌以各种途径消除ROS对其影响时,巨噬细胞对结核分枝杆菌的损伤会大大减弱。这种状态下的结核分枝杆菌可诱导巨噬细胞发生坏死而在人体里扩散,因此研究结核分枝杆菌应答H202机制对结核病的治疗意义重大。由于结核分枝杆菌的操作需要特殊的实验室,并且其生长速度十分缓慢,目前对结核分枝杆菌的一些基本生物功能的研究也会利用结核分枝杆菌的模式菌耻垢分枝杆菌为研究对象。本课题利用耻垢分枝杆菌,系统的研究了其对H202的应答机制。耻垢分枝杆菌mc2155对H202的最小抑菌浓度(MIC)为0.039mM,本实验以mc2155为研究对象,利用定向筛选方法获得一株对H202极度耐受菌株mc251,其对H202的MIC为3.125mM,约为mc2155的80倍。在对数生长前期用7mMH2O2处理3h后,mc251仍能正常生长,mc2155裂解死亡。对数生长前期,mc251胞内的过氧化氢酶与过氧化物酶活性均比mc2155强。基于高通量测序的基因表达谱分析对阐明细胞在该条件下与环境相互作用的机制有重要价值,为了系统分析mc251与mc2155在对数生长前期对H202应答差异,揭示mc251耐H202机制,并为研究结核分枝杆菌耐H202机制作铺垫,我们对对数生长前期两株菌的基因表达谱进行了分析。分析结果显示,mc251应答H202的一种机制是由MSMEG3461在mc251胞内大量表达引起的,而mc251应答H202的另一机制是通过降低胞内核糖体蛋白合成水平实现的。

关键词：结核分枝杆菌耻垢分枝杆菌活性氧 RNA测序基因转录谱

转录因子Ms6174的广泛调控功能鉴定及其调控耻垢分枝杆菌生物被膜形成的机理研究

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转录因子Ms6174的广泛调控功能鉴定及其调控耻垢分枝杆菌生物被膜...

作者：王瑞广西大学

学位级别：硕士

分枝杆菌是一大类细胞壁中富含脂质的革兰氏阳性细菌,其中最为知名的是引起人类结核病的结核分枝杆菌与其模式菌株耻垢分枝杆菌等。细菌生物被膜是由胞外基质如脂质、多糖、DNA和蛋白质等包裹的细菌群体,它的形成对病原细菌的抗逆性和... 详细信息

分枝杆菌是一大类细胞壁中富含脂质的革兰氏阳性细菌,其中最为知名的是引起人类结核病的结核分枝杆菌与其模式菌株耻垢分枝杆菌等。细菌生物被膜是由胞外基质如脂质、多糖、DNA和蛋白质等包裹的细菌群体,它的形成对病原细菌的抗逆性和致病性等具有重要的影响。分枝杆菌生物被膜的形成与其细胞壁脂质成分密切相关。然而,目前关于分枝杆菌细胞壁脂质代谢影响细菌生物被膜形成的调控机理还很不清楚,相关的调控因子还知之甚少。本论文以结核分枝杆菌模式菌株耻垢分枝杆菌为研究对象,鉴定了一个广泛调控功能的转录因子Ms6174,且其具有拟核结合蛋白的特性,同时还发现Ms6174通过调控多个脂质代谢相关基因的表达进而负调控分枝杆菌生物被膜的形成。具体取得的研究结果如下:(1)研究前期我们利用耻垢分枝杆菌转座插入突变体文库筛选并鉴定到转录因子的编码基因ms6174影响细菌的菌落表面形态。通过克隆、蛋白质表达与纯化获得了转录因子Ms6174的蛋白质。随后,利用凝胶阻滞迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测到Ms6174直接结合自身所在基因簇的启动子,具有自调控能力。进一步,构建了耻垢分枝杆菌ms6174的敲除菌株,运用β-半乳糖苷酶活性实验发现Ms6174负调控其自身所在基因簇的表达。(2)利用EMSA实验、DNaseⅠ酶切实验以及蛋白质与染色质DNA荧光共定位等实验发现Ms6174具有拟核结合蛋白的性质,即Ms6174是耻垢分枝杆菌中新的拟核结合蛋白。(3)通过转录组测序分析发现,相较于耻垢分枝杆菌野生型菌株,ms6174敲除菌株中有682个基因的表达水平发生了显著变化,其中有387个基因上调表达,295个基因下调表达,142个脂质代谢相关基因的表达水平发生变化。以上的结果说明Ms6174是一个广泛调控因子,可调控多个分枝杆菌脂质代谢基因的表达。(4)检测并比较了耻垢分枝杆菌ms6174敲除菌株与野生型菌株的菌落形态与生物被膜形成的差异,发现敲除ms6174后,耻垢分枝杆菌的菌落表面褶皱与气液表面生物被膜增多。由此可知,转录因子Ms6174负调控耻垢分枝杆菌生物被膜的形成。综上所述,本研究发现了耻垢分枝杆菌中一个广泛调控功能的转录因子Ms6174。首先,鉴定了转录因子Ms6174的自调控功能,并发现其具有拟核结合蛋白的特性。其次,通过转录组学分析发现了Ms6174具有广泛调控功能。最后,发现Ms6174负调控分枝杆菌生物被膜的形成,并推测其通过调控脂质代谢相关基因的表达进而调控细菌生物被膜的形成。研究结果为分枝杆菌的拟核结合蛋白家族增加了新成员,并加深了我们对分枝杆菌生物被膜形成调控机理的认识。

关键词：耻垢分枝杆菌转录调控拟核结合蛋白脂质代谢生物被膜