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动物营养学报 2017年第11期29卷 4048-4057页

作者：李爽张铁鹰廖朝勇梁争文马霞飞刘俊丽中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室北京100193 甘肃农业大学动物科学技术学院兰州730070

本试验旨在通过异源表达获得地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CP-16的脂类水解酶,并探究其在羽毛降解过程中的作用。试验以地衣芽孢杆菌CP-16基因组DNA为模板,扩增脂类水解酶基因,转化入大肠杆菌中表达,获得重组酶L-4。研究重组酶... 详细信息

本试验旨在通过异源表达获得地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CP-16的脂类水解酶,并探究其在羽毛降解过程中的作用。试验以地衣芽孢杆菌CP-16基因组DNA为模板,扩增脂类水解酶基因,转化入大肠杆菌中表达,获得重组酶L-4。研究重组酶L-4的适宜p H、p H稳定性、适宜温度、温度稳定性以及有机溶剂和金属离子对其相对活性的影响,同时探究其对角蛋白酶K水解天然羽毛角蛋白的作用。结果显示,获得的脂类水解酶基因大小为747 bp,编码248个氨基酸,在大肠杆菌中成功表达出重组酶L-4,其分子质量约为28.3 ku,酯酶活性为0.42 U/m L,适宜p H为6.5,适宜温度为50℃;在p H 6.5~9.5条件下处理30 min相对活性保持80%以上,在低于50℃温度条件下处理30 min相对活性保持70%以上。二价铁离子(Fe^(2+))、钠离子(Na^+)、锰离子(Mn^(2+))、钙离子(Ca^(2+))对重组酶L-4相对活性具有激发作用,钡离子(Ba^(2+))、锌离子(Zn^(2+))、铜离子(Cu^(2+))、镍离子(Ni^(2+))对重组酶L-4相对活性具有抑制作用。当有机溶剂浓度为30%时,重组酶L-4在二甲基亚砜(DMSO)和甲醇中保存97%和85%的相对活性,在丙酮、乙醇中保存45%以上的相对活性,在异丙醇中保存不到20%的相对活性,而在乙腈中相对活性基本完全丧失。用重组酶L-4预处理天然羽毛底物,可提高角蛋白酶K对底物的水解效率,促进率为4.32%。由此可见,脂类水解酶可降解羽毛表层脂质,可在促进角蛋白酶水解羽毛角蛋白中发挥作用。

关键词：地衣芽孢杆菌脂类水解酶角蛋白羽毛脂质克隆表达

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角蛋白降解菌地衣芽孢杆菌CP-16脂类水解酶的研究

角蛋白降解菌地衣芽孢杆菌CP-16脂类水解酶的研究

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作者：李爽中国农业科学院

学位级别：硕士

家禽羽毛富含角蛋白是一种丰富的蛋白质资源,因其组成与结构的特殊性难于被动物消化利用。羽毛表层覆盖致密的疏水脂质层,形成羽毛与外界环境物质接触的屏障。内层为富含大量二硫键、氢键、疏水基团,结构稳定、不易降解的角蛋白。破坏... 详细信息

家禽羽毛富含角蛋白是一种丰富的蛋白质资源,因其组成与结构的特殊性难于被动物消化利用。羽毛表层覆盖致密的疏水脂质层,形成羽毛与外界环境物质接触的屏障。内层为富含大量二硫键、氢键、疏水基团,结构稳定、不易降解的角蛋白。破坏羽毛表层脂质,增加蛋白酶与角蛋白结合,可加快羽毛降解速度。本论文通过对羽毛高效降解菌株地衣芽孢杆菌(***)CP-16脂类水解酶对羽毛表层脂质水解的研究,探究脂类水解酶与角蛋白酶协同关系及其在微生物降解角蛋白中的作用。*** CP-16脂类水解酶基因在大肠杆菌中表达。在Uniprot中搜集***中脂类水解酶的3个酶蛋白核酸序列,根据序列设计引物,以*** CP-16基因组DNA为模板,扩增脂类水解酶基因L-4,L-6,L-7,大小分别为747 bp,783 bp,897 bp。成功构建载体pET-22b-L-4、pET-22b-L-6、pET-22b-L-7。在大肠杆菌中表达、纯化,获得3种重组酶蛋白。重组酶L-4、L-6、L-7酶学性质研究。重组酶L-4的最适pH为6.5,最适温度为50℃,在pH 6.5.5、温度低于55℃的范围内酶活稳定,Fe、Na、Mn、Ca(10 mmol/L)对其活性有促进作用。该酶在甲醇和二甲基亚砜(DMSO)中保存,活性可保留85%、97%,但其它有机溶剂的抑制作用明显。重组酶L-6的最适pH为7.5,最适温度为45℃,pH稳定性和温度稳定性相对较差,Zn、Cu、Fe(10 mmol/L)对酶活性有明显的抑制作用,其他金属离子对酶活性无影响。该酶在甲醇和DMSO中活性可保留69%、61%。重组酶L-7的最适pH为6.0,最适温度为50℃,pH稳定性和温度稳定性均与L-4基本一致,Fe、Mg、Mn、Ba(10 mmol/L)对酶活性具有促进作用,在DMSO中活性无损失。脂类水解酶基因L-4、L-7在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其应用。对两种酶学性质较好的脂类水解酶基因进行优化,构建了野生型(pPICZαA-PL-4、pPICZαA-PL-7)和优化型(pPICZαA-PL-4-opt、pPICZαA-PL-7-opt)4种质粒,经限制性内切酶SacI线性化后电转化入毕赤酵母X-33。优化后二者酶活分别提高了38.09%,12.16%。对优化后重组酶PL-4-opt,PL-7-opt制备冻干粉,酯酶酶活分别为1.42 U/g、37.85 U/g,脂肪酶酶活分别为85.26 U/g、213.16U/g。重组酶PL-4-opt,PL-7-opt预处理天然羽毛底物,促进角蛋白酶K对底物的水解作用,促进率分别为4.32%、19.30%。脂类水解酶降解羽毛表层脂质,提高角蛋白酶水解羽毛角蛋白的效率。

关键词：地衣芽孢杆菌羽毛脂质角蛋白脂类水解酶异源表达

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