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罗汉果苷ⅴ对糖尿病状态小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制研究

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罗汉果苷Ⅴ对糖尿病状态小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机...

作者：罗诒财广西医科大学

学位级别：硕士

目的:通过构建糖尿病小鼠模型,分离培养糖尿病小鼠骨髓间充质干细胞,研究罗汉果苷ⅴ（Mogroside Ⅴ,MV）对糖尿病状态骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖与成骨分化的影响,探索其成骨机制与microRNA的关... 详细信息

目的:通过构建糖尿病小鼠模型,分离培养糖尿病小鼠骨髓间充质干细胞,研究罗汉果苷ⅴ（Mogroside Ⅴ,MV）对糖尿病状态骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖与成骨分化的影响,探索其成骨机制与microRNA的关系,以期为治疗糖尿病牙槽骨缺损提供新的思路和方法。方法:（一）选取SPF级3周龄雄性C57小鼠15只,体重15～18g,适应性喂养1周后随机挑选10只作为糖尿病组,另外5只作为正常组。糖尿病组用高糖高脂饲料喂养,正常组用普通饲料喂养,3周后糖尿病组小鼠腹腔注射1%链脲佐菌素注射液90 mg/kg诱导形成糖尿病,正常组注射等比例柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,再继续喂养3周,并每隔1周取尾静脉血检测空腹血糖,以空腹血糖≥11.1mmol/L并连续稳定3周者表示建模成功。建模成功后处死糖尿病组及正常组小鼠,分离股骨和胫骨,采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,糖尿病组BMSCs用H-DMEM完全培养基培养,正常组BMSCs用L-DMEM完全培养基培养。采用流式细胞术、成骨诱导及成脂诱导鉴定糖尿病组及正常组BMSCs。（二）取第三代糖尿病组BMSCs,用CCK8法检测在0～0.4 g/L不同浓度MV干预下对糖尿病状态BMSCs毒性及增殖活性的影响,并筛选出适宜的MV浓度用于后续实验。（三）取第三代正常组BMSCs,设立正常对照组,取第三代糖尿病组BMSCs,设立高糖组及MV+高糖组,正常对照组用低糖成骨诱导液、高糖组用高糖成骨诱导液、MV+高糖组用含适宜浓度MV+高糖成骨诱导液进行成骨诱导,7天后进行取培养液进行碱性磷酸酶定量分析,检测各组细胞培养液中碱性磷酸酶活力;成骨诱导7天后提取各组细胞RNA,荧光定量PCR检测成骨相关因子ALP、OCN及Runx2的m RNA相对表达量;成骨诱导14天后进行茜素红染色及定量分析,检测各组细胞成骨分化情况。（四）取第三代正常组BMSCs,设立正常对照组,取第三代糖尿病组BMSCs,设立高糖组和MV+高糖组,正常对照组用低糖成骨诱导液、高糖组用高糖成骨诱导液、MV+高糖组用含适宜浓度MV+高糖成骨诱导液进行成骨诱导,7天后提取总RNA进行micro RNA高通量测序。结果:（一）糖尿病组小鼠空腹血糖均>11.1mmol/L并持续稳定3周,表明成功建立糖尿病小鼠模型。流式细胞术显示,两组BMSCs表面标志物CD73、CD90阳性表达,阳性表达率95%以上,CD45、CD11b阴性表达,表达率1%以下,符合BMSCs表面标志物特征,BMSCs成骨诱导后可见钙化结节,成脂诱导后可见脂滴,以上结果表明所提取的细胞是骨髓间充质干细胞。（二）细胞毒性实验结果显示0～0.4g/L浓度范围内MV对高糖组BMSCs均未表现出毒性,细胞增殖活性实验显示MV浓度为6.25×10g/L时促细胞增殖活性最强,遂选取该浓度用于后续实验。（三）碱性磷酸酶定量分析结果显示,正常对照组培养液中碱性磷酸酶含量最高,MV+高糖组次之,高糖组最少,差异具有统计学意义（p果显示,与正常对照组相比,高糖组ALP、OCN及Runx2的m RNA相对表达量降低,差异具有统计学意义（p果显示,正常对照组钙结节数量最多,MV+高糖组次之,高糖组最少;茜素红染色定量检测结果显示,正常对照组钙盐沉积量最多,MV+高糖组次之,高糖组最少,差异具有统计学意义（p果显示,miR-486b-3p、miR-297b-3p和miR-673-3p在MV+高糖组vs.高糖组中表达差异显著,且这些miRNA的靶基因主要富集于PI3K-Akt信号通路。同时,miR-10b-5p在高糖组vs.正常对照组与MV+高糖组vs.高糖组中表达均有显著差异,其靶基因主要富集在代谢通路、肌动蛋白细胞骨架调节、细胞凋亡和钙信号通路。结论:（一）罗汉果苷V能促进糖尿病状态小鼠骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化。（二）miR-486b-3p、miR-297b-3p和miR-673-3p在罗汉果苷V促进糖尿病骨髓间充质干细胞成骨分化过程中起调控作用,其机制可能与PI3K-Akt信号通路被激活有关。同时,miR-10b-5p在这个过程中发挥间接调控作用,其机制可能与改善细胞糖代谢、促进细胞增殖和抑制炎症反应有关。

关键词：罗汉果苷ⅴ 糖尿病骨髓间充质干细胞成骨分化 microRNA

HPLC法测定罗汉果中罗汉果苷V和11-氧化罗汉果苷V

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中草药 2007年第2期38卷 196-198页

作者：周兢王梦月李晓波屠鹏飞王强中国药科大学中药分析教研室上海交通大学药学院上海200240 上海交通大学药学院北京大学医学部

目的建立HPLC法测定不同产地、不同栽培品系的罗汉果药材中罗汉果苷ⅴ和11-氧化罗汉果苷ⅴ。方法采用ODS（250mm×4．6mm，5μm）色谱柱，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，体积流量：0．75mL／min，检测波长：210nm，柱温：40℃。结果... 详细信息

目的建立HPLC法测定不同产地、不同栽培品系的罗汉果药材中罗汉果苷ⅴ和11-氧化罗汉果苷ⅴ。方法采用ODS（250mm×4．6mm，5μm）色谱柱，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，体积流量：0．75mL／min，检测波长：210nm，柱温：40℃。结果罗汉果苷ⅴ在0．8046～20．1150μg线性关系良好（r=0．9998），平均回收率为104．6％，RSD为3．28％（n=6）。11-氧化罗汉果苷ⅴ在0．5985～14．9625μg线性关系良好（r=0．9984）。结论本方法简便、快速、准确，可作为罗汉果药材的质量控制方法。

关键词：罗汉果罗汉果苷ⅴ 11-氧化罗汉果苷ⅴ 高效液相色谱

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半制备高压液相色谱法制备罗汉果苷ⅴ标准品

食品科学 2010年第12期31卷 137-140页

作者：宁德生梁小燕方宏姚崇辉广西壮族自治区-中国科学院广西植物研究所广西桂林541006 贺州市产品质量监督检验所广西贺州542800

目的:通过半制备高压液相色谱分离技术,建立一种快速、稳定、高效制备高纯度罗汉果苷ⅴ标准品的方法。方法:先采用树脂吸附脱色技术进行前处理,再通过半制备高压液相色谱分离制备罗汉果苷ⅴ,色谱条件为Eclipse XDB-C18色谱柱(9.4mm×250... 详细信息

目的:通过半制备高压液相色谱分离技术,建立一种快速、稳定、高效制备高纯度罗汉果苷ⅴ标准品的方法。方法:先采用树脂吸附脱色技术进行前处理,再通过半制备高压液相色谱分离制备罗汉果苷ⅴ,色谱条件为Eclipse XDB-C18色谱柱(9.4mm×250mm,5μm),流动相为乙腈-水,采用梯度洗脱,流速4mL/min,检测波长210nm,进样量36mg,柱温38℃。结果:分离得到的罗汉果苷ⅴ的纯度为99.1%。结论:本方法具有操作简单、快速、稳定和产品纯度高等优点,可应用于实际样品的检测。

关键词：罗汉果罗汉果苷ⅴ 半制备高压液相色谱

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新型载体罗汉果苷V对紫杉醇的增溶作用

医药导报 2019年第6期38卷 770-774页

作者：王杏利王爽张雷罗玉琴韦铭旻吴春勇张峻颖中国药科大学中药制药系南京211198 广东食品药品监督管理局认证审评中心广州510080 山东省食品药品检验研究院济南250101 中国药科大学药物分析系南京210009

目的考察罗汉果苷V作为新型载体对难溶性药物的增溶作用。方法以罗汉果苷V为载体,紫杉醇为模型药物,采用溶剂法制备紫杉醇-罗汉果苷V固体分散体。采用高效液相色谱(HPLC)法测定紫杉醇的含量,考察固体分散体中紫杉醇的饱和溶解度和体外... 详细信息

目的考察罗汉果苷V作为新型载体对难溶性药物的增溶作用。方法以罗汉果苷V为载体,紫杉醇为模型药物,采用溶剂法制备紫杉醇-罗汉果苷V固体分散体。采用高效液相色谱(HPLC)法测定紫杉醇的含量,考察固体分散体中紫杉醇的饱和溶解度和体外溶出性能的变化。同时,用差示热扫描法(DSC)进行物相鉴别,评价药物在固体分散体中晶型变化。结果紫杉醇-罗汉果苷ⅴ固体分散体的饱和溶解度比紫杉醇增加约375倍;与紫杉醇比较,固体分散体的体外溶出速率和累积溶出度明显提高;差示热扫描法结果表明,紫杉醇在固体分散体内以无定形存在。结论罗汉果苷V能明显增加难溶性药物的溶解度和体外溶出度,且该载体安全、无毒,有望成为难溶性药物增溶的新型载体。

关键词：罗汉果苷ⅴ 紫杉醇新型载体固体分散体溶出度

罗汉果水提物和罗汉果苷ⅴ治疗非酒精性脂肪肝炎的药效和机制研究

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罗汉果水提物和罗汉果苷Ⅴ治疗非酒精性脂肪肝炎的药效和机制研究

作者：李美锋广东药科大学

学位级别：硕士

目的:研究罗汉果水提物和罗汉果苷ⅴ对非酒精性脂肪肝病炎(NASH)的肝脂质、转氨酶、肝系数、信号通路及脂肪酸合成相关基因表达的影响,探究罗汉果对NASH的药理作用及作用机理,为NASH的治疗提供新的思路和方法。方法:实验分为体内实验和... 详细信息

目的:研究罗汉果水提物和罗汉果苷ⅴ对非酒精性脂肪肝病炎(NASH)的肝脂质、转氨酶、肝系数、信号通路及脂肪酸合成相关基因表达的影响,探究罗汉果对NASH的药理作用及作用机理,为NASH的治疗提供新的思路和方法。方法:实验分为体内实验和体外实验。体内实验体内实验通过建立非酒精性脂肪肝炎的C57BL/6小鼠模型,将C57BL/6雄性小鼠随机分为等热量空白对照组(MCS)、模型组(MCD)、罗汉果水提物低剂量组(Low)、罗汉果水提物中剂量组(Medium)、罗汉果水提物高剂量组(High)、非诺贝特阳性组(Positive)六组。MCS组饲喂等热量的正常饲料,其余各组饲喂蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饲料的同时,低、中、高剂量组小鼠分别灌胃给50mg/Kg/day、100mg/Kg/day、200mg/Kg/day,Positive组使用阳性药物非诺贝特100mg/kg/day灌胃,各组小鼠饲养并灌胃两周后,收集小鼠肠道粪便样品,摘取眼球采血,处死小鼠,取小鼠肝脏组织。粪便用于检测NASH模型小鼠肠道菌的改变。血液样品用于检物丙二醛(MDA)、总胆固醇(CHO)含量、组织病理学以及相关信号通路蛋白和脂肪合成及炎症相关基因的表达。体外实验用小鼠正常肝细胞系AML-12细胞建立蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)模型。分别用罗汉果水提物和罗汉果苷ⅴ作用于MCD细胞模型,检测其对NASH的药效。检测AML-12细胞的药效生化指标TG,MDA,SOD,然后检测ER、NF-κB、MAPK信号通路蛋白以及脂肪合成相关因子和炎症相关因子的基因表达。结果:动物实验结果显示,与对照组相比,罗汉果水提物无明显肝毒性,而服用阳性药非诺贝特小鼠组肝系数显著增高(p罗汉果水提物干预可减少肝脏脂质堆积以及炎性浸润的现象。肠道菌检测结果显示,罗汉果水提物干预后的小鼠NASH模型,拟杆菌门对厚壁菌门的比值与MCD模型组相比有较为明显的增高作用,且罗汉果水提物浓度越高越接近于对照组的比值。与对照组相比,模型组Akkermansia muciniphilia菌属显著降低,而罗汉果水提物处理组可使疣微菌门的Akkermansia muciniphilia菌属剂量依赖性显著增加。与模型组相比,中、高浓度罗汉果水提物均能显著性降低血清中AST、ALT含量;高、中、低剂量罗汉果水提物剂量依赖性地降低肝脏TG、MDA含量,对CHO无影响。内质网应激信号通路蛋白BIP、p-PERK、IRE-1、ATF-6、SREBP-1在模型组中表达上调,罗汉果水提物作用后下调其表达;MAPK信号通路蛋白p-JNK,p-p38,在模型组中表达上调,JNK,p38表达不变,罗汉果水提物作用后p-JNK,p-p38,表达下调,JNK,p38表达不变;NF-κB信号通路中模型组IKKα、IKKβ、胞浆p-p65和核内p-p65表达上调,IκBα表达下调,p65不变,罗汉果水提物作用后IKKα、IKKβ、胞浆p-p6和核内p-p65表达下调,IκBα表达上调,p65表达不变。在模型组脂肪酸合成相关基因FAS、SCD1、GPAT、ACC和炎症相关基因TNF-α,IL-1β,IL-6表达上调,罗汉果水提物作用后下调这些基因的表达。体外实验成功建立AML-12细胞MCD模型,结果表明,与模型组相比,罗汉果水提物和罗汉果苷ⅴ显著降低肝细胞脂质堆积和脂质过氧化。罗汉果水提物和罗汉果苷ⅴ对肝细胞的内质网应激、NF-κB、MAPK信号通路蛋白和脂肪酸合成及炎症相关基因的影响趋势与体内动物模型相同。结论:罗汉果水提物和罗汉果苷ⅴ对体内动物NASH模型和体外细胞NASH模型具有治疗效果,能降脂降酶、逆转肝脏脂肪积累和减轻脂质过氧化;罗汉果水提物和罗汉果苷ⅴ能降低ER、NF-κB、MAPK通路中蛋白的表达,同时抑制脂肪酸合成基因ACC、FAS、SCD1、GPAT和炎症相关基因TNF-α、IL-1β、IL-6的表达;总之,罗汉果水提物和罗汉果苷ⅴ能减轻肝脏脂质的堆积,改善炎症反应,有效地治疗NASH。

关键词：罗汉果水提物罗汉果苷ⅴ 非酒精性脂肪肝炎蛋氨酸胆碱缺乏模型

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不同果龄罗汉果中甜苷含量分布研究

山东化工 2017年第12期46卷 12-15,17页

作者：刘雯王志宏杨裴庆崔丽杰李珊珊李桂银周治德桂林电子科技大学生命与环境科学学院广西桂林541004

目的:研究不同果龄罗汉果中甜苷Ⅳ、甜苷Ⅴ的检测方法及含量分布。方法:以不同果龄罗汉果鲜果为原材料,采用超声波辅助提取,D101大孔树脂吸附纯化,得到罗汉果中甜苷提取液;采用HPLC法对罗汉果甜苷提取液进行含量测定,得到不同果龄罗汉... 详细信息

目的:研究不同果龄罗汉果中甜苷Ⅳ、甜苷Ⅴ的检测方法及含量分布。方法:以不同果龄罗汉果鲜果为原材料,采用超声波辅助提取,D101大孔树脂吸附纯化,得到罗汉果中甜苷提取液;采用HPLC法对罗汉果甜苷提取液进行含量测定,得到不同果龄罗汉果的甜苷Ⅳ、甜苷Ⅴ含量数值。结果:采用HPLC法检测罗汉果甜苷提取液,甜苷Ⅳ、甜苷Ⅴ吸收峰能明显分开,并且具有可读性;罗汉果甜苷Ⅳ的含量从30天到50天呈递增趋势,在50天之后含量骤减,70天以后苷Ⅳ的含量极低。罗汉果甜苷Ⅴ含量在30天到70天不断增加,而在70天之后,苷Ⅴ的含量趋于稳定。结论:HPLC法能同时检测出罗汉果苷Ⅳ、苷Ⅴ含量,得到了不同果龄罗汉果中甜苷Ⅳ、甜苷Ⅴ含量分布规律。

关键词：果龄罗汉果苷Ⅳ 罗汉果苷ⅴ 含量

罗汉果苷ⅴ对地卓西平诱导的小鼠精神分裂症样行为的影响

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临床精神医学杂志 2015年第4期25卷 231-233页

作者：鞠培俊丁文华李晓波王梦月上海交通大学医学院附属精神卫生中心上海市重性精神病重点实验室201108 上海交通大学药学院

目的:探讨罗汉果苷ⅴ(MogⅤ)对地卓西平马来酸盐(MK801)建立精神分裂症小鼠模型行为学影响。方法:40只8周龄C57BL/6雄性小鼠均分为对照组、MogⅤ组、模型组(MK801)和治疗组(MK801+MogⅤ);分别对各组动物进行旷场试验和前脉冲抑制(PPI)测... 详细信息

目的:探讨罗汉果苷ⅴ(MogⅤ)对地卓西平马来酸盐(MK801)建立精神分裂症小鼠模型行为学影响。方法:40只8周龄C57BL/6雄性小鼠均分为对照组、MogⅤ组、模型组(MK801)和治疗组(MK801+MogⅤ);分别对各组动物进行旷场试验和前脉冲抑制(PPI)测试,评估并比较各组小鼠自发活动量和感觉运动门控功能。结果:与对照组比较,模型组小鼠表现出活动量明显增加[运动总距离(1324±197.7)cm vs(5209±476.4)cm;自发性运动次数(136±17.50)次vs(292.6±18.31)次;P均<0.001]和PPI受损[78 d B:(33.574±1.726)vs(10.311±2.317);84 d B:(43.260±5.008)vs(18.615±3.781);P均<0.01];与模型组比较,治疗组活动量明显降低[(3155±831.9)cm、(202.3±16.63)次],PPI异常明显改善[(34.871±1.633)、(43.816±5.900)](P<0.05或P<0.01)。结论:MogⅤ对MK801所致精神分裂症小鼠模型的高活动量和PPI受损具有一定的调节作用。

关键词：罗汉果苷ⅴ 地卓西平精神分裂症

遮荫对桂南种植罗汉果净光合速率和品质的影响

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广西植物 2013年第6期33卷 822-826页

作者：翟勇进马小军莫长明广西壮族自治区药用植物园南宁530023 中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所北京100094

通过大田栽培试验,探讨生育后期不同遮荫处理(遮荫率0、30%、50%和70%)对罗汉果净光合速率和罗汉果品质的影响。经过遮荫处理,罗汉果净光合速率日变化曲线由对照组(遮荫率为0)的双峰型转变为单峰型,曲线峰值出现在中午12:00时。遮荫率50... 详细信息

通过大田栽培试验,探讨生育后期不同遮荫处理(遮荫率0、30%、50%和70%)对罗汉果净光合速率和罗汉果品质的影响。经过遮荫处理,罗汉果净光合速率日变化曲线由对照组(遮荫率为0)的双峰型转变为单峰型,曲线峰值出现在中午12:00时。遮荫率50%处理的曲线峰值、罗汉果苷ⅴ含量和干果重比其它遮荫处理和对照组的高。结果表明,在桂南种植的罗汉果,生育后期给予遮荫率50%的处理对增加罗汉果的净光合速率,提高罗汉果苷ⅴ含量和干果重较为有利。

关键词：罗汉果遮荫净光合速率桂南罗汉果苷ⅴ

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贝蒌止咳口服液薄层鉴别与含量测定

黑龙江中医药 2021年第2期50卷 425-426页

作者：韩德强王伟明刘彦付玮辰梁丽丽黑龙江省中医药科学院黑龙江哈尔滨150036

目的:建立贝蒌止咳口服液中罗汉果薄层鉴别及浙贝母含量测定方法以控制制剂质量。方法:以TLC法对制剂中罗汉果进行定性鉴别;采用HPLC测定贝母素甲的含量,乙腈-水-二乙胺(70:30:0.03)为流动相,色谱柱选取Diamonsil XDB-C18(4.6 mm×250 m... 详细信息

目的:建立贝蒌止咳口服液中罗汉果薄层鉴别及浙贝母含量测定方法以控制制剂质量。方法:以TLC法对制剂中罗汉果进行定性鉴别;采用HPLC测定贝母素甲的含量,乙腈-水-二乙胺(70:30:0.03)为流动相,色谱柱选取Diamonsil XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)。结果:罗汉果的薄层鉴别方法专属性强,无阴性干扰;贝母素甲在0.7820~3.9100μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9998),平均回收率为100.04%,RSD=0.30%。结论:该方法可有效控制贝蒌止咳口服液的质量。

关键词： TLC HPLC 罗汉果苷ⅴ 贝母素甲质量标准