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禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译起始调控的初步研究

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禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译起始调控的初步研究

作者：刘琳中南民族大学

学位级别：硕士

为了研究禽类多瘤病毒(Avian polyomavirus,APV)晚期基因多顺反子翻译起始调控机制,Agno-1a前导蛋白对下游VPs蛋白合成的调控机制的影响作用。设计构建一系列新型cDNA重组病毒,在agno-1a mRNA编码序列的ATG区域,设计插入一个和插入两个... 详细信息

为了研究禽类多瘤病毒(Avian polyomavirus,APV)晚期基因多顺反子翻译起始调控机制,Agno-1a前导蛋白对下游VPs蛋白合成的调控机制的影响作用。设计构建一系列新型cDNA重组病毒,在agno-1a mRNA编码序列的ATG区域,设计插入一个和插入两个含有ATG的最佳翻译起始信号的7个氨基酸in-frame片段。在agno-1a编码mRNA序列的ATG区域,设计PCR点突变,使起始密码子ATG变成ACG或CTG,从而关闭agno-1a的翻译并可能改变关键mRNA二级结构,形成ATG突变型重组克隆。片段插入型克隆:SDS碱裂解法,提取APV cDNA克隆pHL1003质粒DNA,用限制性内切酶Acc I部分酶切,得到回收的载体片段,人工合成的27bp DNA并磷酸化的目的片段,经T4连接酶与载体片段连接,筛选阳性重组质粒,通过测序验证,得到片段插入型cDNA克隆pHL1003+1、pHL1003+2。点突变型克隆:用限制性内切酶Nco I完全酶切和Acc I部分酶切pHL1003质粒DNA,得到载体片段,设计PCR点突变起始密码子ATG变为ACG和CTG的目的片段,与载体片段连接,筛选阳性克隆测序验证。设计构建GFP为下游报告基因荧光标记的APV-1晚期基因真核双顺反子表达载体,以EGFP报告基因替代野生型病毒APV-1编码晚期结构蛋白VPs基因的碱基序列。pHL1003质粒DNA为模板,PCR扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期agno-1a区序列,作为载体片段,载体片段黏性末端补齐平末端连接后,得到重组质粒pHL1003-1(可作为Agno-1a蛋白表达质粒)。质粒DNA pEGFP-N1为模板,PCR扩增出编码绿色荧光蛋白的EGFP片段,作为目的片段与上述载体片段经T4连接酶连接,构成重组质粒pHL1003-GFP,测序验证。用限制性内切酶NruI和NedI双酶切pHL1003+1、pHL1003+2和pHL1003-GFP,得到目的片段和载体片段连接,构建pHL1003+1-GFP,pHL1003+2-GFP克隆。通过磷酸钙和脂质体的转染方法,将构建成功的cDNA突变型质粒DNA,分别定量转染到鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,分别利用Western blot和荧光显微镜观察检验。Western blot结果显示出部分特异性条带,荧光显微镜观察转染72 h后的鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光。结果表明,GFP荧光标记的APV-1真核双顺反子cDNA表达载体在鸡胚和鹌鹑胚胎成纤维细胞中正常表达了GFP蛋白并产生荧光。转染实验过程中,对转染过程的时间,转染质粒DNA的用量和转染过程中培养基pH等方面条件不断优化,提高了转染效率。根据不同质粒DNA组合转染不同染禽类胚胎原代细胞及其荧光表达量的差异的结果分析提示,在APV晚期基因多顺反子上游基因插入额外起始密码ATG会影响下游顺反子的翻译;Agno-1a蛋白对其下游基因翻译起始起重要的正调控作用。

关键词：禽类多瘤病毒 GFP荧光标记 cDNA克隆转染禽类胚胎细胞翻译起始调控

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大肠杆菌翻译起始调控的多样性

大肠杆菌翻译起始调控的多样性

作者：王晓花内蒙古大学

学位级别：硕士

原核生物的翻译起始调控一直是生物信息学研究的一个重要内容,核糖体与mRNA如何正确结合并有效识别起始密码子是研究基因翻译起始调控的重要环节,是调控基因表达水平的一个核心问题。本文以大肠杆菌为例,从已确定含有SD序列的部分基因出... 详细信息

原核生物的翻译起始调控一直是生物信息学研究的一个重要内容,核糖体与mRNA如何正确结合并有效识别起始密码子是研究基因翻译起始调控的重要环节,是调控基因表达水平的一个核心问题。本文以大肠杆菌为例,从已确定含有SD序列的部分基因出发,用自洽聚类方法预测基因的SD序列,并对SD序列进行强弱排序;然后从核糖体的二级结构和高级结构出发,用简单相关分析预测可能与翻译起始调控序列结合的16S rRNA片段。用自洽聚类方法判定大肠杆菌蛋白质编码基因SD序列强弱,给出构成强SD序列的17种碱基关联模式。将全部SD序列按作用强弱不同分为三类:强、中、弱,发现强弱不同时最偏好模式不同,如GGAGG是弱SD序列的最偏好模式,AAGGA是强SD序列的最偏好模式。且同一模式距起始密码子的距离不同时,所起的调控作用也不同,如GGAG模式中的A在强SD序列中位于-8位点,在弱SD序列中位于-7和-9位点。平均来说,SD序列的核心区域位于-12至-6位点,-9位点上碱基G出现的概率最大,C出现的概率最小。结果还表明SD序列越强,基因的表达水平越高;SD序列越弱,基因表达水平越低。SD序列与anti-SD序列的配对程度和相对位置影响起始密码子的识别和翻译起始效率。从大肠杆菌16S rRNA的二级结构出发,将16S rRNA分成不同的茎、环片段,并与翻译起始调控序列进行序列比对,得到的打分值与CAI值做相关分析。根据16S rRNA与核蛋白的结合位点以及空间上与调控序列相邻的区域对有显著正相关的rRNA片段进行筛选,最终确定anti-SD序列、右茎5、右茎18能与翻译起始调控序列作用,提高翻译起始效率。通过对anti-SD序列与右茎5、右茎18在调控序列上位置关系分组,分析结果表明:翻译起始调控中,anti-SD序列起主导作用,当anti-SD序列距起始密码子较远时,右茎5和右茎18辅助调控翻译起始,促进基因表达。

关键词：大肠杆菌 SD序列自洽聚类方法离散增量 16S rRNA 翻译起始调控

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基因表达的转录后与翻译起始调控

生命的化学 1995年第2期15卷 13-14页

作者：彭晓冬童坦君北京医科大学生化与分子生物学系

基因表达的转录后与翻译起始调控彭晓冬，童坦君（北京医科大学生化与分子生物学系，北京１０００８３）关键词转录后调控，翻译起始调控，ＲＮＡ结构近年来，基因表达的转录调控研究十分深入。转录以后诸过程的调控机制研究亦越来越引... 详细信息

基因表达的转录后与翻译起始调控彭晓冬，童坦君（北京医科大学生化与分子生物学系，北京１０００８３）关键词转录后调控，翻译起始调控，ＲＮＡ结构近年来，基因表达的转录调控研究十分深入。转录以后诸过程的调控机制研究亦越来越引人注目。一般认为，对ｍＲＮＡ成熟、...

关键词：转录后调控翻译起始调控基因表达

起始密码子上游核苷酸影响拟南芥精细胞翻译起始效率的研究

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起始密码子上游核苷酸影响拟南芥精细胞翻译起始效率的研究

作者：张莉西北大学

学位级别：硕士

翻译起始对于蛋白质合成效率至关重要。已有研究结果表明:在动物细胞中,翻译起始在优化背景——Kozak序列存在时效率最高。但在植物细胞中,起始密码子上游的核苷酸影响翻译起始效率的细节仍有待进行深入的研究。本研究以拟南芥(Arabidop... 详细信息

翻译起始对于蛋白质合成效率至关重要。已有研究结果表明:在动物细胞中,翻译起始在优化背景——Kozak序列存在时效率最高。但在植物细胞中,起始密码子上游的核苷酸影响翻译起始效率的细节仍有待进行深入的研究。本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)精细胞为实验材料,通过对其起始密码子AUG上游的四个热点核苷酸进行突变,评估了不同位置上的核苷酸对翻译起始效率的影响。此外,本研究还探讨了在优化及劣化背景下,翻译能否起始于非AUG起始密码子处。获得的主要结果如下:已有结果表明碱基A在起始密码子AUG上游-1～-4中出现频率最高。在起始密码子AUG上游为劣化的背景下,本研究构建了四个-1、-2、-3、-4位分别为碱基A的载体,通过农杆菌介导的遗传转化,获得了各自载体对应的转基因植株,并用荧光显微镜对其进行了定量观察。统计结果显示:与劣化背景相比,各个位置上的核苷酸对翻译起始效率的提高存在不同的影响;其中,-1位对翻译起始的效率影响最小,-2～-3位次之,-4位影响最大。在Kozak序列存在时,动物细胞中的翻译能起始于非AUG起始密码子处。但在植物细胞中,这一问题仍未被调查过。在起始密码子AUG上游为优化(-1～-4位为A)的背景下,本研究构建了四个将起始密码子AUG突变为AGG,ACG,CUG,AUC的载体,并获得了各自载体对应的转基因植株。来自荧光显微镜的观察结果表明:所有这四个转基因系的精细胞中都存在GFP蛋白的表达。这些结果提示在优化背景下翻译仍能起始于AGG,ACG,CUG,AUC密码子处。在起始密码子AUG上游为劣化的背景下,本研究也构建了四个将起始密码子AUG突变为AGG,ACG,CUG,AUC的载体,并获得了各自载体对应的转基因植株。荧光显微镜观察结果表明:这四个转基因系的精细胞中都不存在GFP蛋白的表达。这表明在上游为劣化的背景下翻译不能起始于AGG,ACG,CUG,AUC密码子处。本研究揭示了起始密码子AUG上游的四个热点核苷酸对拟南芥精细胞中的翻译起始效率存在不同的影响;再者,本研究还表明在优化背景下翻译能够起始于非AUG起始密码子处,但在劣化背景下,翻译却无法起始于非AUG起始密码子处。这些研究结果表明精细胞在翻译起始调控方面并不存在异于体细胞的机制,从而有助于我们对精细胞发育的理解。

关键词：热点核苷酸非AUG起始密码子翻译起始调控精细胞拟南芥

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精细胞内存在调控蛋白成熟效率的研究

精细胞内存在调控蛋白成熟效率的研究

作者：杨云西北大学

学位级别：硕士

被子植物的精细胞存在于花粉营养细胞之中,通过花粉管的传递到达胚囊,从而实现与卵细胞的融合而形成合子。前期研究表明,一些参与合子发育的mRNA是精细胞来源的,但这些mRNA所对应的蛋白却并不出现在精细胞中。本研究中通过对异源表达的... 详细信息

被子植物的精细胞存在于花粉营养细胞之中,通过花粉管的传递到达胚囊,从而实现与卵细胞的融合而形成合子。前期研究表明,一些参与合子发育的mRNA是精细胞来源的,但这些mRNA所对应的蛋白却并不出现在精细胞中。本研究中通过对异源表达的GFP在精细胞中无绿色荧光现象的研究,发现精细胞在折叠水平上存在着调控蛋白成熟的机制,为理解前期的研究结果提供了新的视角。不同于拟南芥转基因系ProHTR10:H2B-GFP的精细胞呈现明亮的绿色荧光信号,转基因系ProHTR10:GFP的精细胞并不呈现可见的绿色荧光信号。这表明以成熟蛋白形式存在于精细胞中的GFP含量明显低于H2B-GFP成熟蛋白的含量。这种荧光差异的现象存在于几乎所有的ProHTR10:H2B-GFP及ProHTR10:GFP转基因系中,表明该现象的产生并不来自于转录水平上的调控。与此一致的是,转基因系ProTIP5:H2B-GFP和ProTIP5:GFP的精细胞也呈现出相似的荧光现象,表明启动子并不是造成这种成熟蛋白含量差异的原因。同时,因为转基因系ProHTR10:EF1g-GFP和ProHTR10:e1F1-GFP表达的精细胞细胞质定位的EF1g-GFP和eIF1-GFP融合蛋白也都呈现出可见的绿色荧光信号,所以GFP成熟蛋白含量低的原因并不是因为其细胞质定位而导致的。再者,当用卵细胞特异的启动子proDD45及花粉营养细胞特异的启动子proLat52驱动GFP和eIF1-GFP在卵细胞和花粉营养细胞中特异表达时,两种转基因系的卵细胞及花粉呈现了相似的荧光强度,揭示这种GFP成熟蛋白含量低的现象是精细胞特异的。由于转基因系ProHTR10:EF1g-GFP和ProHTR10:GFP在起始密码子AUG附近的核苷酸序列不同,这可能会导致核糖体对它们mRNA翻译起始效率的不同。为了探索GFP成熟蛋白在精细胞中含量低的原因,我们产生了转基因系ProHTR10:GFP108-EF1g-GFP,ProHTR10:GFP75-EF1g-GFP,和 ProHTR10:GFP36-EF1g-GFP。这3种转基因系与ProHT10:GFP转基因系在起始密码子AUG附近有相似的核苷酸序列。我们观察到这3种植株的精细胞与转基因系ProHTR10:EF1g-GFP的精细胞有相似的GFP荧光强度,而与ProHTR10:GFP转基因系无荧光信号的精细胞明显不同,暗示受起始密码子附近核苷酸序列影响的蛋白翻译起始效率并是不造成GFP成熟蛋白含量低的原因。再者,与转基因系ProHTR10:GFP相似,转基因系ProHTR10:H2B18-GFP及ProHTR10:EF1g18-GFP的精细胞也未呈现可见的绿色荧光信号,进一步排除了低含量的GFP成熟蛋白是由低效率的蛋白翻译起始所引起的。然而,当利用GFP抗体对ProHTR10:GFP和ProHTR10:eIF1-GFP的精细胞进行免疫荧光定量分析时,我们却观察到了相似的荧光信号。这表明这两种转基因系的精细胞有相似的GFP蛋白总量。基于这些实验结果,我们得出结论:精细胞中存在着在折叠水平上调控GFP蛋白成熟效率的机制。这些研究结果首次表明精细胞存在着在折叠水平上调控蛋白成熟的机制。这种机制有利于一些在精细胞中表达却在早期合子发育中行使功能的mRNA的存在,为我们理解被子植物的精细胞的发育提供了新的认知。

关键词：精细胞绿色荧光蛋白翻译起始调控蛋白折叠

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核糖体蛋白在骨肉瘤中的研究进展

癌症进展 2020年第5期18卷 448-451,492页

作者：陆禹严贺茂林罗书钜玉林市第一人民医院脊柱骨病外科广西玉林537000 广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科南宁5300210

骨肉瘤严重危害青少年的生命健康,但由于发病率低、异质性高和基因背景复杂等原因,骨肉瘤的基础研究和诊疗进步都面临着诸多困难和挑战。近年来,以靶向受体酪氨酸激酶家族成员、蛋白激酶B和雷帕霉素靶蛋白为代表的精准治疗逐渐成为骨肉... 详细信息

骨肉瘤严重危害青少年的生命健康,但由于发病率低、异质性高和基因背景复杂等原因,骨肉瘤的基础研究和诊疗进步都面临着诸多困难和挑战。近年来,以靶向受体酪氨酸激酶家族成员、蛋白激酶B和雷帕霉素靶蛋白为代表的精准治疗逐渐成为骨肉瘤研究的热点。研究发现,核糖体蛋白在包括骨肉瘤在内的多种恶性肿瘤中异常表达影响了骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、转移并与骨肉瘤患者的预后相关,但其潜在的分子机制仍不明确。因此,从分子生物学上阐明核糖体蛋白影响骨肉瘤细胞生物学行为的机制可能为骨肉瘤的靶向治疗提供新的思路和方向。

关键词：骨肉瘤核糖体蛋白核糖体异质性翻译起始调控