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生物工程学报 2016年第11期32卷 1539-1548页

作者：娄菲李宁赵玉姣果士婷王智文陈涛天津大学化工学院教育部系统生物工程重点实验室天津300072 天津化学化工协同创新中心天津300072

苹果酸是一种重要的C4二羧酸,在食品、医药、化工等领域有广泛的应用。本文主要研究羧化途径强化及苹果酸酶失活对大肠杆菌好氧发酵生产苹果酸的影响。首先在大肠杆菌E2中过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc,得到菌株E21,苹果酸积... 详细信息

苹果酸是一种重要的C4二羧酸,在食品、医药、化工等领域有广泛的应用。本文主要研究羧化途径强化及苹果酸酶失活对大肠杆菌好氧发酵生产苹果酸的影响。首先在大肠杆菌E2中过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc,得到菌株E21,苹果酸积累量从0.57 g/L提高到3.83 g/L。随后,分别过表达来自谷氨酸棒杆菌的丙酮酸羧化酶基因pyc和来自琥珀酸放线杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸激酶pck基因,相应的工程菌株E21(pTrcpyc)和E21(pTrc-A-pck)分别产6.04和5.01 g/L苹果酸,得率分别达到0.79和0.65 mol/mol葡萄糖。敲除E21中的苹果酸酶基因mae A和mae B,苹果酸产量也显著提高了36%,达到5.21 g/L,得率为0.62 mol/mol。然而,在过表达pyc的基础上敲除苹果酸酶基因并不能进一步提高苹果酸的产量。经过摇瓶发酵条件的初步优化,菌株E21(pTrcpyc)生产12.45 g/L苹果酸,得率为0.84 mol/mol,达到理论得率的63.2%。

关键词：大肠杆菌代谢工程苹果酸苹果酸酶羧化途径

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增强谷氨酸棒状杆菌羧化途径对有机酸产量的影响

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武汉科技大学学报 2021年第2期44卷 112-118页

作者：陈俊曹阳汪定奇李娟娟易梦凡周卫吴晓琴武汉科技大学化学与化工学院湖北武汉430081

以谷氨酸棒状杆菌CZ04为出发菌株,利用pK19mobsacB载体的反向筛选,通过在ppc和pyc基因前面敲入超氧化物歧化酶基因启动子(P sod),相应获得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)上调的重组菌株CZ05和丙酮酸羧化酶(PYC)上调的重组菌株CZ06以及PPC... 详细信息

以谷氨酸棒状杆菌CZ04为出发菌株,利用pK19mobsacB载体的反向筛选,通过在ppc和pyc基因前面敲入超氧化物歧化酶基因启动子(P sod),相应获得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)上调的重组菌株CZ05和丙酮酸羧化酶(PYC)上调的重组菌株CZ06以及PPC、PYC双上调的重组菌株CZ07,并研究了增强谷氨酸棒状杆菌羧化途径对有机酸产量的影响。结果表明,强启动子的敲入,对菌株生长没有明显影响,但增强了谷氨酸棒状杆菌的羧化代谢途径,能促进转基因菌株中有机酸的生成和积累。

关键词：谷氨酸棒状杆菌超氧化物歧化酶基因启动子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶羧化途径有机酸产量

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增大罐压提高脱氮假单胞菌发酵生产维生素B_(12)的产量

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微生物学通报 2012年第3期39卷 309-317页

作者：刘玉伟王建王泽建黄明志华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室国家生化工程技术研究中心(上海) 上海200237

【目的】提高发酵罐的罐压,增加维生素B12的产率。【方法】利用常规代谢通量分析(MFA)方法,对脱氮假单胞菌生产维生素B12的发酵过程进行研究。【结果】发现随着VB12合成速率的加快,磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化生成草酰乙酸(OAA)的通量明... 详细信息

【目的】提高发酵罐的罐压,增加维生素B12的产率。【方法】利用常规代谢通量分析(MFA)方法,对脱氮假单胞菌生产维生素B12的发酵过程进行研究。【结果】发现随着VB12合成速率的加快,磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化生成草酰乙酸(OAA)的通量明显加大,以满足维生素B12合成对前体的需求。根据该分析结果,对发酵工艺进行了改进,即在脱氮假单胞菌进入合成维生素B12阶段时,提高发酵罐的罐压,增加发酵液中二氧化碳的溶解度,从而强化了羧化回补途径。维生素B12的产率明显增加,发酵160 h的产物浓度为176 mg/L,比对照批次终浓度147 mg/L高出了19.7%。【结论】通过增大罐压提高了脱氮假单胞菌进入合成维生素B12的产量。

关键词：脱氮假单胞菌罐压羧化途径合成速率

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代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-苹果酸的研究

代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-苹果酸的研究

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作者：汪定奇武汉科技大学

学位级别：硕士

本研究以谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032为研究对象,通过代谢工程策略构建了高产L-苹果酸菌株,并结合启动子工程策略强化了磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸合成草酰乙酸的羧化途径,进一步提高了L-苹果酸产量。主要研究... 详细信息

本研究以谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032为研究对象,通过代谢工程策略构建了高产L-苹果酸菌株,并结合启动子工程策略强化了磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸合成草酰乙酸的羧化途径,进一步提高了L-苹果酸产量。主要研究结果如下:(1)构建L-苹果酸生产菌株。利用质粒pK19mobsacB建立了同源重组法敲除谷氨酸棒状杆菌基因的方法,通过连续敲除磷酸乙酰基转移酶-乙酸激酶编码基因pta-ack,乳酸脱氢酶编码基因ldh,丙酮酸醌氧化还原酶编码基因pqo和苹果酸酶编码基因male,阻断了丙酮酸合成乙酸和乳酸的代谢路径以及L-苹果酸回补丙酮酸路径,成功构建了L-苹果酸生产菌株A04。菌株A04经过发酵培养后可生产L-苹果酸7.448 g/L、丙酮酸6.704 g/L。(2)强化羧化途径提高L-苹果酸产量。通过替换自身强启动子Psod来过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc和丙酮酸羧化酶编码基因pyc,强化L-苹果酸合成路径中的羧化途径,提高流向L-苹果酸的碳通量,进一步提高菌株生产L-苹果酸的能力。最终,在初步优化的发酵实验条件下,L-苹果酸最大产量为14.932 g/L,产率为0.761 mol/mol葡萄糖。(3)ppc代谢路径和pyc代谢路径的比较。通过对菌株改造前后ppc、pyc酶活和有机酸产量、产率的分析,可以发现:在厌氧发酵时,ppc代谢路径和pyc代谢路径能通过合成草酰乙酸,进而合成L-苹果酸,其中ppc代谢路径的碳流量远大于pyc代谢路径的碳流量。且pyc代谢路径碳流量太小是菌株积累丙酮酸和阻碍菌株高效利用葡萄糖合成L-苹果酸的关键因素之一。

关键词： L-苹果酸基因敲除过表达羧化途径谷氨酸棒状杆菌

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