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水杨酸钠对大鼠耳蜗螺旋神经节神经元的毒性研究:多巴胺受体介导NMDA受体与GABA_A受体的表达

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生理学报 2017年第3期69卷 285-290页

作者：韦廷佳陈慧英黄喜翁敬锦覃江圆苏纪平广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科南宁530021

本研究旨在观察多巴胺受体(dopamine receptor,DR)是否参与水杨酸钠(sodium salicylate,SS)对大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron,SGN)N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)和A型γ-氨基丁酸受体(γ-aminobutyric acid type A receptor,GABA_AR)亚单位蛋白表达的作用。原代培养大鼠SGN,用免疫荧光技术检测SGN上第一家族多巴胺受体(DR1)和第二家族多巴胺受体(DR2)的表达;分别用5 mmol/L SS、SS+DR1拮抗剂(SCH23390,20μmol/L)和SS+DR2拮抗剂(Eticlopride,20μmol/L)处理SGN后,用Western blot检测NMDA受体NR1亚单位、GABA_A受体α2亚单位(GABA_A receptor subunitα2,GABRα2)蛋白的表达。结果显示,SGN的胞体与突起均有DR1、DR2表达;SS可下调GABRα2和NR1的膜蛋白表达,但不影响二者的总蛋白表达;SCH23390和Eticlopride均能逆转SS对GABRα2和NR1膜蛋白表达的下调作用。以上结果提示,SS可影响SGN表面GABA_AR和NMDAR的转运,其作用机制涉及DR的介导作用。

关键词：水杨酸钠耳蜗螺旋神经节神经元多巴胺受体 N-甲基-D-天冬氨酸受体 A型γ-氨基丁酸受体

水杨酸钠影响耳蜗螺旋神经节神经元GABAa受体亚单位的表达

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临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2015年第11期29卷 1024-1029页

作者：姚晨蔡正王仁君陈慧英黄志辉覃继新苏纪平广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科南宁530021 右江民族医学院附属医院耳鼻咽喉科

目的:观察大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)中GABAa受体亚单位的基因表达水平,探讨水杨酸钠对SGN的GABAa受体亚单位表达的影响。方法:应用实时荧光定量PCR技术,检测新生SD大鼠SGN和大脑皮层GABAa受体12个亚单位的表达;观察水杨酸钠5mmol/... 详细信息

目的:观察大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)中GABAa受体亚单位的基因表达水平,探讨水杨酸钠对SGN的GABAa受体亚单位表达的影响。方法:应用实时荧光定量PCR技术,检测新生SD大鼠SGN和大脑皮层GABAa受体12个亚单位的表达;观察水杨酸钠5mmol/L处理15min、30min、1h、3h和6h后的不同时间段原代培养SGN的GABAa受体亚单位的表达。结果:1SGN有GABAa受体α1-6、β1-3、γ1-3亚单位的表达,各亚单位的表达量均低于大脑皮层(Pα3/α5>α4>α1>α6,α3和α5表达量差异无统计学意义(P>0.05);β亚单位族表达量:β3>β2>β;γ亚单位族表达量:γ1>γ2>γ3。2水杨酸钠作用后,除α5外,各时间点亚单位表达量都有明显变化。其中15min时α1、α2、β1、γ1-3表达量升高,而α3表达量降低(P<0.05);30min时,α3、β1、β3表达量升高,而γ1表达量降低(P<0.05);1h时,β2表达量升高而γ3表达降低(P<0.05);3h时,β1、β2表达量升高,而α3、γ2表达量降低(P<0.05);6h时,α1、α3、β2、β3、γ1表达量升高,而α2、α4、β1表达量降低(P<0.05)。结论:大鼠SGN上有GABAa受体α1-6、β1-3、γ1-3的表达,其亚单位的表达量均低于大脑皮层。水杨酸钠可导致SGN的GABAa受体亚单位表达量改变,在最早期(15min)时,大部分亚单位表达为明显升高,其后在正常值上下低水平波动。

关键词：水杨酸钠 GABAa受体耳蜗螺旋神经节神经元实时荧光定量PCR

AMPA受体在新生大鼠耳蜗螺旋神经节神经元兴奋毒性中的表达

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听力学及言语疾病杂志 2020年第4期28卷 413-418页

作者：叶文华陈慧英韦芳玉林晓宇刘金兰易健启叶莞丽苏纪平广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科广西530021

目的观察水杨酸钠(sodium salicylate, SS)作用新生SD大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron, SGN)后,SGN中α-氨-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors, AMPAR)在分子水平的表达改变。方法实验动物为10只新生3天的SD大鼠,分为免疫荧光染色组、正常对照组、水杨酸钠组、AMPAR激动剂组及AMPAR拮抗剂组,每组2只大鼠;采用免疫荧光染色技术检测各组大鼠SGN中AMPA受体GluA2的表达;采用FQ-PCR技术检测SGN和大脑皮层神经元中AMPAR各亚单位mRNA的表达;采用Western Blot技术检测SGN中GluA2的蛋白表达。结果免疫荧光染色显示,新生SD大鼠SGN胞体和轴突上均有AMPA受体GluA2的表达。FQ-PCR发现,①SGN及大脑皮层神经元中均有AMPAR亚单位GluA1、GluA2、GluA3和GluA4的表达(简称A1、A2、A3、A4),其中SGN中AMPAR各亚单位之间表达量呈A3>A2,A3>A4,A2和A4>A1。在大脑皮层神经元中,AMPAR各亚单位之间表达量呈A2>A3>A1>A4。②0.5 mM SS作用SGN后与正常对照组比较,只有A2在30 min时表达量明显降低(P0.05)。结论①新生SD大鼠SGN及大脑皮层神经元中均有AMPAR表达,AMPAR各亚基在SGN及大脑皮层神经元中表达量高低变化呈不同规律。②水杨酸钠致SGN兴奋毒性中,与正常对照组比较,AMPAR的A2、A3和A4 mRNA表达量均显著降低,A2膜蛋白表达量亦明显下降;推测在水杨酸钠致SGN兴奋毒性中,水杨酸钠能促进A2膜蛋白表达量下调,促进AMPAR发生内化。

关键词：新生大鼠水杨酸钠耳蜗螺旋神经节神经元兴奋毒性 α-氨-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体

水杨酸钠通过DA受体影响耳蜗螺旋神经节神经元NMDA受体与GABAa受体亚单位的表达

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临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2017年第20期31卷 1593-1598页

作者：黄喜陈慧英韦廷佳覃丹雪刘佩强叶文华苏纪平广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科南宁530021 钦州市第二人民医院耳鼻咽喉头颈外科

目的:观察水杨酸钠(SS)对大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)的多巴胺受体(DR)亚型表达的影响,以及观察SS作用下,DR对SGN的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体和γ-氨基丁酸(GABA)a受体亚单位的影响,探讨SS介导的受体之间的相互作用。方法:应用免... 详细信息

目的:观察水杨酸钠(SS)对大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)的多巴胺受体(DR)亚型表达的影响,以及观察SS作用下,DR对SGN的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体和γ-氨基丁酸(GABA)a受体亚单位的影响,探讨SS介导的受体之间的相互作用。方法:应用免疫荧光技术,检测新生SD大鼠SGN中DR两家族DR1、DR2的表达;应用RT-PCR技术,检测SS处理后的SGN中DR1和DR2亚型的mRNA变化,观察在激活和抑制DR活动时SS对SGN的NMDA受体亚单位NR1、GABAa受体亚单位GABRα2的mRNA表达的影响。结果:免疫荧光显示:在SGN的胞体与突起均有DR1、DR2的免疫荧光显示。RT-PCR结果显示:(1)SGN有DR亚型(DRd1~DRd5)、GABRα2、NR1的表达;(2)5mmol/L SS作用SGN 30min后,除DRd3外,其余DR亚型及GABRα2、NR1的mRNA表达量均明显升高,其中DRd1表达增加34.64%(t=-5.123,P=0.007);DRd2表达增加34.60%(t=-5.206,P=0.006);DRd4表达增加20.87%(t=-3.337,P=0.029);DRd5表达增加26.42%(t=-6.054,P=0.004);GABRα2表达增加30.41%(t=-2.839,P=0.047);NR1表达增加39.22%(t=-6.243,P=0.003);(3)SS分别与多巴胺(100μmol/L)、DR1激动剂(SKF38393,20μmol/L)、DR2激动剂(Quinpirole,20μmol/L)分别作用SGN 30min后,GABRα2、NR1的mRNA表达量均明显升高,其中,GABRα2表达分别增加21.78%、27.45%、33.02%、33.42%(F=12.399,P=0.001),NR1表达分别增加28.70%、26.82%、29.03%、35.05%(F=50.395,P=0.000);(4)SS+DR1拮抗剂(SCH23390,20μmol/L)、SS+DR2拮抗剂(Eticlopride,20μmol/L)分别作用SGN 30min后,与单独SS作用相比,GABRα2的mRNA表达分别减少29.56%、37.10%(F=22.101,P=0.000),NR1的mRNA表达分别减少37.62%、32.83%(F=72.933,P=0.000)。结论:SS可诱导SGN的大部分DR亚型的mRNA表达明显升高;SS可能通过DR影响SGN上GABAaR、NMDAR的mRNA表达。

关键词：水杨酸钠耳蜗螺旋神经节神经元多巴胺受体 N-甲基-D-天冬氨酸受体 A型γ-氨基丁酸受体

补肾活血化痰开窍方对耳鸣大鼠耳蜗螺旋神经节神经元5-HT1B、2C受体表达的影响

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听力学及言语疾病杂志 2018年第4期26卷 414-418页

作者：孙勤国罗蒙江波郭乃燕张贤梅徐鸿婕牟艳杰吕琨杨倩武汉大学附属同仁医院(武汉市第三医院)中医科武汉430060 湖北中医药大学

目的探讨补肾活血化痰开窍方对耳鸣大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons,SGN)中5羟色胺(serotonin,5-HT)1B、2C受体的表达及意义。方法 60只健康SPF级雄性大鼠随机分为正常组10只(生理盐水组),耳鸣模型组50只(采用水杨酸... 详细信息

目的探讨补肾活血化痰开窍方对耳鸣大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons,SGN)中5羟色胺(serotonin,5-HT)1B、2C受体的表达及意义。方法 60只健康SPF级雄性大鼠随机分为正常组10只(生理盐水组),耳鸣模型组50只(采用水杨酸钠腹腔注射联合"饮水抑制"大鼠行为学实验方法建立大鼠耳鸣模型),耳鸣模型组造模成功后再分为水杨酸钠组10只、中药组30只(补肾活血化痰开窍方低、中、高剂量组各10只)、西药组(卡马西平组)10只,除水杨酸钠组给予生理盐水灌胃外,各组给予相应药物干预8周,造模成功后运用免疫组化法检测各组耳蜗SGN中5-HT1B、2C受体的表达。结果耳鸣造模成功并给予相应药物干预8周后,各组大鼠耳蜗SGN中均有5-HT1B、2C受体的表达,与生理盐水组相比,水杨酸钠组中5-HT1B表达减少,5-HT2C表达明显增多;与水杨酸钠组相比,中药各剂量组耳蜗SGN中5-HT1B表达增多,2C表达均明显降低。结论耳鸣大鼠耳蜗SGN中的5-HT1B受体表达减少、5-HT2C表达增加,应用补肾活血化痰开窍方后5-HT1B表达增多而5H2C表达降低,产生了拮抗作用,该方可能应用于耳鸣的治疗。

关键词：补肾活血化痰开窍方耳蜗螺旋神经节神经元 5羟色胺1B、2C受体耳鸣

顺铂通过Cav1.2诱导耳蜗螺旋神经节神经元凋亡的研究

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顺铂通过Cav1.2诱导耳蜗螺旋神经节神经元凋亡的研究

作者：马靖雯石河子大学

学位级别：硕士

目的:顺铂是临床上常用的治疗癌症的广谱类药物,但是它引起的耳毒性作用目前没有预防或治疗的有效措施。耳蜗螺旋神经节神经元(Spiral ganglion Neurons,SGNs)是声音信息传递至中枢神经系统的重要枢纽,同时也是顺铂诱导感音神经性听力... 详细信息

目的:顺铂是临床上常用的治疗癌症的广谱类药物,但是它引起的耳毒性作用目前没有预防或治疗的有效措施。耳蜗螺旋神经节神经元(Spiral ganglion Neurons,SGNs)是声音信息传递至中枢神经系统的重要枢纽,同时也是顺铂诱导感音神经性听力损失的重要区域之一。本实验用C57/6J小鼠通过腹腔注射的方式建立顺铂耳毒性模型,观察顺铂诱导C57BL/6J小鼠耳蜗螺旋神经节神经元凋亡与Cav1.2的关系,并探讨Cav1.2是否是是顺铂诱导耳蜗螺旋神经节神经元凋亡的靶点。方法:动物实验:选取8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为对照组(Control);顺铂给药1周期组(Cycle 1)、顺铂给药2周期组(Cycle 2)、顺铂给药3周期组(Cycle 3)。听性脑干反应(Auditory brainstem response,ABR)检测各组小鼠听力阈值变化;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)以及丙二醛(Malonaldehyde,MDA)试剂盒检测各分组耳蜗组织的SOD活性和MDA含量;苏木精-伊红HE染色观察各组小鼠耳蜗螺旋神经节形态学变化;TUNEL染色检测各组耳蜗螺旋神经节凋亡情况;免疫荧光观察Cav1.2与Caspase-3的分布与表达。原代培养螺旋神经节神经元并将细胞实验分为五组:对照组(Control)、溶剂组(DMSO)、Cav1.2阻断剂组(N)、顺铂组(Cisplatin)、顺铂与Cav1.2阻断剂共同孵育组(Cisplatin+N)。Hoechst33342染色观察各组凋亡情况,流式细胞术检测各组凋亡率,Western Blotting检测Cav1.2蛋白表达以及相关凋亡蛋白的表达,钙离子探针检测细胞内钙离子浓度变化,JC-1检测膜电位变化,Mito SOX检测线粒体释放ROS情况。结果:1.动物实验:(1)ABR检测结果显示:Cycle 2组与Cycle 3组的听力阈值明显升高(P耳蜗组织SOD活性以及MDA含量检测结果显示:Cycle 2组与Cycle 3组检测耳蜗组织SOD活性均降低(P耳蜗SGNs凋亡率均升高(P<0.05,P<0.01,n=4)。(5)免疫组化结果显示:Cycle 2组与Cycle 3组小鼠SGNs上Caspase-3表达明显增加(P<0.01,n=4),Cycle 3组Cav1.2表达明显升高(P<0.01,n=4);2.细胞实验:(1)通过CCK8选择5μmol/ml培养12h用于后续实验的干预;(2)Western blot结果显示:顺铂上调SGNs中Cav1.2蛋白表达(P<0.05,n=3);(3)Hoechst33342染色与流式细胞术结果显示:顺铂干预明显上调SGNs凋亡率(P<0.01,n=3),而加入Cav1.2阻断剂降低了SGNs凋亡率(P<0.05,n=3);(4)Western blotting结果显示:顺铂上调SGNs中促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平(P<0.01,P<0.001,n=3),下调抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平(P<0.01,n=3),加入Cav1.2阻断剂Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平降低(P<0.05,n=3),Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05,n=3);(5)钙探针结果显示:顺铂上调SGNs胞内钙离子浓度(P<0.01,n=3),加入Cav1.2阻断剂后胞内钙离子浓度减小(P<0.05,n=3);(6)Mito SOX结果显示:顺铂上调SGNs线粒体ROS释放(P<0.001,n=3),Cav1.2阻断剂下调SGNs线粒体ROS释放(P<0.05,n=3);(7)JC-1结果显示:顺铂明显下调SGNs线粒体膜电位(P<0.01,n=3),加入Cav1.2阻断剂后SGNs线粒体膜电位升高(P<0.05,n=3)。结论:顺铂可能通过上调Cav1.2促进钙内流,进而使线粒体ROS增多,引起SGNs氧化应激损伤从而诱导线粒体途径的细胞凋亡。

关键词：顺铂 Cav1.2 耳蜗螺旋神经节神经元凋亡

补肾活血化痰开窍方对耳鸣大鼠耳蜗螺旋神经节神经元NMDA受体亚型表达的影响

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广州中医药大学学报 2018年第1期35卷 129-134页

作者：孙勤国罗蒙江波张贤梅徐鸿婕牟艳杰吕琨杨倩武汉大学附属同仁医院/武汉市第三医院湖北武汉430060 湖北中医药大学湖北武汉430060

【目的】观察补肾活血化痰开窍方对耳鸣大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚型1、2A、2B(NR1、NR2A、NR2B)表达的影响,并探讨其作用机制,以期为临床应用补肾活血化痰开窍方治疗耳鸣提供实验依据。【方法】将6... 详细信息

【目的】观察补肾活血化痰开窍方对耳鸣大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚型1、2A、2B(NR1、NR2A、NR2B)表达的影响,并探讨其作用机制,以期为临床应用补肾活血化痰开窍方治疗耳鸣提供实验依据。【方法】将60只大鼠随机分为正常组,模型组,中药低、中、高剂量组,西药组6组,每组10只。采用大鼠腹腔注射水杨酸钠联合"饮水抑制"法建立大鼠耳鸣模型。造模成功后,中药低、中、高剂量组给予补肾活血化痰开窍方(剂量分别为5.5、11、22 g·kg-1·d-1)灌胃,西药组给予卡马西平(剂量为5 mg·kg-1·d-1)灌胃,模型组和正常组给予2 m L生理盐水灌胃,每天1次,连续治疗8周。采用免疫印迹法和实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测其耳蜗SGN中NR1、NR2A、NR2B在耳鸣大鼠的表达情况。【结果】与正常组比较,模型组NR1、NR2A、NR2B在模型组中表达升高,差异具有统计学意义(均P耳蜗SGN中NR1、NR2A、NR2B的表达均明显降低(均P耳蜗SGN中增高的NMDA受体亚型NR1、NR2A、NR2B表达有关。

关键词：补肾活血化痰开窍方耳蜗螺旋神经节神经元 NMDA NR1 NR2A NR2B 耳鸣疾病模型动物大鼠

水杨酸钠增强氧化应激介导耳蜗螺旋神经节神经元损伤作用的实验观察

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中国临床新医学 2023年第5期16卷 447-451页

作者：祝小婷黄佳琳林晓宇苏纪平广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科广西区域性高发肿瘤早期防治研究重点实验室南宁530021

目的观察水杨酸钠(SS)作用大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)后,SGN中氧化应激水平的变化。方法将6只SD大鼠随机分为对照组和SS组,每组3只。通过耳蜗器官培养48 h后,用5 mM SS处理48 h,对照组不予处理,采用免疫荧光染色技术定位耳蜗器官中... 详细信息

目的观察水杨酸钠(SS)作用大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)后,SGN中氧化应激水平的变化。方法将6只SD大鼠随机分为对照组和SS组,每组3只。通过耳蜗器官培养48 h后,用5 mM SS处理48 h,对照组不予处理,采用免疫荧光染色技术定位耳蜗器官中活性氧自由基(ROS)的主要生成位置。将15只SD大鼠随机分成5组,即对照组、SS组、SS+N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)组、阳性对照过氧化氢(H_(2)O_(2))组、H_(2)O_(2)+NAC组,每组3只。通过急性分离SGN,原代培养48 h后分别用5 mM SS、5 mM SS联合100μM NAC、300μM H_(2)O_(2)、300μM H_(2)O_(2)联合100μM NAC处理48 h,对照组不予处理。采用荧光染色法检测并量化各组大鼠SGN中ROS荧光探针DCFH-DA的平均荧光强度;采用CCK8法检测SGN细胞存活率。结果在耳蜗器官培养中,SS作用后,免疫荧光染色显示ROS荧光增强,并且主要在SGN中表达,而在其他细胞中荧光强度无明显变化。为进一步量化荧光强度,在原代培养SGN中加入5 mM SS处理后,荧光染色法显示ROS平均荧光强度较对照组升高(P0.05)。H_(2)O_(2)组细胞存活率较对照组下降52.31%(P<0.001),在加入NAC之后,细胞存活率较H_(2)O_(2)组上升34.73%(P<0.01)。结论SS增强SGN的氧化应激,并且导致了SGN损伤。氧化应激抑制剂NAC可以降低SGN的氧化应激,并且对SS致SGN损伤具有保护作用。

关键词：水杨酸钠耳蜗螺旋神经节神经元氧化应激免疫荧光耳蜗培养

实时荧光定量PCR检测大鼠耳蜗螺旋神经节神经元NMDA受体亚单位的基因表达

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山东医学高等专科学校学报 2011年第3期33卷 161-164页

作者：房秀友唐小兰邓俐莉苏纪平广西医科大学第一附属医院广西南宁530021

目的了解大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)中NMDA受体亚单位的基因表达水平,为进一步探讨SGN中NMDA受体的功能提供依据。方法利用倍比稀释的出生3 d的大鼠正常脑组织CDNA构建NMDA受体亚单位NR1、NR2(A～D),NR3(A～B)与甘油醛-3磷-酸脱氢酶... 详细信息

目的了解大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)中NMDA受体亚单位的基因表达水平,为进一步探讨SGN中NMDA受体的功能提供依据。方法利用倍比稀释的出生3 d的大鼠正常脑组织CDNA构建NMDA受体亚单位NR1、NR2(A～D),NR3(A～B)与甘油醛-3磷-酸脱氢酶(GAP-DH)基因的相对标准曲线,通过实验验证NR1、NR2(A～D),NR3(A～B)分别和内参基因GAPDH是否有一致的扩增效率,应用△Ct法对NMDA受体各亚单位的表达进行相对定量。结果 NMDA受体亚单位中由高到低依次为NR2B、NR3A、NR1、NR2D、NR3B、R2A、NR2C;除NR2D与NR3B外,其余各亚单位之间比较均有统计学意义(P耳蜗SGN中的表达水平。

关键词：耳蜗螺旋神经节神经元 NMDA受体实时荧光定量PCR