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作者：吴自豪塔里木大学

学位级别：硕士

大肠杆菌(Escherichia coli)是一种条件性致病菌,可引起人和动物腹泻、脑膜炎和乳腺炎等疾病。大肠杆菌可通过动物和动物性食品在人畜间进行交叉传播,被污染的肉类食品是其常见传播媒介之一。阿克苏市作为我国羊养殖、供应和消费的主要... 详细信息

大肠杆菌(Escherichia coli)是一种条件性致病菌,可引起人和动物腹泻、脑膜炎和乳腺炎等疾病。大肠杆菌可通过动物和动物性食品在人畜间进行交叉传播,被污染的肉类食品是其常见传播媒介之一。阿克苏市作为我国羊养殖、供应和消费的主要地区之一,为了解该地区羊源大肠杆菌的潜在危害,本研究对阿克苏地区某屠宰场羊源大肠杆菌的分子分型、耐药性和毒力基因等情况展开调查。研究发现,大肠杆菌在亚致死浓度抗生素的作用下会形成一种耐药性强且感染持久的小菌落变异体(Small colony variants,SCVs),对公共卫生和食品安全构成潜在威胁。目前尚缺乏羊源大肠杆菌SCVs的相关报道,本研究对羊源大肠杆菌SCVs进行自然筛选和药物诱导,比较分析其与野生株的生物学特性差异,结合基因组数据初步分析其形成原因。主要研究结果如下:(1)阿克苏市某屠宰场羊源大肠杆菌分子分型、耐药性和毒力基因检测:从57只新鲜屠宰的绵羊胴体、胆汁、粪便和肠系膜淋巴结中分离得到91株大肠杆菌,对其进行分子分型、耐药性、生物被膜形成能力和毒力基因检测。结果表明,91株大肠杆菌的系统发育群分属于A群(52.75%)和B1群(47.25%);LPS核心型的优势型为R3(43.96%),R1(28.57%)型次之,K12(17.58%)、R2(5.49%)和R4(4.4%)型的检出率较低;大部分菌株(63.74%)具有生物被膜形成能力。分离株对青霉素G(90.11%)、复方新诺明(51.65%)、四环素(42.86%)、氟苯尼考(27.47%)和阿米卡星(21.98%)具有不同程度的耐药性,多重耐药菌株的检出率为41.76%;携带Ⅰ型整合子int-I(59.34%)基因和blaTEM(84.62%)、aphA1(63.74%)、tetA(42.86%)等多种耐药基因;此外,还携带编码志贺毒素的Stx1(7.69%)和编码脑血管内皮细胞侵袭素的ibe B(60.44%)等多种毒力基因。(2)羊源大肠杆菌及其SCVs生物学特性和基因组分析:从羊胆汁中分别分离出1株野生株和硫辛酸依赖型SCV(LA-SCV),野生株经阿米卡星诱导形成1株血红素依赖型SCV(HD-SCV)。随后对野生株和2株SCVs的生理生化、培养特性、耐药性、溶血活性、生物被膜形成、运动性和代谢等生物学特性进行比较分析,结合基因组数据初步分析SCVs形成原因。结果显示,与野生株相比,SCVs在生理生化和培养特性等方面存在较大差异,SCVs耐药性、溶血活性和生物被膜形成能力显著增强(P羊源大肠杆菌耐药情况严重,携带多种毒力基因,对食品安全构成潜在威胁。羊源大肠杆菌SCVs的生物学特性与野生株相比有较大差异,可能会给大肠杆菌致病性和耐药等方面的防治带来更大挑战。

关键词：羊源大肠杆菌耐药性毒力基因小菌落变异体生物学特性基因组分析

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羊源大肠杆菌对氨基糖苷类药物耐药表型及耐药基因的检测

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中国兽医学报 2020年第8期40卷 1566-1570页

作者：顾晓晓邬琴陶乔孝慈马雪李劼周霞韩猛立黄新吴桐忠张星星钟发刚石河子大学动物科技学院新疆石河子832003 新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室新疆石河子832000

(无菌采集绵羊粪便,采用细菌常规分离鉴定结合16S rRNA PCR扩增的方法分离鉴定大肠杆菌,应用K-B药敏纸片的方法研究分离的大肠杆菌耐药表型及PCR方法检测全部菌株氨基糖苷类耐药基因AadB、AadA1、Aac(3′)-Ⅱ、Aac(6′)-Ⅰb和Aph(3′)-... 详细信息

(无菌采集绵羊粪便,采用细菌常规分离鉴定结合16S rRNA PCR扩增的方法分离鉴定大肠杆菌,应用K-B药敏纸片的方法研究分离的大肠杆菌耐药表型及PCR方法检测全部菌株氨基糖苷类耐药基因AadB、AadA1、Aac(3′)-Ⅱ、Aac(6′)-Ⅰb和Aph(3′)-Ⅰ的携带情况。结果显示,共分离100株羊肠道正常菌群大肠杆菌,分离株对链霉素的耐药率最高,为24%,其次是新霉素、丁胺卡那、庆大霉素和卡那霉素,分别为21%,14%,13%,7%;AadA1和Aph(3′)-Ⅰ耐药基因的检出率分别为98%和89%,未检测到AadB、Aac(3′)-Ⅱ和Aac(6′)-Ⅰb基因。结果表明,新疆石河子市羊肠道正常菌群大肠杆菌对氨基糖苷类抗生素具有较为广泛的耐药性,耐药基因主要以AadA1和Aph(3′)-Ⅰ为主,本试验为羊致病性大肠杆菌耐药机理的进一步研究提供有用数据。

关键词：羊源大肠杆菌氨基糖苷类药物耐药性耐药基因

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新疆塔额垦区羊源大肠杆菌部分生物学特性研究及D-氨基酸作用的初探

新疆塔额垦区羊源大肠杆菌部分生物学特性研究及D-氨基酸作用的初...

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作者：王继学塔里木大学

学位级别：硕士

羊大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种急性、败血性传染病,可对养羊业造成重大经济损失。抗生素是治疗该病主要手段,但由于抗生素的不合理使用和细菌生物被膜形成等因素,严重影响了该病的防控。羊养殖是新疆塔额垦区的重要产业之一... 详细信息

羊大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种急性、败血性传染病,可对养羊业造成重大经济损失。抗生素是治疗该病主要手段,但由于抗生素的不合理使用和细菌生物被膜形成等因素,严重影响了该病的防控。羊养殖是新疆塔额垦区的重要产业之一,目前新疆塔额垦区羊大肠杆菌带菌情况尚缺乏相关数据。本研究自2022年1月至3月从新疆塔额垦区8个规模化羊养殖场采集腹泻羔羊粪便415份,进行大肠杆菌分离培养,对分离菌株的生物被膜形成能力、耐药基因、毒力基因及对小鼠的感染能力进行检测,并开展了D-氨基酸对大肠杆菌生物被膜形成的影响及D-氨基酸与抗生素联合使用对大肠杆菌抑制作用的研究。1.羊源致病性大肠杆菌的分子流行病学调查本研究从415份样本中,分离鉴定73株大肠杆菌,对菌株的系统发育群、大肠杆菌LPS核心型检测结果表明,73株大肠杆菌中以D群(30.13%)和B1群(42.46%)为优势种群,大肠杆菌LPS核心型以R1核心型(57.53%)为主。采用PCR方法检测73株大肠杆菌毒力基因,检测出13种毒力因子,其中Ⅰ型菌毛fim H检出率(100%)最高,mat、she、sod A、yijp、ibe B、csg A以及omp A等7种毒力因子检出率均超过80%以上。为了评价分离菌株的致病性,对携带多种毒力因子的菌株进行小鼠致病性试验,结果表明,携带多种毒力因子的9株大肠杆菌中有7株菌具有较强的致病性。对73株羊源大肠杆菌的药敏试验结果表明:除多粘菌素、亚胺培南、美罗培南和替加环素表现为敏感,其它12种药物耐药率为4%-67%。其中有35株菌为多重耐药菌株(47.94%)。耐药基因检测结果表明:喹诺酮类耐药基因检出率超过90%。β-内酰胺类耐药基因bla-TEM检出率高达75%,OXA-1、CXT-MU、tet A、tet M、Aph、aac’(6)-Ib、ant’(4)、oqx A、oqx B和mar A、sul1、sul2均有检出。采用结晶紫微量板法对73株大肠杆菌进行生物膜形成检测,有53株能形成生物被膜(72.6%),生物被膜形成能力强的菌株有23株(31.5%),中等菌株8株(10.95%),较弱菌株22株(30.1%),20株不形成生物被膜(27.39%)。2.D-氨基酸对大肠杆菌生物被膜的抑制作用本研究采用96孔结晶紫微量板法探究19种D-氨基酸对EC344-1和EC125-1两株菌的生物被膜形成的影响,结果表明,15mmol/m L的D-组氨酸、D-蛋氨酸、D-天冬酰胺-水物和D-酪氨酸,20mmol/m L的D-半胱氨酸、D-精氨酸、D-苏氨酸、D-丙氨酸和D-缬氨酸,25mmol/m L的D-苯丙氨酸,30mmol/m L的D-色氨酸和D-赖氨酸和D-亮氨酸,40mmol/m L的D-丝氨酸都能完全抑制大肠杆菌EC344-1的生物被膜形成。但15mmol/m L的D-酪氨酸,10mmol/m L的D-精氨酸和D-色氨酸,20mmol/m L的D-组氨酸和D-亮氨酸,30mmol/m L的D-丝氨酸,80mmol/m L的D-天冬氨酸可完全抑制大肠杆菌EC125-1的生物被膜形成。表明D-氨基酸具有较好的生物被膜抑制作用,但存在菌株差异性。3.抗生素与D-氨基酸联合使用减低大肠杆菌的药物耐受性采用棋盘法将D-蛋氨酸、D-亮氨酸、D-酪氨酸、D-色氨酸,分别与氟苯尼考、四环素、庆大霉素、阿莫西林进行组合,作用于大肠杆菌EC344-1。结果表明,阿莫西林与D-蛋氨酸、D-亮氨酸联用时,最小抑菌浓度从8μg/m L降低到了4μg/m L,与D-色氨酸联用时最小抑菌浓度从8μg/m L降低到了2μg/m L,与D-酪氨酸联用无影响。庆大霉素与4种D-氨基酸联用时最小抑菌浓度从16μg/m L降低到了2μg/m L。四环素与D-蛋氨酸、D-酪氨酸、D-色氨酸联用时最小抑菌浓度从8μg/m L降低到了4μg/m L,与D-亮氨酸联用时,最小抑菌浓度从8μg/m L降低到了2μg/ml。氟苯尼考与4种氨基酸联用时最小抑菌浓度从8μg/m L降低到了4μg/m L。本研究结果表明,抗生素与D-氨基酸联用时具有协同增效作用,大肠杆菌对抗生素的敏感性增强。本研究结果表明,73株大肠杆菌以D群和B1群为优势种群,LPS核心型以R1核心型为主。分离株携带多种毒力基因具有较强的致病性。分离菌株多重耐药率高且携带多种耐药基因,有72.6%的菌株具有产生生物膜的能力。D-氨基酸不仅能有效地抑制生物被膜的生长,与四环素、氟苯尼考、阿莫西林、庆大霉素的联合使用可有效提高对分离菌株的最小抑菌浓度,本研究可为新疆塔额垦区羊源大肠杆菌的防控提供参考。

关键词：新疆塔额垦区羊源大肠杆菌耐药性检测生物被膜 D-氨基酸

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