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群体感应淬灭酶AiiO的克隆表达及其发酵工艺优化

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大连工业大学学报 2023年第6期42卷 409-413页

作者：田唱郭婉萍陈阳赵晶陈明大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034 大连民族大学生命科学学院辽宁大连116600

群体感应淬灭酶AiiO具有降解信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)的活性,从而抑制病原菌的致病性。为提高AiiO表达量,构建了重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-aiiO,对其发酵生产AiiO过程中诱导温度、氮源质量浓度、诱导时... 详细信息

群体感应淬灭酶AiiO具有降解信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)的活性,从而抑制病原菌的致病性。为提高AiiO表达量,构建了重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-aiiO,对其发酵生产AiiO过程中诱导温度、氮源质量浓度、诱导时机和乳糖添加量进行了优化。结果表明,在诱导温度25℃、蛋白胨20g/L和酵母粉10g/L、发酵初始时添加乳糖、乳糖添加量为5g/L的优化条件下,胞内可溶性AiiO的表达量达到374.26mg/L。

关键词：群体感应淬灭酶克隆表达发酵工艺优化

基于转录组学的副溶血性弧菌生物被膜调控机制及群体感应淬灭酶AiiA对其生物被膜抑制作用的研究

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基于转录组学的副溶血性弧菌生物被膜调控机制及群体感应淬灭酶Ai...

作者：王秋钰上海海洋大学

学位级别：硕士

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种嗜盐型革兰氏阴性致病菌,能够在生物及非生物表面形成生物被膜,可能引起人恶心、呕吐、腹泻等肠胃炎反应及食物中毒等症状,严重的可能引发败血症进而导致死亡。生物被膜是被自身分泌的... 详细信息

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种嗜盐型革兰氏阴性致病菌,能够在生物及非生物表面形成生物被膜,可能引起人恶心、呕吐、腹泻等肠胃炎反应及食物中毒等症状,严重的可能引发败血症进而导致死亡。生物被膜是被自身分泌的胞外聚合物所包裹的特殊结构,抗生素敏感性低,给水产养殖和人类健康造成严重威胁。本研究以副溶血性弧菌ATCC33847为研究对象,首先,探究了VP游离态和生物被膜态不同时间下的生长情况,通过平板计数法、结晶紫染色法、扫描电镜(SEM)、共聚焦显微镜(CLSM)和胞外聚合物(EPS)测定;在此研究的基础上,选取25℃下培养36 h的浮游菌和生物被膜菌进行转录组测序(RNA-seq),通过分析差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),进行基因本体(GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,发现双组分信号传导系统(Two-component regulatory system,TCS)和群体感应(quorum sensing,QS)调控VP生物被膜的形成,影响细菌鞭毛的运动和胞外聚合物的分泌,QS与ABC转运系统相互作用,并于TCS存在正调控关系;此外,构建群体感应淬灭酶AiiA的重组蛋白载体,并进行表达和纯化,探究了AiiA酶对非生物表面生物被膜的抑制作用,通过结晶紫染色法和共聚焦显微镜观察对生物被膜的抑制作用。本研究初步探究了影响VP生物被膜的调控机制及为抑制其生物被膜形成提供了一个新的方法,为后续探究治疗细菌感染的新方法及解决细菌耐药性提供了理论基础和一定的技术支撑。本文的研究内容及研究结果如下:1.副溶血性弧菌游离态和生物被膜态的生物学特征研究。该实验以游离态和生物被膜态的VP为研究对象,菌液和含3%Na Cl的TSB培养基以1:99的比例于25℃下进行培养,通过平板计数法对活菌进行计数,发现浮游菌在10～18 h快速生长至约8 log CFU/m L,在23～24h时趋于稳定至约9 log CFU/m L,生物被膜菌先增加后减小,在36 h时活菌数最高至约8.4 log CFU/m L,通过结晶紫染色法观察生物被膜菌的形成量,36 h时生物被膜量最大(OD=2.36),与平板计数结果趋势一致。通过SEM观察浮游菌和生物被膜菌的形态变化和差异,培养后期菌体均有破损和凹陷,生物被膜菌出现山峰状的立体结构。通过CLSM观察在不同时期形成的生物被膜的三维立体结构,VP于36 h形成厚且致密的成熟生物被膜,36 h后开始分散。最后通过苯酚-硫酸法和Lowry蛋白质分析试剂盒分析生物被膜的胞外多糖和胞外蛋白,得出胞外多糖和胞外蛋白有利于生物被膜的形成的结论。结果表明,VP游离态和生物被膜态生长过程存在差异。2.副溶血性弧菌游离态和生物被膜态的转录组分析。收集于25℃下培养的游离态和生物被膜态的VP,分别提取其RNA后进行文库构建和转录组测序,以Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633(NCBI accession:NC＿004603.1)基因组作为参考基因组对测序数据进行分析,与参考基因组的比对率分别为95.4514%和94.3078%,鉴定DEGs,结果共956个差异基因表达,并进行GO和KEGG富集分析,共注释到30个pathway类别,分析与生物被膜形成相关的调控机制。MCP和Rpo Z正调控VP TCS系统,σ因子在特定TCS双组分系统条件下负调控QS,都与细菌的鞭毛相关。发现QS和TCS双组分系统存在正调控关系,共同调控生物被膜的形成,QS与ABC转运相互作用,通过影响胞外多糖和胞外蛋白质促进生物被膜形成。36 h时,不同的调控机制根据环境和自身变化分泌不同的信号来抑制或促进生物被膜的形成,维持细菌稳定的生长环境,此时VP的QS是opa R依赖性的,在细菌高密度环境下抑制生物被膜的形成,同时QS与TCS和ABC转运系统相互作用,促进生物被膜的形成和成熟。3.群体感应淬灭酶表达纯化及其对副溶血性弧菌生物被膜的影响。本实验以能产群体感应淬灭酶的芽孢杆菌A24为模板,选用以卡那霉素为抗性基因的p ET28b载体进行质粒筛选,构建芽孢杆菌AiiA蛋白重组表达载体,选用大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株,成功表达出高丝氨酸内酯酶AiiA。AiiA酶对群体感应信号分子AHL具有降解作用,抑制群体感应效应,有效抑制VP生物被膜的形成。

关键词：副溶血性弧菌生物被膜转录组测序双组分传导系统群体感应淬灭酶

群体感应淬灭酶克隆表达及其对铜绿假单胞菌的影响

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微生物学通报 2019年第11期46卷 2927-2932页

作者：张宝王志航储卫华中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京210009 中国药科大学药学院江苏南京210009

【背景】由于抗生素的大量使用,导致细菌耐药性越来越强,寻找新的抗细菌感染药物成为研究热点。【目的】克隆表达群体感应淬灭酶,探究其对铜绿假单胞菌毒力及致病性的影响。【方法】利用PCR技术从产群体感应淬灭酶的芽孢杆菌QSI-1基因组... 详细信息

【背景】由于抗生素的大量使用,导致细菌耐药性越来越强,寻找新的抗细菌感染药物成为研究热点。【目的】克隆表达群体感应淬灭酶,探究其对铜绿假单胞菌毒力及致病性的影响。【方法】利用PCR技术从产群体感应淬灭酶的芽孢杆菌QSI-1基因组DNA中克隆出aiiA基因,将其克隆到表达载体pET30a并导入大肠杆菌***21(DE3)中进行诱导表达,通过镍柱亲和层析获得纯化的N-酰基高丝氨酸内酯酶。用不同浓度的淬灭酶作用于铜绿假单胞菌,检测其对铜绿假单胞菌毒力因子产生以及生物膜形成能力的影响;以秀丽隐杆线虫为模型,考察其对线虫感染铜绿假单胞菌存活率的影响。【结果】克隆表达出群体感应淬灭酶,该酶能显著抑制铜绿假单胞菌毒力因子产生和生物膜的形成,并能降低铜绿假单胞菌对感染线虫的致死率。【结论】群体感应淬灭酶可作为一种能高效抑制细菌致病性的物质,为临床治疗细菌性感染提供新的策略。

关键词：群体感应淬灭酶铜绿假单胞菌毒力因子生物膜秀丽隐杆线虫

群体感应淬灭酶YtnP对草鱼肠道菌群结构的影响

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南方农业学报 2020年第11期51卷 2817-2826页

作者：赵祯肖翎戚建华刘韵怡王年郁小娟宋增福水产科学国家级实验教学示范中心(上海海洋大学) 上海201306 水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心(上海海洋大学) 上海201306 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室(上海海洋大学) 上海201306

【目的】揭示群体感应淬灭作用与宿主肠道菌群结构间的作用关系,为具有群体感应淬灭作用益生菌及其淬灭酶在水产养殖上的推广应用提供理论依据。【方法】选取30尾规格为25±1 g/尾的草鱼随机分为对照组和试验组,试验组每尾草鱼腹腔注射... 详细信息

【目的】揭示群体感应淬灭作用与宿主肠道菌群结构间的作用关系,为具有群体感应淬灭作用益生菌及其淬灭酶在水产养殖上的推广应用提供理论依据。【方法】选取30尾规格为25±1 g/尾的草鱼随机分为对照组和试验组,试验组每尾草鱼腹腔注射100μL溶解稀释后的YtnP(25μg/mL),对照组每尾草鱼腹腔注射等量的300 mmol/L分子筛缓冲液,分别在注射后24和48 h采集草鱼前肠、中肠和后肠的肠道组织及内容物,提取各肠段总DNA及PCR扩增16S rRNA序列V3~V4可变区,然后基于Illumina MiSeq高通量测序技术分析外源添加YtnP对草鱼肠道菌群多样性与丰度的影响。【结果】12份草鱼肠道样品测序共获得原始序列(Raw reads)660205条,有效序列(Valid reads)416614条;对照组和试验组样品的OTU数目分别为142±102和143±67个。在门分类水平上,对照组和试验组草鱼肠道优势菌群均为放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes);相对于对照组,试验组草鱼肠道中浮霉菌门(Planctomycetes)相对丰度显著增加(P0.05,下同),厚壁菌门、TM7和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度则呈下降趋势。在属分类水平上,对照组和试验组草鱼肠道均以鲸杆菌属(Cetobacterium)和诺卡氏菌属(Nocardia)为优势菌群;相对于对照组,试验组草鱼肠道中鲸杆菌属相对丰度呈升高趋势、诺卡氏菌属相对丰度呈下降趋势,但变化差异均不显著,未特指微杆菌属(UnspecifiedMicrobacteriaceae)相对丰度则显著增加。草鱼肠道菌群结构Alpha多样性分析发现,试验组样品的Chao1和ACE指数低于对照组样品,Shannon和Simpson指数略高于对照组样品,但差异均不显著;Beta多样性分析结果显示,对照组与试验组间的菌群特点存在差异,且组间区分效果明显。【结论】外源添加YtnP不会导致草鱼肠道优势菌群种类发生明显变化,但能在一定程度影响肠道菌群的相对丰度。

关键词：草鱼群体感应淬灭酶 YtnP 肠道菌群微生态平衡

群体感应淬灭酶YtnP对草鱼肠道菌群多样性及免疫响应调控作用的研究

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群体感应淬灭酶YtnP对草鱼肠道菌群多样性及免疫响应调控作用的研...

作者：赵祯上海海洋大学

学位级别：硕士

群体感应及其淬灭作用是近年来在微生态领域最为重要的发现之一。微生物间通过群体感应与淬灭作用建立细胞-细胞间的通讯连接,并在微生物间生态竞争与动态平衡中发挥重要作用。目前群体感应淬灭已经成为抗细菌感染研究的热点领域。然而... 详细信息

群体感应及其淬灭作用是近年来在微生态领域最为重要的发现之一。微生物间通过群体感应与淬灭作用建立细胞-细胞间的通讯连接,并在微生物间生态竞争与动态平衡中发挥重要作用。目前群体感应淬灭已经成为抗细菌感染研究的热点领域。然而生物体是一个整体系统,微生物与宿主间存在复杂的相互作用关系。群体感应淬灭机制在发挥抗菌作用的同时,对肠道微生态系统的作用规律尚未知晓,亟需进行科学的研究与评价。本论文通过高通量测序与宏基因组技术,研究了外源添加群体感应淬灭酶YtnP对草鱼肠道菌群多样性及其相关功能基因的影响,揭示了群体感应淬灭作用与宿主肠道菌群间的相互关系,为其在水产养殖上应用提供理论依据。1.单一添加群体感应淬灭酶YtnP对草鱼肠道菌群的作用规律选取30条体重25±1g的草鱼随机分为两组,每组三个平行,试验组注射体积100μL浓度为25μg/m L的的重组纯化YtnP,进行了周期48h的急性试验。在试验的24 h、48 h分别采取草鱼肠道及内容物进行16S r RNA测序。结果表明对照组和试验组样品的OTU分别为142±102和143±67;试验组肠道菌群的Alpha多样性指数差异均不显著（P＞0.05）;Beta多样性分析显示对照组与试验组间菌群特点存在差异。此外,在门分类水平上两组优势菌群均为放线菌门、梭杆菌门、变形菌门,且试验组浮霉菌门（P＜0.05）丰度显著增加;属分类水平上两组优势菌群均为鲸杆菌属、诺卡氏菌属,且试验组微杆菌属（P＜0.05）丰度显著增加。2.草鱼感染嗜水气单胞菌条件下,YtnP对草鱼肠道菌群影响的时空变化规律选取300条体重28±2g的草鱼随机分成空白对照组（Contr组）、阴性对照组嗜水气单胞菌组（AH组）、阳性对照群体感应淬灭组（YtnP组）和试验共感染组（AY组）四个组,每组三个平行,分别注射体积为100μL的缓冲液（50%PBS,50%分子筛）、浓度为3×106CFU/m L *** ATCC7966、浓度为25μg/m L YtnP以及AH和YtnP的混合液,在试验的第1天、3天、5天、7天分别采取草鱼肠道样品进行16S r RNA测序,并将第3天的样品进行宏基因组测序。结果显示各试验组Alpha多样性无显著差异（P＞0.05）,Beta多样性主坐标分析（Pco A）显示各组间菌群存在显著差异（P＜0.05）。在门分类水平上,组间丰度时空变化规律为:（1）YtnP组变形菌门先减后增,放线菌门、梭杆菌门先增后减;酸杆菌门、蓝细菌门显著递增（P＜0.05）,且变形菌门、中肠厚壁菌门总体丰度显著增加（P＜0.05）;（2）AY组变形菌门先增后减,放线菌门、梭杆菌门、浮霉菌门先减后增。在属分类水平上:（1）YtnP组第5天气单胞菌属显著降低,弧菌属显著递减;红球菌属总体显著增加（P＜0.05）;（2）AY组第5天气单胞菌属显著降低;乳酸杆菌属第7天显著增加,红球菌属总体显著增加（P＜0.05）。LEfse分析显示组间所有层级有显著性差异的物种（biomarker）（P＜0.05）,且AY组优势物种最多。PICRUSt 2分析了菌群功能/基因家族的变化（置信区间95%,P＜0.05）,结果显示:（1）YtnP组显著上调了溶菌酶、抗毒素（Hig A,maz E）等功能;（2）AY组显著上调了肠杆菌素（enterobactin）的生物合成及邻苯二酚（Catechol）的降解等功能。此外,宏基因组测序分析显示AY相比AH组显著上调了37个Unigene（P＜0.05）,且与肠道-共生菌的稳态有关。***对草鱼机体免疫应答的时空变化规律对照组、AH组、YtnP组和AY组注射后的第1天、3天、5天、7天分别采取肠道、头肾、脾脏,提取RNA逆转录为c DNA,测定相关免疫因子的变化;（1）肠道组织样品分析结果显示,AY组第1天显著上调IFN-γ1（P＜0.05）,AY、YtnP组第5天均显著上调多功能因子IL-15、IL-6的表达（P＜0.05）,而AH组各时间段主要抑制其表达（P＜0.05）;三组均能显著上调促炎因子IL-1β、TNF-α的表达（P＜0.05）,而7天时YtnP抑制TNF-α的表达;此外第1、3天AY组和YtnP组可以显著上调抑炎因子IL-10（P＜0.05）;（2）头肾组织样品分析结果显示,YtnP组IFN-γ1、I L-15均先上调后下调,AY组则抑制其表达;AH组能显著上调促炎因子IL-1β、T NF-α的表达,而AY抑制其表达（P＜0.05）;第3天,YtnP可以显著上调抑炎因子I L-10（P＜0.05）;（3）脾脏组织样品分析结果显示,三组IL-6均呈现出显著上调的趋势,第5天AY组可以显著抑制其表达;三组IL-15均先下调后上调;三组均能显著上调促炎因子IL

关键词：群体感应淬灭酶 YtnP 嗜水气单胞菌肠道菌群免疫调节

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细菌群体感应淬灭酶的研究进展

微生物学通报 2006年第4期33卷 139-143页

作者：邱健贾振华李承光马宏宋水山张霞冀营光河北工业大学化工学院生物工程系天津300130 河北省生物研究所石家庄050051

细菌的群体感应系统(Quorum sensing,QS)参与许多生物学功能的调控,其中包括动植物病原细菌致病因子的生成以及人类某些病原细菌生物膜的形成。酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)是调控群体感应系统的关键信号分子。近年... 详细信息

细菌的群体感应系统(Quorum sensing,QS)参与许多生物学功能的调控,其中包括动植物病原细菌致病因子的生成以及人类某些病原细菌生物膜的形成。酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)是调控群体感应系统的关键信号分子。近年的研究表明,不同生物体包括细菌和真核生物中都存在类别不同的能够降解AHL的群体感应淬灭酶(Quorum-quenching enzyme)。在AHL依赖型致病菌和转基因植物中表达AHL降解酶能有效地抑制QS信号分子的积累,从而阻断了病原细菌的发病机制,提高了植物的抗病性。这些新颖的群体感应淬灭酶的发现,不仅为防治细菌侵染提供了可行的途径,也对研究它们在宿主中的功能和对生态系统的潜在影响提出挑战。

关键词：群体感应群体感应淬灭酶 AHL内酯酶 AHL酰基转移酶对氧磷酶信号干扰

盐单胞菌Fosmid文库构建及群体感应淬灭酶的筛选

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江苏农业科学 2016年第10期44卷 88-88,89,90,91页

作者：薛鹏飞柳鹏福史吉平李丽霞烟台大学生命科学学院山东烟台264005 中国科学院上海高等研究院绿色化学工程技术研究中心上海201210

通过构建盐单胞菌Fosmid基因组文库,以求筛选到群体感应淬灭酶(AHL降解酶)。采用改良的SDSCTAB法提取1株盐单胞菌基因组DNA,经平末端连接、包装和转染后,成功构建盐单胞菌Fosmid基因组文库。该文库库容1 700个克隆,平均插入片段约35 kb... 详细信息

通过构建盐单胞菌Fosmid基因组文库,以求筛选到群体感应淬灭酶(AHL降解酶)。采用改良的SDSCTAB法提取1株盐单胞菌基因组DNA,经平末端连接、包装和转染后,成功构建盐单胞菌Fosmid基因组文库。该文库库容1 700个克隆,平均插入片段约35 kb,共包含约60 Mb的DNA容量,覆盖该菌基因组10倍以上。然后以加X-gal的MM基本培养基筛选AHL降解酶阳性克隆,对文库进行功能驱动的蓝白斑筛选。通过初筛,筛选到3个Fosmid阳性克隆,证实了所构建的Fosmid基因组文库能够应用于AHL降解酶的活性筛选。同时该Fosmid文库亦可进一步用于其他功能基因的开发。

关键词：盐单胞菌 Fosmid基因组文库蓝白斑筛选群体感应淬灭酶

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群体感应淬灭酶AiiA发酵工艺优化

轻工科技 2018年第8期34卷 18-19,31页

作者：王照迪王硕黄锦张航李博赵晶大连民族大学生命科学学院辽宁大连116600

群体感应淬灭酶Aii A具有降解微生物信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)的活性。利用重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-p ET-28a-aii A表达Aii A并优化其发酵工艺。对发酵过程中乳糖诱导时机和诱导浓度进行优化,在发酵初始时添加乳... 详细信息

群体感应淬灭酶Aii A具有降解微生物信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)的活性。利用重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-p ET-28a-aii A表达Aii A并优化其发酵工艺。对发酵过程中乳糖诱导时机和诱导浓度进行优化,在发酵初始时添加乳糖进行诱导、乳糖诱导浓度为5g/L的情况下,细胞中可溶性目的蛋白Aii A浓度达215.72μg/m L。Aii A的发酵工艺优化为新型生物抑菌剂的生产提供了实验依据。

关键词：群体感应淬灭酶 Aii A 发酵工艺乳糖诱导

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含细菌群体感应淬灭酶的菌种筛选和鉴定

含细菌群体感应淬灭酶的菌种筛选和鉴定

作者：邱健河北工业大学

学位级别：硕士

细菌的群体感应系统(Quorum sensing,QS)参与许多生物学功能的调控,其中包括动植物病原细菌致病因子的产生以及人类某些病原细菌生物膜的形成。酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)是调控群体感应系统的关键信号分子。近年... 详细信息

细菌的群体感应系统(Quorum sensing,QS)参与许多生物学功能的调控,其中包括动植物病原细菌致病因子的产生以及人类某些病原细菌生物膜的形成。酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)是调控群体感应系统的关键信号分子。近年的研究证明,不同生物体包括细菌和真核生物中都存在类别不同的酰基高丝氨酸内酯降解酶。在AHL依赖型致病菌和转基因植物中AHL降解酶能有效地抑制QS信号分子的积累,从而阻断病原细菌的发病机制,提高了植物的抗病性。这些新颖的群体感应淬灭酶的发现,不仅为防治细菌侵染提供了可行的途径,也对研究它们在宿主中的作用和对生态系统的潜在影响提出挑战。本实验利用酰基高丝氨酸内酯为菌株生长的唯一的碳源和能源,筛选得到两株能够降解AHL的菌株X1和R1。对其进行生理生化鉴定和16SrDNA、18SrDNA分子水平鉴定,菌株X1为细菌,属于黄单胞菌属;菌株R1为酵母菌,属于红冬孢酵母菌属,菌株R1构建的系统发育树显示菌株R1与Rhodosporidium toruloides聚为一群,相似性高达99.9%。并研究了两菌株的最适生长条件及其对不同AHL的降解特性,最适生长温度为28-30℃,最适pH值为7.5左右。对两株菌利用不同碳源的情况进行研究显示,随着不同碳源酰基侧链碳原子个数的增长,菌株X1和R1在相同的培养时间总菌体数都呈线性增加。它们的粗酶液也都具有很强的AHL降解能力,且菌株R1的能力要优于菌株X1。菌株对欧文氏胡萝卜软腐致病菌的拮抗研究表明,无论是菌株X1和R1的菌液本身还是菌株的粗酶液,对致病菌都具有拮抗作用,都能比较明显的抑制软腐病病害。

关键词：群体感应 N-酰基高丝氨酸内酯群体感应淬灭酶 16SrDNA 18SrDNA 系统发育