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中华微生物学和免疫学杂志 2003年第10期23卷 811-813页

作者：李金明宋如俊王露楠邓巍卫生部北京医院北京卫生部临床检验中心100730

目的　构建可以表达耐核糖核酸酶 (RNase)的内含HCVRNA病毒样颗粒的载体质粒。方法　将表达载体pINCCL用HindⅢ酶切后 ,与用相同内切酶酶切的HCVRNA非编码区 (5′ UTR)扩增产物 ,在T4DNA连接酶的存在下连接 ,构建一新的表达载体pINCCL H... 详细信息

目的　构建可以表达耐核糖核酸酶 (RNase)的内含HCVRNA病毒样颗粒的载体质粒。方法　将表达载体pINCCL用HindⅢ酶切后 ,与用相同内切酶酶切的HCVRNA非编码区 (5′ UTR)扩增产物 ,在T4DNA连接酶的存在下连接 ,构建一新的表达载体pINCCL HCVRNA 5′ UTR ,再转化BL2 1 DE3E .coli进行原核表达。结果　成功构建得到了新的表达载体pINCCL HCVRNA 5′ UTR ,经原核表达为耐RNase的内含HCVRNA病毒样颗粒。结论　得到的pINCCL HCVRNA 5′ UTR表达载体及原核表达系统 ,可作为一个耐RNase的HCVRNA标准品和质控品的构建和制备表达载体平台。

关键词：耐核糖核酸酶 HCV RNA病毒样颗粒丙型肝炎病毒基因表达

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含人甲胎蛋白mRNA部分序列的耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达

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中华肝脏病杂志 2005年第4期13卷 304-306页

作者：彭建明李金明徐克前王忠芳王露楠邓巍中南大学医学技术与情报学院长沙410013 卫生部北京医院卫生部临床检验中心

原发性肝癌为一种严重威胁人们健康的恶性肿瘤.甲胎蛋白(AFP)mRNA在监测原发性肝癌的肝外转移以及术后复发方面是一个很好的标志物,也可用于肝癌治疗效果的评价.通常AFP mRNA的检测方法为逆转录巢式聚合酶链反应(RT-PCR)法进行定性检测... 详细信息

原发性肝癌为一种严重威胁人们健康的恶性肿瘤.甲胎蛋白(AFP)mRNA在监测原发性肝癌的肝外转移以及术后复发方面是一个很好的标志物,也可用于肝癌治疗效果的评价.通常AFP mRNA的检测方法为逆转录巢式聚合酶链反应(RT-PCR)法进行定性检测,或利用凝胶电泳扫描的方法进行半定量检测.近来随着实时荧光PCR技术的发展使得准确定量检测AFP mRNA成为可能.

关键词：甲胎蛋白 mRNA 耐核糖核酸酶病毒样颗粒构建表达细菌噬菌体原发性肝癌

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内含NDV核酸的耐核糖核酸酶病毒样颗粒作为荧光定量RT-PCR内标的制备与鉴定

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畜牧与兽医 2017年第6期49卷 120-124页

作者：程帮照杨金兵卢运战诸亚平赵宏波刘鹏义宣城市畜牧兽医局安徽宣城242000 宣州区畜牧兽医管理局安徽宣城242000 安徽华卫集团禽业有限公司安徽宣城242000

为制备检测新城疫病毒的实时荧光RT-PCR病毒样颗粒内标,扩增MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白序列,将其定向插入pET32a载体的相应位置,双酶切和PCR鉴定,构建pET32a-MS2重组质粒;根据新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测的目标片段,采用化学合... 详细信息

为制备检测新城疫病毒的实时荧光RT-PCR病毒样颗粒内标,扩增MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白序列,将其定向插入pET32a载体的相应位置,双酶切和PCR鉴定,构建pET32a-MS2重组质粒;根据新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测的目标片段,采用化学合成和klenow酶连接技术制备内标片段,将内标片段插入pET32a-MS2重组质粒,构建pET32a-MS2-IC重组质粒,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,经RNase和DNase消化后,采用荧光RT-PCR检测耐核糖核酸酶病毒样颗粒内标的含量。结果表明,制备了高表达量耐核糖核酸酶病毒样颗粒内标,可用于新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立。

关键词：新城疫耐核糖核酸酶病毒样颗粒 MS2噬菌体荧光RT-PCR

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装甲RNA病毒样颗粒的制备及其在荧光PCR检测禽流感病毒中的应用

装甲RNA病毒样颗粒的制备及其在荧光PCR检测禽流感病毒中的应用

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作者：窦敏厦门大学

学位级别：硕士

Armored RNA技术是近几年发展起来的一种新的RNA质控品的制备技术。该技术的原理就是利用基因工程方法将包含有大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白基因的序列及外源片段克隆到表达载体中,这一载体能够将外源克隆片段转录成重组RNA,并利用载体... 详细信息

Armored RNA技术是近几年发展起来的一种新的RNA质控品的制备技术。该技术的原理就是利用基因工程方法将包含有大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白基因的序列及外源片段克隆到表达载体中,这一载体能够将外源克隆片段转录成重组RNA,并利用载体上MS2的外壳蛋白基因合成的外壳蛋白将其装配成球状RNA病毒结构的RNA-蛋白质复合体,我们称之为RNA病毒样颗粒。目前Armored RNA技术正逐渐应用于RNA病毒的检测方面。首先,根据Armored RNA技术的原理,构建了能表达耐核糖核酸酶病毒样颗粒的载体,选取口蹄疫病毒IRES RNA片断为内标检测基因,克隆到表达载体噬菌体基因的下游,最终得到能够表达病毒样颗粒的原核表达载体,转化大肠杆菌进行诱导表达。通过对表达产物的双酶消化实验进行初步确认。提取表达产物的RNA进行反转录PCR,可以确定表达产物是含口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒。蔗糖密度梯度离心纯化表达产物,透射电镜观察其形态。一系列的实验结果表明,本研究制备得到的病毒样颗粒为含口蹄疫病毒IRES RNA,直径约为26nm的圆形颗粒。该病毒样颗粒具有耐核糖核酸酶的特性,稳定性良好,易保存。其次,通过设计荧光双链探针对病毒样颗粒RNA进行一步法反转录实时荧光PCR检测。我们以IRES为检测靶序列,系统优化了检测病毒样颗粒RNA的反应体系和反应条件。结果表明,在最优的检测条件下,荧光双链探针可以在2h内通过一步法反转录荧光PCR检测出病毒样颗粒外壳蛋白包裹的IRES RNA。最后本研究通过优化反应体系,以病毒样颗粒为内标,对禽流感病毒进行实时荧光PCR检测。实验结果说明,实时荧光PCR可以迅速准确的检测禽流感病毒,同时由于内标的存在,也避免了在整个病毒检测过程中抑制因子的存在或者人为误差等因素造成的假阴性结果。本研究制备的含有口蹄疫病毒IRES RNA的病毒样颗粒,通过对其进行的一系列鉴定实验和应用于禽流感病毒检测的实验,可以看出该病毒样颗粒具有与RNA病毒相似的结构,即都是蛋白外壳包裹核酸的蛋白-RNA复合体,所以可以把该病毒样颗粒与其它病毒一起经历核酸提取、反转录和PCR扩增检测,从而对RNA病毒的检测进行全程监控,避免了假阴性结果的出现。该病毒样颗粒具有耐核糖核酸酶的特性,并且稳定性好、易于储存、安全可靠。因此本研究所制备的病毒样颗粒为以后RNA病毒的检测提供了一个良好的平台。

关键词： Armored RNA技术病毒样颗粒耐核糖核酸酶禽流感病毒

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