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脂多糖作用下血管内皮钙黏蛋白经网格蛋白和微囊介导胞吞后的亚细胞分布差异

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解放军医学杂志 2016年第1期41卷 22-25页

作者：张晔张连阳孙士锦谭浩李阳第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤中心创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042

目的研究脂多糖(LPS)作用下血管内皮钙黏蛋白(VE-Cad)经不同的胞吞途径进入细胞后对VE-Cad亚细胞分布和细胞通透性的影响。方法体外培养人血管内皮细胞株CRL-2922,观察LPS(10μg/ml)作用后不同时间点VECad与R ab11(循环内颗粒标记物)及... 详细信息

目的研究脂多糖(LPS)作用下血管内皮钙黏蛋白(VE-Cad)经不同的胞吞途径进入细胞后对VE-Cad亚细胞分布和细胞通透性的影响。方法体外培养人血管内皮细胞株CRL-2922,观察LPS(10μg/ml)作用后不同时间点VECad与R ab11(循环内颗粒标记物)及溶酶体相关膜蛋白2(L AMP2,晚期内颗粒/溶酶体标记物)的免疫共沉淀情况,网格蛋白胞吞抑制剂和微囊抑制剂对VE-Cad与Rab11和LAMP2免疫共沉淀的影响,以及单层细胞通透性的变化。结果LPS作用后1h,VE-Cad与Rab11的免疫共沉淀明显增高(P网格蛋白胞吞抑制剂氯丙嗪(CPZ)可显著抑制LPS作用后VE-Cad与Rab11免疫共沉淀的增高(P网格蛋白胞吞抑制剂无此作用。网格蛋白胞吞抑制剂可减轻LPS作用后1h单层细胞通透性的增高,而微囊抑制剂可减轻LPS作用后4h单层细胞通透性的增高(P网格蛋白或微囊介导的胞吞进入细胞,分布于循环内颗粒或溶酶体中,从而导致不同程度的血管通透性增高。

关键词：毛细血管通透性脂多糖类钙黏着糖蛋白类网格蛋白细胞质膜微囊

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网格蛋白介导胞吞在血管通透性增高中的作用

中华实验外科杂志 2015年第11期32卷 2681-2684页

作者：张晔张连阳李阳谭浩孙士锦第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤中心创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042

目的观察网格蛋白介导的血管内皮钙黏蛋白（VE-Cad）胞吞在脂多糖（LPS）诱导血管通透性增高中的作用.方法以人血管内皮细胞株CRL-2922为研究对象,采用Western blot、免疫共沉淀、免疫组织化学等方法,观察LPS处理不同时间点的VE-Cad... 详细信息

目的观察网格蛋白介导的血管内皮钙黏蛋白（VE-Cad）胞吞在脂多糖（LPS）诱导血管通透性增高中的作用.方法以人血管内皮细胞株CRL-2922为研究对象,采用Western blot、免疫共沉淀、免疫组织化学等方法,观察LPS处理不同时间点的VE-Cad蛋白表达和单层细胞通透性、网格蛋白与VE-Cad的共沉淀和共定位,以及网格蛋白胞吞抑制剂对LPS处理后网格蛋白与VE-Cad的共沉淀、VE-Cad蛋白表达和单层细胞通透性的影响.结果（1）LPS（10 mg/L）处理后VE-Cad的质膜表达逐渐降低（0.621 ±0.092降至0.162±0.035,P＜0.05）,单层细胞通透性逐渐增高（0.263±0.042增至0.751 ±0.102,P＜0.05）;（2） LPS处理后网格蛋白表达逐渐降低（0.525±0.047降至0.270±0.032,P＜0.05）,与VE-Cad的免疫共沉淀在1h时增高（0.289±0.055,P＜0.05）,之后逐渐降低,免疫组织化学激光共聚焦显微镜观察其共定位显示同样的变化;（3）网格蛋白胞吞抑制剂氯丙嗪（CPZ,100μmol/L）可以显著降低LPS处理1h网格蛋白与VE-Cad的免疫共沉淀（0.127±0.034,P＜0.05）,增高VE-Cad的质膜表达（0.603±0.071,P＜0.05）,改善单层细胞通透性（0.319±0.045,p＜0.05）;但对LPS处理4h网格蛋白与VE-Cad的免疫共沉淀、VE-Cad质膜表达以及单层细胞通透性没有显著影响.结论网格蛋白介导VE-Cad胞吞参与LPS作用早期血管通透性增高的形成,但不影响LPS作用后期的血管通透性增高.

关键词：血管通透性增高脂多糖血管内皮钙黏蛋白网格蛋白

网格蛋白接头蛋白复合体AP1σ亚基的遗传功能分析

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网格蛋白接头蛋白复合体AP1σ亚基的遗传功能分析

作者：徐梅浙江师范大学

学位级别：硕士

网格蛋白介导的膜蛋白运输(clathrin-mediated trafficking)在动植物细胞胞外物质吸收、质膜蛋白外吐、内吞与降解、胞内外信号传递等细胞生物学过程中具有重要生物学功能。在植物细胞中,网格蛋白主要定位于细胞质膜、反式高尔基网络或... 详细信息

网格蛋白介导的膜蛋白运输(clathrin-mediated trafficking)在动植物细胞胞外物质吸收、质膜蛋白外吐、内吞与降解、胞内外信号传递等细胞生物学过程中具有重要生物学功能。在植物细胞中,网格蛋白主要定位于细胞质膜、反式高尔基网络或早期内体(trans-Golginetwork/earlyendosome;TGN/EE)上。因此,网格蛋白主要在质膜和TGN/EE上发挥其生物学功能。然而,网格蛋白在质膜和TGN/EE上的具体招募机制目前仍没有被彻底弄清楚。最近的研究表明,拟南芥网格蛋白被招募到质膜和TGN/EE上分别由接头蛋白AP2(adaptor protein 2)和AP1复合体来介导完成。AP1复合体是由AP1γ、AP1/2β、AP1μ和AP1σ组成的异源四聚体,定位于TGN/EE上;而AP2复合体是由AP2α、AP1/2 β、AP2μ和AP2σ组成异源四聚体,定位于细胞质膜上。目前对拟南芥AP2亚基的生物学功能鉴定及其网格蛋白质膜招募机制的研究相对较为深入,而对AP1复合体的功能研究相对比较落后。为此,本研究利用生物信息学、遗传学、细胞生物学和生理生化等分析技术,分析鉴定了 AP1σ亚基的遗传学功能和亚细胞定位,具体研究结果如下:(1)利用生物信息学分析技术和哺乳动物AP1σ氨基酸序列,发现了拟南芥基因组含有两个AP1σ同源基因,分别被命名为AP1σ1和AP1σ2。氨基酸同源序列比对发现,AP1σ1和AP1σ2的同源性高达97%,与哺乳动物的同源性为58%。(2)利用PCR和RT-PCR技术,成功分离并鉴定了两个AP1σ1和AP1σ2功能缺失突变体ap1σ1-1和ap1σ2-1,并进一步制备了ap1σ1-1 aplσ2-1双突变体。发育表型分析结果表明,ap1σ2-1的花器官与野生型相似,但豆荚短小、结实率显著下降,ap1σ1-1ap1σ2-1(杂合het/纯合hom)的结实率比ap1σ2-1单突变体更低,ap1σ1-1ap1σ2-1(hom/hom)的根短小、下胚轴较粗、子叶深色,且幼苗致死。相反,ap1σ1-1的植株生长发育和结实率等表型与野生型相似。(3)亚历山大染色镜检结果表明,ap1σ1-1的花粉活性、数量与野生型完全相似。尽管ap1σ2-1和ap1σ1-1ap1σ2-1(het/hom)花粉活性正常但数量比野生型显著减少,并且,ap1σ1-1 ap1σ2-1(het/hom)数量比ap1σ2-1更少。这些分析结果与突变体结实率分析结果相一致,表明AP1σ2功能缺失抑制花粉形成从而影响植株育性,但AP1σ1与AP1σ2在育性上有一定的功能冗余性。(4)利用分子克隆技术和转基因方法,制备了35S::AP1σ1-GF 和35S::AP1σ2-GFP转基因植株,用激光共聚焦显微镜观察证实融合蛋白成功表达,定位于胞内并且呈斑点状分布。荧光共定位分析结果显示,AP1σ1-GFP和AP1σ2-GFP与TGN/EE定位的分子标记AP1μ-RFP、CLC1-mKO有较高的共定位系数(0.6-0.8),即有高达60～80%荧光信号完全共定位,表明AP1σ的确定位于TGN/EE上。根据以上分析结果,本研究可初步获得以下结论:拟南芥基因组含有2个AP1σ亚基基因AP1σ1和AP1σ2,其中,AP1σ2功能缺失抑制了花粉的形成或发育,从而引起花粉数量下降,最终导致植株结实率下降;AP1σ1和AP1σ2功能同时缺失引起幼苗致死。此外,AP1σ定位于TGN/EE上,证实了 AP1复合体的确在TGN/EE起作用。这些分析结果为进一步研究AP1的生物学功能打下了坚实的基础,为阐明AP1介导的网格蛋白TGN/EE招募机制提供了新的研究材料。

关键词：拟南芥网格蛋白接头蛋白 AP1σ TGN/EE

AP-2蛋白调控网格蛋白介导突触囊泡胞吞的研究进展

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中华耳科学杂志 2015年第2期13卷 349-354页

作者：顾翔袁伟第三军医大学西南医院耳鼻咽喉头颈外科重庆400038

神经元间的信息传递依赖于神经递质的释放,这一过程离不开正常有效的囊泡循环机制,突触囊泡循环是调控突触囊泡水平和维持神经递质释放的基础。囊泡回收则是循环过程中保证囊泡从突触前膜回收至胞内,参与新一轮囊泡形成和再生的重要保... 详细信息

神经元间的信息传递依赖于神经递质的释放,这一过程离不开正常有效的囊泡循环机制,突触囊泡循环是调控突触囊泡水平和维持神经递质释放的基础。囊泡回收则是循环过程中保证囊泡从突触前膜回收至胞内,参与新一轮囊泡形成和再生的重要保障。网格蛋白介导的内吞是突触囊泡回收的主要途径,衔接蛋白AP-2(adaptin-2)是参与这一内吞过程不同时期的关键蛋白,其通过绑定不同蛋白分子分别从结构和动力的层面参与了囊泡回收过程,AP-2对网格蛋白介导的突触囊泡胞吞过程具有重要意义。本文结合国内外最新研究报道,简要综述了AP-2的结构特点、分子基础、AP-2蛋白调控网格蛋白介导突触囊泡的胞吞及其与听力的关系。

关键词：网格蛋白衔接蛋白胞吞突触囊泡内毛细胞

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网格蛋白介导的突触囊泡内吞机制

中国神经科学杂志 2002年第3期18卷 643-647页

作者：李穆丰施玉 中国科学院上海生命科学院生理所神经生物学开放实验室上海200031

突触囊泡在神经末梢进行着精确而快速地胞吐、内吞循环。近年来进行的研究发现网格蛋白介导的内吞是囊泡蛋白回收的主要途径。

关键词：网格蛋白突触囊泡内吞胞吐

猪瘟病毒通过网格蛋白介导的内吞途径入侵ST细胞

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畜牧兽医学报 2017年第1期48卷 140-149页

作者：梁武龙方佳林鸷郑敏萍鲍长磊王涛张彦明西北农林科技大学动物医学院杨凌712100

病毒入侵易感细胞是病毒建立感染的必要过程,猪瘟病毒如何入侵易感细胞尚未明确。笔者对猪瘟病毒入侵细胞与网格蛋白介导的内吞途径的关系进行了初步研究。通过利用抑制剂氯丙嗪和Dynasore及shRNA技术,对网格蛋白及动力蛋白功能进行抑制... 详细信息

病毒入侵易感细胞是病毒建立感染的必要过程,猪瘟病毒如何入侵易感细胞尚未明确。笔者对猪瘟病毒入侵细胞与网格蛋白介导的内吞途径的关系进行了初步研究。通过利用抑制剂氯丙嗪和Dynasore及shRNA技术,对网格蛋白及动力蛋白功能进行抑制,干扰网格蛋白介导的内吞途径,发现猪瘟病毒的细胞入侵效率明显下降;通过利用内体酸化抑制剂NH4Cl及shRNA技术下调内体标志蛋白Rab5和Rab7的表达量,发现内体酸化过程受到抑制后猪瘟病毒的感染效率受到了明显抑制。本研究初步证明猪瘟病毒能够利用网格蛋白介导的内吞途径完成对易感细胞的入侵,感染的过程依赖于初级内体和次级内体,为了解猪瘟病毒的感染过程积累了新的数据。

关键词：猪瘟病毒入侵网格蛋白内体

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节肢动物体内网格蛋白的研究进展

中国动物传染病学报 2019年第5期27卷 112-118页

作者：旷策嫣周荣琼周金林西南大学动物科学学院重庆402460 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

网格蛋白是一种分布广泛的笼形蛋白,介导的内吞作用在多细胞与单细胞生物中具有至关重要的作用。网格蛋白的内吞作用机制主要是包裹货物的囊泡的形成、断裂与回收等阶段。研究发现,节肢动物体内营养物质的吸收、dsRNA的干扰、病毒的传... 详细信息

网格蛋白是一种分布广泛的笼形蛋白,介导的内吞作用在多细胞与单细胞生物中具有至关重要的作用。网格蛋白的内吞作用机制主要是包裹货物的囊泡的形成、断裂与回收等阶段。研究发现,节肢动物体内营养物质的吸收、dsRNA的干扰、病毒的传播等生理过程均是通过网格蛋白介导的内吞作用进行的。本文主要对节肢动物体内网格蛋白介导的内吞作用在的研究进展进行介绍。

关键词：网格蛋白内吞作用节肢动物

拟南芥网格蛋白轻链CLC1磷酸化位点功能的初步探究

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拟南芥网格蛋白轻链CLC1磷酸化位点功能的初步探究

作者：田丹兰州大学

学位级别：硕士

植物网格蛋白介导的内吞（Clathrin-mediated endocytosis;CME）是真核生物内吞的主要方式之一,在植物胞外营养物质吸收、重要质膜蛋白丰度和胞内外信号转导等多种细胞学过程起着决定性作用。网格蛋白复合体是由三条重链（Clathrin heav... 详细信息

植物网格蛋白介导的内吞（Clathrin-mediated endocytosis;CME）是真核生物内吞的主要方式之一,在植物胞外营养物质吸收、重要质膜蛋白丰度和胞内外信号转导等多种细胞学过程起着决定性作用。网格蛋白复合体是由三条重链（Clathrin heavy chains;CHCs）和三条轻链（Clathrin light chains;CLCs）组成的三角架结构（Triskelion）,重链是复合体的主要骨架,轻链主要决定复合体稳定性。课题组前期研究表明,植物激素生长素（Auxin）通过抑制网格蛋白CLC的质膜招募影响生长素输出载体（PIN-FORMED;PIN）的内吞,从而促进生长素自身的极性输出。此途径是生长素决定植物生长发育的主要机制之一。然而,关于生长素抑制网格蛋白CLC质膜招募的分子机制研究至今仍不清楚。为了探究生长素调控网格蛋白CLC质膜招募的分子机理,本研究综合利用生物信息学、细胞生物学、遗传学和生理生化等研究手段,结合激光共聚焦显微镜,从预测网格蛋白CLC磷酸化位点入手,剖析网格蛋白质轻链CLC1点突变的生物学功能,具体研究结果如下:（1）生物信息学研究表明,拟南芥网格蛋白CLC1、CLC2和CLC3分别存在30、29和35个预测磷酸化位点。此外,结合同源序列比对结果,筛选到CLC共有的14个磷酸化位点,然后构建定点突变载体,最终获得14个定点突变的拟南芥转基因株系。（2）亚细胞定位结果表明,CLC1同时定位于质膜和反式高尔基体网络或早期内体（Trans-golgi network/Early endosome;TGN/EE）。同时,为分析地上部分和地下部分CLC1对生长素的响应情况,我们制备了两套CLC1转基因材料:35S:CLC1-GFP和UBQ:CLC1-GFP。35S:CLC1-GFP材料适用于观察子叶表皮细胞（地上部分）CLC1的亚细胞定位;相比35S启动子,UBQ:CLC1-GFP更适合地下部分（根尖分生区）的相关实验。（3）细胞生物学实验表明,以CLC1-GFP/Col-0为对照,发现a和b这两个点突变株系对生长素抑制CLC质膜招募的敏感性降低。构建双点突变（a和b同时突变）的载体(表示为CLC1),获得CLC1-GFP稳转株系,并发现生长素抑制CLC质膜招募的现象在CLC1-GFP材料中基本消失。以上结果表明,CLC1的a和b位氨基酸对生长素调控CLC1质膜招募具有重要的作用。此外,荧光漂白恢复实验表明,CLC1 抑制了CLC1的质膜招募速率。在CLC1-GFP/clc1背景下,Confocal分析内吞示踪剂FM4-64的吸收,结果表明CLC1双点突变抑制FM4-64的吸收。这一结果暗示CLC1的a和b位氨基酸对CME介导的质膜内吞至关重要。（4）实验室前期的研究表明CLC1功能缺失能够引起花粉致死。将CLC1-GFP表达载体转化clc1杂合体,遗传学分析发现CLC1-GFP为纯合,突变体为clc1杂合（clc1/+）材料(clc1/+/CLC1-GFP)的子代分离产生的纯合体远小于正常比例。同时,clc1/CLC1-GFP的表型分析表明,虽然clc1/CLC1-GFP能够产生可育的种子,但是结实率低。以上结果暗示,CLC1的a和b两个氨基酸位点在植物生长发育过程中起着重要作用。（5）生化实验分析结果表明,植物CLC1受到磷酸化修饰,CLC1削弱了CLC1的磷酸化程度,实验结果暗示a和b两个位点可能是CLC1的磷酸化修饰位点,同时是CLC1正常行使功能所必需的。综合以上实验结果,本研究能够初步得出以下结论:CLC1的a和/或b位氨基酸减少了生长素抑制CLC1质膜招募的作用;CLC1的a和b位氨基酸双点突变抑制CLC1的质膜招募和质膜蛋白的内吞速率;CLC1未能完全互补clc1突变体表型,依然存在角果变短和杂合体clc1/+子代基因型分离比异常的现象;a和b两位的突变减弱了CLC1磷酸化水平。本研究结果初步鉴定了网格蛋白CLC1候选磷酸化位点a和b在生长素调控网格蛋白质膜招募中的生物学功能,为阐明磷酸化修饰在生长素调控网格蛋白质膜招募的分子机理打下基础,同时为解析生长素极性运输在调控植物生长发育中提供新的观点和见解。

关键词：拟南芥网格蛋白 CLC1 生长素质膜招募磷酸化

细胞网格蛋白和内体酸化对轮状病毒侵入的影响

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细胞网格蛋白和内体酸化对轮状病毒侵入的影响

作者：曹思黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

轮状病毒(Rotavirus,RV)引起的疾病是一种人畜共患传染病,主要感染5岁以下儿童及幼龄动物,以脱水性胃肠炎为特征,严重时可导致死亡。轮状病毒造成了巨大的社会负担及经济损失,但轮状病毒的治疗尚无特效药。当前两个商品化口服活疫苗虽... 详细信息

轮状病毒(Rotavirus,RV)引起的疾病是一种人畜共患传染病,主要感染5岁以下儿童及幼龄动物,以脱水性胃肠炎为特征,严重时可导致死亡。轮状病毒造成了巨大的社会负担及经济损失,但轮状病毒的治疗尚无特效药。当前两个商品化口服活疫苗虽在发达国家效果较好,但在低收入国家免疫效果不好,安全性也存在争议。因此,开发特效治疗轮状病毒的药物和生产高效的疫苗迫在眉睫。轮状病毒侵入宿主细胞的机制尚不明确,研究出轮状病毒侵入宿主细胞的机制是必要的,为药物和疫苗的研发提供借鉴。本实验以牛轮状病毒UK株为模板,原核表达VP6基因的编码区全序列。并与弗氏佐剂乳化后免疫豚鼠,分离血清,制备豚鼠抗VP6蛋白的多克隆抗体,检测多克隆抗体的特性。用蔗糖或NH4Cl处理Caco-2细胞,并设置非处理组,确定网格蛋白受到破坏或内体酸化受到抑制,孵育轮状病毒UK株或RRV株,通过间接免疫荧光实验检测病毒的感染是否受到抑制。另一实验通过荧光定量PCR的方法定量VP6的转录差异。实验结果成功制备抗VP6多克隆抗体,具有良好的反应性,均可以与UK、RRV株轮状病毒反应。蔗糖处理Caco-2和MA104细胞,破坏了细胞的网格蛋白,间接免疫荧光证明,与非处理组相比,UK组轮状病毒颗粒数量明显减少,RRV组轮状病毒颗粒数量未有明显改变,这一结果表明UK株轮状病毒侵入细胞依赖于网格蛋白,RRV株轮状病毒的侵入并不依赖于网格蛋白。NH4Cl处理Caco-2和MA104细胞,抑制细胞的内体酸化,间接免疫荧光中与非处理组相比,UK组病毒颗粒数量明显减少,RRV组病毒颗粒数量未有明显改变,这一结果表明UK株轮状病毒侵入细胞依赖于内体,RRV株轮状病毒的侵入并不依赖于内体的酸化。另一组实验,经蔗糖和NH4Cl处理的Caco-2细胞或MA104细胞,接种轮状病毒后,实时定量PCR表明,UK株VP6基因含量与对照组相比显著下降,RRV株VP6基因含量与对照组相比略有差异。在Caco-2细胞和MA104细胞上得出的结果一致。综上所述,无论在易感轮状病毒的MA104细胞上,还是模拟小肠天然环境上皮细胞的Caco-2细胞上,UK株轮状病毒侵入细胞依赖于网格蛋白和内体的酸化,而RRV株轮状病毒的侵入并不依赖于网格蛋白和内体的酸化。本结论对阐明轮状病毒侵入机制具有重要意义,也为轮状病毒胃肠炎药物的开发提供参考。

关键词：轮状病毒网格蛋白多克隆抗体 VP6基因内体侵入