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昆虫翅发育研究的现状与前景

植物保护学报 2017年第2期44卷 185-195页

作者：郭韶堃罗丹李志红沈杰中国农业大学植物保护学院昆虫学系北京100193

翅的形成有利于昆虫的迁移,一些害虫依靠强大的飞行能力扩散为害,致使农林业产业经济损失严重。目前,昆虫翅发育研究在遗传调控机理方面取得了大量突破性进展,作为生物器官的研究模型,昆虫翅为生物医学提供了良好的范本。为深入了解昆... 详细信息

翅的形成有利于昆虫的迁移,一些害虫依靠强大的飞行能力扩散为害,致使农林业产业经济损失严重。目前,昆虫翅发育研究在遗传调控机理方面取得了大量突破性进展,作为生物器官的研究模型,昆虫翅为生物医学提供了良好的范本。为深入了解昆虫翅发育的研究进展和在植物保护及生物医学领域中的应用,本文介绍了昆虫翅发育的普遍调控机理,对比了不同变态发育类型代表性昆虫的翅发育关键调控基因及其作用机理,并结合最新涌现的RNA农药、纳米材料转染生物分子、基因编辑等技术,分析并展望了农业害虫防治中的翅模型研究的应用前景。

关键词：昆虫翅发育 RNA农药纳米材料转染生物分子基因编辑

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飞蝗dpp基因在翅发育中的功能分析

山西大学学报(自然科学版) 2022年第6期45卷 1632-1639页

作者：武兆辰张福斌徐子龙张晶张建珍赵小明山西大学生命科学学院山西大学应用生物学研究所

Dpp(Decapentaplegic)是脊椎动物和无脊椎动物中非常重要且高度保守的一个信号通路，在细胞的生长和分化等方面发挥调控作用。在完全变态昆虫中，Dpp调控翅的生长发育，但对渐变态昆虫翅发育的作用机制尚不清楚。文章以飞蝗（Locusta mi... 详细信息

Dpp(Decapentaplegic)是脊椎动物和无脊椎动物中非常重要且高度保守的一个信号通路，在细胞的生长和分化等方面发挥调控作用。在完全变态昆虫中，Dpp调控翅的生长发育，但对渐变态昆虫翅发育的作用机制尚不清楚。文章以飞蝗（Locusta migratoria）为研究对象，根据同源性搜索识别飞蝗dpp基因（Lmdpp），并对其编码的氨基酸序列与不同昆虫Dpp进行多序列比对。然后，利用RT-q PCR方法对Lmdpp在五龄飞蝗不同组织及不同发育天数的翅芽进行表达特性分析，结果显示Lmdpp在五龄每天的翅芽组织中均有表达，且在多个组织中高表达。利用RNA干扰技术探讨Lmdpp在飞蝗翅发育中的作用，结果显示，与对照组相比，注射Lmdpp基因的dsRNA(doublestranded RNA,dsRNA)的处理组约有31%的飞蝗在蜕皮后出现翅紊乱表型。苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,H&E）染色结果表明，沉默Lmdpp后的翅新表皮形成异常；RT-q PCR结果显示，沉默Lmdpp后导致飞蝗翅特异表皮蛋白基因LmAcp7、LmAcp8和LmAcp19(Adult cuticle protein,Acp)的表达量显著降低。结果表明，Lmdpp可能通过调控飞蝗翅特异表皮蛋白基因的表达参与翅的发育与形成，研究结果可为dpp在渐变态昆虫翅发育中的作用机制研究提供基础。

关键词：飞蝗翅发育 Decapentaplegic RNA干扰

热胁迫下抗性与敏感小菜蛾翅发育相关基因As-C、WG、DLL表达动态...

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作者：陈学准福建农林大学

学位级别：硕士

小菜蛾（Plutella xylostella L.）属鳞翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae）,是一种为害十字花科蔬菜的世界性害虫。目前对于小菜蛾的防治仍集中在化学农药上,但由于其抗药性进化速度快,以及杀虫剂的不合理大量使用造成小菜蛾对... 详细信息

小菜蛾（Plutella xylostella L.）属鳞翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae）,是一种为害十字花科蔬菜的世界性害虫。目前对于小菜蛾的防治仍集中在化学农药上,但由于其抗药性进化速度快,以及杀虫剂的不合理大量使用造成小菜蛾对各类型杀虫剂都产生较高的抗药性,加上小菜蛾对环境具有很强的适合度,使得田间小菜蛾的防治十分困难。我们前期工作证实了高温下小菜蛾抗性品系适合度各指标较敏感品系均有不同程度下调,并发现热胁迫下抗药性小菜蛾（Rc DBM）翅脉损伤、翅畸形概率远高于敏感性小菜蛾（Sm DBM）。本文以上述发现为基础,从翅发育相关基因克隆及抗性、敏感品系热胁迫下表达差异方面展开研究,为高温下小菜蛾抗性、敏感品系在生理、形态上表现出不同差异的研究奠定基础,主要结果如下:1、根据果蝇、家蚕等模式昆虫翅发育的相关研究筛选出小菜蛾翅发育中6条背腹轴翅发育相关基因,通过RT-PCR克隆出该6条基因的核心片段,通过设计特异性引物RACE-PCR克隆出其中4条基因的两端片段,通过序列拼接获得Achaete-scute complex（As-C）家族ASH1、ASH2、ASH3、ASE 四条全长序列,Distal-Less（DLL）和 Wingless（WG）部分序列,其中DLL含有完整保守结构域。小菜蛾ASH1全长873 bp,ORF为564bp,编码187个氨基酸,预测蛋白分子量为20.47 kDa,等电点为 8.81;ASH2全长 809bp,ORF 为 696bp,编码 231个氨基酸,预测蛋白分子量为25.51 kDa,等电点为9.02;ASH3全长1012 bp,ORF为672 bp,编码223个氨基酸,预测蛋白分子量为24.85 kDa,等电点为 7.02。ASE全长 1799bp,ORF 为 1191 bp,编码397个氨基酸,预测分子量为44.78 kDa,等电点为4.89。该4条基因属于As-C家族基因,经过蛋白结构域分析、多序列比对、进化树分析,结果表明该家族基因含有的bHLH结构域与其它物种具有很高的同源性。DLL全长为1541 bp,ORF为897 bp,编码299个氨基酸,经过蛋白结构域分析、多序列比对、进化树分析,结果表明含有HOX保守结构域。2、利用实验室筛选培育的抗性和敏感品系小菜蛾,结合qRT-PCR技术研究了不同品系中上述六个基因在四个热胁迫处理组中的表达差异。结果表明在温度处理组（25℃-8 h,42℃-4 h,42℃-8 h）和（25℃-16h,40℃-8h,40℃-16h）中,25℃室温处理下的抗性和敏感品系该六个基因的mRNA表达水平都较高,没有显著差异;但是在40℃和42℃热胁迫处理下,mRNA表达水平都会下调,且抗性品系该六条基因的表达水平都显著低于敏感品系。在另外两个温度处理组（25℃-1 h,44℃-1h）和（25℃-48 h,38℃-48 h）中,由于处理的时间过短或过长,所以不论在高温还是室温,该六条基因mRNA表达水平都很低,但仍然表现出抗性品系高温下mRNA表达水平显著低于敏感品系的特征。

关键词：小菜蛾翅发育表达分析抗性品系敏感品系

褐飞虱Dnmt3及翅发育相关基因的表达和功能分析

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褐飞虱Dnmt3及翅发育相关基因的表达和功能分析

作者：李瑶南京农业大学

学位级别：硕士

褐飞虱(Nilaparvata lugens)是一种为害水稻生产的重要农业害虫,食性单一,只能在水稻和普通野生稻上取食和繁殖后代,但繁殖速度快且繁殖量大,是我国及许多亚洲国家水稻生产上的重要害虫。本文克隆了褐飞虱DNA甲基转移酶Dnmt3的全长cDNA... 详细信息

褐飞虱(Nilaparvata lugens)是一种为害水稻生产的重要农业害虫,食性单一,只能在水稻和普通野生稻上取食和繁殖后代,但繁殖速度快且繁殖量大,是我国及许多亚洲国家水稻生产上的重要害虫。本文克隆了褐飞虱DNA甲基转移酶Dnmt3的全长cDNA,进行了结构与进化分析,检测了 Dnmt3在褐飞虱整个发育阶段的表达水平。分别对Dnmt1和Dnmt3进行了 RNA干扰,发现后代数量明显减少,表明褐飞虱DNA甲基化对繁殖力具有一定的影响。此外,还对其他翅发育相关的基因进行了干扰分析。1.褐飞虱Dnmt3的全长克隆及基因结构分析从褐飞虱转录组中获得了 DNA甲基转移酶Dnvt3的基因序列片段。通过RT-PCR进行序列片段验证后,利用RACE技术获得了该基因的cDNA全长序列(GenBank登录号为KP890855)。Dnmt3基因的cDNA序列全长为2,040个碱基,包括5'非编码区的316个碱基,开放阅读框的1,230个碱基和3'非编码区的494个碱基,编码409个氨基酸。对褐飞虱Dnmt3的基因序列和蛋白序列进行了蛋白结构域、多序列比对、基因结构及系统进化树分析。结果表明,褐飞虱DNMT3只含有1个具有催化活性的DNA methylase domain,不同昆虫 DNMT3 的 DNA methylase domain 氨基酸序列相似性很高。褐飞虱DNMT3与苜蓿切叶蜂和佛罗里达弓背蚁DNMT3的相似性达到50%以上。不同物种Dnmt3基因长度相差较大,褐飞虱基因序列长度与高等膜翅目的两种蜂相近。与脊椎动物相比,昆虫外显子更长,但数量明显偏少。系统进化树分析表明,褐飞虱Dnmt3与膜翅目昆虫同源基因具有较近的进化距离。2.褐飞虱Dnmt3在不同发育阶段的表达分析对褐飞虱不同发育阶段的Dnmt3基因表达量进行了分析,检测了Dnmt3在褐飞虱1至5龄若虫、羽化24h内未产卵的长短翅雌虫、处于产卵盛期的长短翅雌虫、长短翅雄虫中表达量的变化情况。结果表明,Dnmt3的表达量在褐飞虱若虫阶段的表达量很低,而且不同龄期间的差异不明显。在成虫阶段,不同时期存在较大差异。短翅型产卵盛期雌虫表达量显著高于长翅型产卵盛期雌虫;羽化24h内未产卵的雌虫和雄虫,短翅型表达量稍高于同一时期的长翅型,但差异不明显。无论何种翅型,处于产卵盛期的雌虫表达量均高于羽化24h内未产卵的雌虫和若虫,雄虫表达量最低。为进一步明确成虫阶段的动态变化,选取1-7d不同日龄的短翅型雌虫、短翅型雄虫、长翅型雌虫和长翅型雄虫进行表达量分析。结果表明,短翅型雌虫表达量在整个成虫发育阶段,大致呈上升趋势,且表达量达到高峰的时期与产量盛期的时间大致吻合。在成虫发育阶段,短翅型雌虫表达量显著高于长翅型雌虫,雄虫的表达量最低。3.褐飞虱Dnmt1和Dnmt3的RNA干扰分析通过试剂盒体外合成Dnm3和Dnmt3的dsRNA,采用显微注射法对其进行注射干扰,从胸部背面注射处于产卵盛期的雌性短翅褐飞虱体内,注射量为200 nl,注射浓度为2,500 ng/μl,每只虫子注射量大约500ng dsRNA。每个重复30头雌虫,共三个重复。干扰注射后,30只雌虫放置于一个烧杯中,另放置20只雄性个体供交配。与对照相比,各组试虫在注射dsRNA后24h、48h、72h,Dnmt1和Dnmt3基因的表达量均显著降低,表明对这两个基因的RNA干扰都具有效果。待亲代产卵结束后,观察后代的个体数量,发现干扰Dnmt1后,后代数量极显著减少(P翅发育相关基因的RNA干扰分析从数据库Flybase中获得与果蝇翅发育相关的3个基因Awd,Sl和Wmd,在褐飞虱基因组中进行同源搜索。根据褐飞虱这3个基因序列设计并合成相应的dsRNA,选取褐飞虱2龄若虫进行喂食干扰实验,dsRNA终浓度为200ng/μl。利用荧光定量PCR技术对干扰后不同时间点的基因表达量变化进行检测,结果表明,这3个基因被干扰后表达量均有明显降低(P翅发育及翅型分化无明显的影响。

关键词：褐飞虱基因克隆 Dnmt3 表达分析 RNA干扰翅发育

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BmYki调控家蚕翅发育的功能与机理研究

BmYki调控家蚕翅发育的功能与机理研究

作者：谭婷婷西南大学

学位级别：硕士

翅是昆虫生存所必需的器官,昆虫世界因有翅而绚丽多姿。但对害虫而言,翅反而是它们扩大为害的重要武器,如2016年由美洲经非洲入侵南亚多国并在去年袭扰我国的草地贪夜蛾和2019年始于东非并在最近肆虐中东和南亚地区的沙漠蝗虫等,飞行能... 详细信息

翅是昆虫生存所必需的器官,昆虫世界因有翅而绚丽多姿。但对害虫而言,翅反而是它们扩大为害的重要武器,如2016年由美洲经非洲入侵南亚多国并在去年袭扰我国的草地贪夜蛾和2019年始于东非并在最近肆虐中东和南亚地区的沙漠蝗虫等,飞行能力惊人,对农作物毁坏十分惨烈。那么,昆虫翅是怎样发生和如何调控的呢?这是昆虫学领域致力解决的一项重要内容。家蚕(Bombyx mori)是由野桑蚕驯化而来的鳞翅目有翅亚纲昆虫,因能大量产丝而被人类饲养利用逾5000年。与野桑蚕相比,家蚕的最大变化之一,是丧失了飞行能力,翅的颜色和斑纹等也严重退化,但昆虫翅的基本形态和发育特征仍在,因而被认为是研究昆虫翅发育调控机制和害虫防控策略的独特模型。家蚕翅发育是一个由众多基因调控的复杂过程。国内外早在1960年代就对家蚕翅发育调控机制展开探索并取得了较多进展,但是远未探明其调控机制。近年来,研究人员在果蝇中发现了一条名为Hippo的控制器官大小的重要信号通路,其下游的转录共激活因子Yki是信号传导的“开关”,通过入核或出核的方式开启或关闭下游靶基因的表达,从而调控器官的大小发育。Yki已被证实对果蝇翅发育具有重要调控作用,但在家蚕中其是否具有类似功能以及如何进行调控研究报道不多。在前期研究中,本课题组自家蚕中克隆了Hippo信号通路的转录共激活因子BmYki。为进一步探索BmYki调控家蚕翅发育的功能与机理,本论文首先构建了可在家蚕翅原基高量表达目的基因的GAL4/UAS转基因系,在此基础上制作了过表达、敲低和敲除BmYki的遗传素材,并对翅突变表型和BmYki的靶基因等进行了分析,取得了以下主要结果:1.翅原基高表达目的基因的GAL4/UAS转基因家蚕制作本课题组前期以家蚕肌动蛋白Actin4(A4)基因的近端启动子为调控元件,以EGFP为报告基因,分别制作了基于家蚕Nistari品系的GAL4基础转基因系A4-GAL4(AG4)和UAS基础转基因系UAS-EGFP(UEGFP),但尚未分析A4启动子驱动EGFP表达的时空特征。本研究首先将AG4与UEGFP进行杂交,从其后代中筛选获得了阳性个体AG4/UEGFP,简写为EGFP。荧光观察结果显示,EGFP自胚胎第三天开始表达,一直持续到成虫期,其中在蛹期翅原基和内表皮这两个与家蚕翅发育密切相关的组织以及成虫翅和鳞毛处均有高量表达。观察五龄第五天EGFP家蚕的主要组织发现,EGFP在前后翅原基和内表皮中高量表达,脂肪体和气管中仅有少量表达,其它组织中未观察到EGFP表达。qPCR和Western blot检测结果与荧光观察结果一致。该结果表明,以A4为启动子的GAL4/UAS系统,是调控目的基因在家蚕翅原基高量表达的有效工具。***过表达、敲低和敲除系统的制作本课题组前期已制作获得了用于过表达、敲低和敲除BmYki的UAS基础转基因系,包括UAS-BmYki、UAS-dsBmYki和UAS-BmYki。本研究首先将三个UAS转基因系分别与AG4转基因系进行杂交,从其杂交后代中筛选获得了相应的GAL4/UAS阳性个体,依次命名为AG4/UAS-BmYki(Yki,过表达BmYki)、AG4/UAS-dsBmYki(Yki,敲低BmYki)和AG4/UAS-BmYki(Yki,敲除BmYki)。基因组PCR和测序结果表明,上述过表达、敲低和敲除BmYki的系统均获成功,可用于下一步研究。***诱导的家蚕翅原基(翅)突变表型分析以野生型家蚕为对照,分别对Yki、Yki和Yki家蚕翅原基(翅)表型进行调查,结果显示:(1)Yki幼虫个体变小,翅原基面积变小;成虫翅皱缩严重,手触干硬;前后翅粘连,几乎无鳞毛覆盖;体表鳞毛较少,触角和足仅有少量鳞毛覆盖;蚕蛾活动能力弱,部分蚕蛾无法爬离茧壳。(2)Yki和Yki突变表型与Yki相反,主要表现为幼虫翅原基和成虫翅面积变大,成虫个体变大。(3)Yki、Yki和Yki幼虫体重、蛹茧重、食桑量、生长周期、致死率和交配率等性状均受到不同程度的影响。这些结果表明,BmYki对家蚕翅发育具有重要调控作用。***调控家蚕翅发育的分子机理初探为探索BmYki调控家蚕翅发育的分子机理,我们对蛹期第五天Yki和Yki的翅组织进行转录组测序分析,结果显示:(1)在Yki翅组织中有516个差异表达基因,其中302个上调表达,214个下调表达。在Yki翅组织中有165个差异表达基因,其中53个上调表达,112个下调表达。Yki和Yki翅组织中的共有差异表达基因为57个。(2)鉴定出4类差异表达基因与家蚕翅发育密切相关,分别为:3个翅模式决定基因(Dpp、ASH、Vg),2个翅发育相关基因(Osiris、Notch),5个激素信号相关基因(HR3、E74、Jheh-2、Bm3DE-

关键词：家蚕翅发育 BmYki 突变表型分子机制

转录因子Midline对果蝇翅发育的调控机理研究

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转录因子Midline对果蝇翅发育的调控机理研究

作者：付崇雷山东农业大学

学位级别：硕士

细胞间通讯在动物器官发育的细胞粘附和器官生长控制等方面起着重要作用。细胞间通讯依赖于一系列信号通路的参与和对下游基因的转录调控。尽管已知Wingless(Wg)和Hedgehog(Hh)信号通路在动物器官发育中起到重要作用,但对其上游的调控... 详细信息

细胞间通讯在动物器官发育的细胞粘附和器官生长控制等方面起着重要作用。细胞间通讯依赖于一系列信号通路的参与和对下游基因的转录调控。尽管已知Wingless(Wg)和Hedgehog(Hh)信号通路在动物器官发育中起到重要作用,但对其上游的调控因子及多种信号通路之间整合和相互协调的机制还知之甚少。果蝇成虫翅是由幼虫期的翅原基发育而来。翅原基的生长和形态建成依赖于两个信号中心的形成,由Hh信号控制的前后轴(A/P)和由Wg信号控制的背腹轴(D/V)。因此,果蝇翅是研究器官发育及其基因调控网络的理想模型。本课题关注的转录因子Midline(Mid)为脊椎动物T-box20在果蝇中的同系物。作为T-box家族一个进化保守的转录因子,Mid在细胞命运决定和组织分化方面起到重要的作用,调控一系列的发育过程。本研究发现转录因子Mid在果蝇的翅原基中广泛表达,并且对于果蝇翅的发育起到重要的作用。在翅原基中,Mid功能的缺失或者部分缺失会引起wg表达的激活,导致成虫翅上凸或者下凹的表型,并伴随有翅脉L3与L4间距的增大和异常刚毛的产生。而在翅原基中过度表达Mid会明显抑制wg及其下游基因DE-Cadherin(DE-Cad)和armadillo(arm)的表达,并导致成虫翅小型泡状表型的产生。另外,我们发现在翅原基中Mid表达量的减少能够增强hh获得功能突变体的表型。而且,在翅原基中过度表达Mid会显著抑制hh的表达。综上所述,我们提出Mid通过抑制wg和hh基因来调控果蝇翅的发育。

关键词： Mid Wg Hh 果蝇翅发育

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果蝇E93转录因子对翅发育的调控研究

果蝇E93转录因子对翅发育的调控研究

作者：王伟娜西南大学

学位级别：硕士

昆虫E93转录因子是蜕皮激素下游的初级应答因子之一,在昆虫由蛹向成虫变态发育期间发挥着重要作用。E93既参与调控昆虫变态期间幼虫组织的细胞程序性死亡,同时也调控成虫组织器官的形成。但目前有关E93调控成虫组织器官形成的分子机制... 详细信息

昆虫E93转录因子是蜕皮激素下游的初级应答因子之一,在昆虫由蛹向成虫变态发育期间发挥着重要作用。E93既参与调控昆虫变态期间幼虫组织的细胞程序性死亡,同时也调控成虫组织器官的形成。但目前有关E93调控成虫组织器官形成的分子机制的研究还很少。E93最早在果蝇中被鉴定到,其在预蛹期和蛹期特异性表达;在蛹变态期,果蝇幼虫器官如唾液腺和中肠等发生凋亡,而翅原基却经历剧烈的形态变化过程最终发育为成虫的翅。基于蛹期翅的剧烈变态发育及成虫翅表型易于观察等优点,翅常作为研究器官发育的理想模型。在本研究中,我们以果蝇为模式生物探究了E93转录因子调控翅发育的分子机制。采用Gal4/UAS系统对果蝇E93基因进行翅特异性RNAi后观察表型,利用ChIP-seq数据分析筛选E93下游的潜在作用靶标,并通过在细胞及组织水平的分子生物学检测和个体水平的表型观察,最终解析了E93转录因子调控果蝇翅发育的分子机制。取得的主要研究结果如下:1.果蝇E93基因的翅特异RNAi对翅发育的影响为了探究果蝇翅中E93的表达对翅发育的影响,我们采用Gal4/UAS系统对果蝇E93基因进行翅特异性RNAi。本实验中共选用了4种果蝇翅特异性Gal4品系(nubbin-Gal4、MS1096-Gal4、ptc-Gal4和en-Gal4)和2种E93基因RNAi品系(V104390和#57868)。首先,利用Gal4/UAS系统检测了4种翅特异性Gal4在翅中的表达模式。通过将翅特异性Gal4品系的处女蝇分别与表达红色荧光蛋白的UAS-Cherry品系的雄蝇杂交,取其子代翅原基检测红色荧光蛋白的表达部位。结果显示,nubbin-Gal4驱动红色荧光蛋白在整个翅囊区表达;MS1096-Gal4驱动红色荧光蛋白在背区(D区)的翅囊区表达;en-Gal4和ptc-Gal4分别驱动红色荧光蛋白在翅原基后区(P区)和前区/后区(A/P)分界处表达。我们选取表达范围最广的nubbin-Gal4分别与果蝇E93基因的两种RNAi品系(V104390和#57868)及相应的对照品系进行杂交,并取其子代翅原基通过RT-PCR和qRT-PCR检测E93基因的表达。结果显示,与对照组相比,E93基因的翅特异性RNAi导致翅中E93的表达水平显著降低。表型观察和统计结果显示,果蝇E93基因的翅特异性RNAi引起成虫翅变小和翅脉发育异常,两组中E93基因RNAi后的翅面积分别减少了76.2%和82%。另外,我们利用MS1096-Gal4、ptc-Gal4和en-Gal4这三种翅特异性Gal4分别与E93基因RNAi品系V104390进行杂交,其子代同样表现出了翅变小和翅脉缺陷的表型。以上结果表明,E93在果蝇翅发育过程中发挥着极为重要的调控作用。2.基于ChIP-Seq数据筛选果蝇E93的潜在靶基因为了解析E93调控果蝇翅发育的分子机制,我们对果蝇E93在翅中的ChIP-seq数据进行了分析,以筛选E93的潜在靶基因。全基因组定位分析显示,28.51%的E93 ChIP峰位于基因启动子区(定义为转录起始位点上游2000bp的区域),共对应1868个基因;43.96%的E93 ChIP峰位于内含子区;13.65%的E93 ChIP峰位于基因间区。鉴于转录因子常通过与靶基因启动子区的关键DNA基序结合发挥其转录调控作用,我们重点关注了启动子区分布有E93 ChIP峰的1868个基因。GO功能注释显示,1868个基因中的513个基因富集于翅原基-翅变态这一生物学进程。进一步基于果蝇翅在蛹变态发育期的转录组数据,分析了这513个基因在化蛹后6 h、18h、24 h、36 h和44 h共五个时间点的翅中的协同表达变化。根据其不同的表达模式,共聚类为8个簇,其中E93基因位于簇2中,其表达变化趋势为在预蛹期开始逐渐上调表达,直至化蛹后24 h表达水平达到最高,而后表达又逐渐降低;513个基因中共有60个基因在蛹期具有和E93类似的表达模式。进一步对这60个基因进行KEGG通路富集分析,4条与翅发育相关的信号通路被富集,分别为:Dpp、MAPK、Notch和Hippo信号通路;4条信号通路中共富集到Dpp、Tkv、Sog、Nej、Numb、Ser、Wts、Baz、Kibra、Cka、Cic、Ttk共12个基因。3.果蝇E93调控翅发育的分子机制在基于ChIP-Seq数据筛选得到的果蝇E93的潜在靶基因中,我们注意到编码Dpp信号通路配体的Dpp基因被富集且在蛹期的表达变化与E93类似,鉴于Dpp信号通路在果蝇翅发育过程中的重要作用已有广泛报道,我们选择了Dpp基因作为E93的潜在靶基因进行了深入探究。通过果蝇基因组数据库FlyBase检索发现,果蝇Dpp基因共有4种亚型,分别为Dpp-RA、Dpp-RB、Dpp-R

关键词：果蝇 E93 翅发育 Dpp信号转录调控

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整合素β亚基在飞蝗翅发育中的功能研究

整合素β亚基在飞蝗翅发育中的功能研究

作者：钮妞山西大学

学位级别：硕士

飞蝗(Locusta migratoria)是一种重要的迁飞性农业害虫,依赖其功能强大的前后翅而具有长距离、大规模迁徙能力,大密度的群居型飞蝗容易导致蝗灾的发生而引起严重的粮食危机,是历代农业生产中危害极大的一种。翅的产生使昆虫具有迁飞能力... 详细信息

飞蝗(Locusta migratoria)是一种重要的迁飞性农业害虫,依赖其功能强大的前后翅而具有长距离、大规模迁徙能力,大密度的群居型飞蝗容易导致蝗灾的发生而引起严重的粮食危机,是历代农业生产中危害极大的一种。翅的产生使昆虫具有迁飞能力,在其躲避敌害和繁衍觅食等方面发挥了重要的作用,使其更加适应复杂多变的生活环境。翅的生长发育受多个基因及信号通路的调节,同时细胞之间的连接作用以及细胞与胞外基质之间的相互作用在昆虫翅的生长发育过程中发挥着关键作用。整合素是一种存在于细胞表面的细胞粘连分子,由α和β亚基组成,在昆虫免疫反应、细胞骨架构成和生长发育中具有重要作用。然而整合素在昆虫尤其是渐变态迁飞害虫翅发育中的作用机制尚不清楚。因此,本文以渐变态迁飞害虫-飞蝗为研究对象,利用目前在转录组数据库中发现的一个整合素β亚基,探究整合素β亚基在飞蝗翅发育中的作用机制,为迁飞害虫的生物防治提供新的靶标。本研究利用飞蝗中编码一种整合素β亚基蛋白的LmIntegrinβ-PS基因为研究靶标,对其进行分子特性、表达分析,利用RNAi技术探讨该基因在飞蝗翅发育过程中的生物学功能,研究结果如下:***β-PS序列分析和表达分析根据飞蝗转录组和基因组数据库获得LmIntegrinβ的cDNA序列,这与先前已发现的未被鉴定功能的编码整合素蛋白的开放阅读框序列(KJ535130.1)一致,对其基因结构分析发现其含有12个外显子,共编码864个氨基酸,包含一个信号肽(SP)、von Willebrand factor(vWF)type A结构、表皮生长因子(EGF)、一个beta尾部(tail domain)、一个较短的跨膜域(TM)和胞质域尾部(beta cytoplasmic);Integrinβ-PS在不同物种间保守性较高,多重序列比对发现其都含有金属离子黏附剂区(MIDAS)、半胱氨酸重复区(cys-repeats)、一个跨膜域(TM)和胞质尾部的结合位点(NxxY/F)等。根据其编码的氨基酸序列与其它昆虫中的同源蛋白序列相似性将其命名为LmIntegrinβ-PS,聚类分析结果显示LmIntegrinβ-PS与蜚蠊目聚为一支;采用RT-qPCR技术检测LmIntegrinβ-PS在五龄若虫的时空表达特性,结果显示其在所有组织中均有表达,但在翅芽的表达较高且在五龄中期表达达到峰值。2.基于RNA interference的生物学功能研究RNA interference(RNAi)技术是简便高效的基因沉默技术,利用飞蝗对RNAi敏感的特性,分别在四龄和五龄第1天若虫注射dsRNA对LmIntegrinβ-PS进行干扰。结果显示,与对照组相比,注射dsLmIntegrinβ-PS的四龄若虫可以成功蜕皮到五龄,但约65%的若虫翅芽出现形态异常表型,其中40%的若虫出现泡状翅以及25%的若虫翅芽出现无法正常闭合的现象。同样,注射dsLmIntegrinβ-PS的五龄若虫在蜕皮至成虫过程中,约有58%的若虫在翅基部挤满水泡无法蜕皮导致死亡,而约30%若虫能够成功蜕皮,但成虫前后翅充满水泡,形成泡状翅。结果表明,LmIntegrinβ-PS在飞蝗若虫翅芽和成虫翅的发育中均具有重要作用。组织定位结果显示LmIntegrinβ-PS主要定位在翅表皮细胞底部的基底膜处,推测其可能介导细胞和基底膜处的连接作用。***β-PS对飞蝗翅表皮结构的影响为进一步探究LmIntegrinβ-PS在飞蝗翅生长发育过程中的作用机制。首先根据RNAi结果对翅芽组织进行H&E染色,结果发现,与对照组相比,注射dsLmIntegrinβ-PS的处理组中飞蝗翅表皮细胞层明显失去与基底膜处的连接,而导致翅背腹两层细胞失去连接而形成一个巨大的空腔。随后通过扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察翅表面和表皮超微结构的变化,SEM结果显示,与对照组中翅表面的正常结构相比,处理组的翅表面严重皱缩,刚毛减少变弯,端部变扁弯曲;TEM结果表明:LmIntegrinβ-PS沉默后,细胞连接处发生降解,细胞排列紊乱,翅结构破坏明显。RT-qPCR技术检测发现处理组中细胞连接相关基因的表达相比于对照组显著降低,推测LmIntegrinβ-PS可能通过调控其它细胞连接相关基因的表达保证正常的细胞连接和细胞骨架的稳态参与飞蝗翅的生长发育。综上所述,本文以LmIntegrinβ-PS为靶标,研究发现其可能参与飞蝗翅表皮细胞层与基底膜的连接进而参与若虫翅芽和成虫翅的发育,研究结果将为整合素在昆虫翅发育中的作用机制研究提供理论依据,同时也为以迁飞害虫翅为靶标的害虫防治提供基础。

关键词：翅发育 RNA干扰整合素细胞连接飞蝗

LmNotch基因在飞蝗翅发育中的功能分析

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中国生物防治学报 2022年第4期38卷 1001-1008页

作者：徐子龙张福斌武兆辰张晶张建珍赵小明山西大学生命科学学院太原030006 山西大学应用生物学研究所太原030006

Notch是Notch信号通路中的受体蛋白,与配体结合后调控下游靶标基因的表达,在无脊椎动物和脊椎动物的发育和分化过程中发挥着重要的作用。本文以飞蝗为研究对象,利用转录组数据库搜索获得Notch信号通路受体基因LmNotch,并利用qRT-PCR对5... 详细信息

Notch是Notch信号通路中的受体蛋白,与配体结合后调控下游靶标基因的表达,在无脊椎动物和脊椎动物的发育和分化过程中发挥着重要的作用。本文以飞蝗为研究对象,利用转录组数据库搜索获得Notch信号通路受体基因LmNotch,并利用qRT-PCR对5龄飞蝗不同组织及不同发育时期翅芽组织中的LmNotch表达特性进行了分析。通过RNA干扰试验对其生物学功能进行分析,发现注射ds LmNotch的飞蝗有70%无法完成蜕皮过程,10%的飞蝗在蜕皮后出现翅紊乱表型。飞蝗翅芽石蜡切片的H&E染色结果表明,处理组翅上下两层表皮之间腔空间增大,新表皮无法完整形成。qRT-PCR检测其他翅发育相关基因表达发现,LmNotch表达量的下降影响翅发育相关基因Dpp、Omb、Yorkie以及翅特异表皮蛋白基因的表达。上述研究结果可为昆虫翅发育机制研究提供理论基础,同时为害虫生物防治提供潜在靶标。

关键词：飞蝗 RNA干扰翅发育 Notch

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