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水稻缺铁响应转录因子OsIRO3与OsbHLH062功能的初步研究

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水稻缺铁响应转录因子OsIRO3与OsbHLH062功能的初步研究

作者：王敏浙江大学

学位级别：硕士

铁是植物生长和发育所必需的微量元素之一,它参与植物的叶绿素合成,并且是很多酶的重要组成部分。在面对复杂的生存环境时,植物维持体内的铁稳态非常重要,所以植物进化出一系列的Fe吸收和转运的调控机制。解析参与铁吸收、代谢和体内平... 详细信息

铁是植物生长和发育所必需的微量元素之一,它参与植物的叶绿素合成,并且是很多酶的重要组成部分。在面对复杂的生存环境时,植物维持体内的铁稳态非常重要,所以植物进化出一系列的Fe吸收和转运的调控机制。解析参与铁吸收、代谢和体内平衡的重要调控基因,研究植物缺铁的响应机制,培育富铁植物品种具有重要意义。本实验室在前期通过分析缺铁水稻的基因芯片,发现一个缺铁诱导的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)家族的转录因子-OsIRO3。OsIRO3,该转录因子负调控水稻的缺铁信号响应(Zheng et al.,2010)。通过进化分析,我们还发现水稻中有一个OsIRO3的高度同源基因OsbHLH62.本研究主要目的是发展OsIRO3和OsbHLH062的超表达和突变体遗传材料,并初步分析这两个基因的功能。本研究中,利用一系列分子生物学与植物生理学方法,我们分析了OsIRO3和OsbHLH062的蛋白结构、表达模式、亚细胞定位和蛋白互作等。通过分析Genevestigator中的基因芯片数据发现,OsIRO3在水稻组织中广泛表达,而OsbHLH062在种子,根和花中广泛表达,在叶片、茎和节等地上部分表达相对较低。进一步利用启动子接GUS报告基因,发现OsIRO3和OsbHLH062主要在维管组织中表达,同时OsIRO3受缺铁诱导表达。基因枪轰击洋葱表皮细胞及原生质体转化,证明OsIRO3和OsbHLH062融合的GFP蛋白定位在细胞核中,符合预期。但是酵母实验发现,OsIRO3具有转录因子的自激活功能而OsbHLH062不具备自激活功能。进一步的酵母双杂交分析发现,OsbHLH062能够与其自身和OsIRO3相互作用。利用BiFC实验,我们进一步确认了OsbHLH062和OsIRO3在水稻原生质体中的相互作用。最后,我们利用水稻转基因和CRISPR/Cas9等技术,培育了OsIRO3和OsbHLH062的超表达和突变体材料。本研究中,我们明确了OsIRO3和OsbHLH062的表达,亚细胞定位与相互作用方式,利用发展的超表达和突变体等遗传材料,下一步将对OsIRO3和OsbHLH062在水稻铁信号调控网络中的功能进行更详细的研究。

关键词：水稻缺铁响应转录因子碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)

OsIIP3和OsIIP4参与水稻缺铁响应的功能研究

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OsIIP3和OsIIP4参与水稻缺铁响应的功能研究

作者：叶俊南京农业大学

学位级别：硕士

铁是植物生长发育必需的微量元素之一,其作为许多功能蛋白的辅助因子,参与叶绿素合成,线粒体呼吸等许多生化过程。铁缺乏造成植物新叶脉间失绿、生长缓慢、产量下降。虽然铁是地壳中的第二大金属元素,但其在土壤中通常以难溶性的三价铁... 详细信息

铁是植物生长发育必需的微量元素之一,其作为许多功能蛋白的辅助因子,参与叶绿素合成,线粒体呼吸等许多生化过程。铁缺乏造成植物新叶脉间失绿、生长缓慢、产量下降。虽然铁是地壳中的第二大金属元素,但其在土壤中通常以难溶性的三价铁形式存在,不易被植物利用。另外,缺铁性贫血严重威胁全球近1/3人口(特别是妇女和儿童)的健康。而植物性食物是人体铁的主要来源之一。因此,研究植物的缺铁响应的调控可以为培育耐缺铁和铁强化作物提供理论依据。OsIRO3是调控水稻缺铁响应的关键基因,其突变体和过表达材料均对缺铁超敏感,表明OsIRO3在水稻缺铁反应中需受到严格的调控。本实验室前期通过酵母双杂交技术获得多个OsIRO3的互作蛋白,本文研究了OsIIP3(OsIRO3 Interaction Protein 3)和OsIIP4在水稻缺铁响应中的功能。OsIIP3是伤害应激蛋白,而OsIIP4为钙信号依赖性蛋白激酶CPK1受体蛋白,两者在缺铁响应中的功能未知。本文通过生物化学、细胞学和遗传学等手段研究了OsIIP3和OsIIP4在水稻缺铁响应中的功能。利用荧光素酶互补技术(Luciferase complementation imaging assay,LCI)、双分子荧光互补(Biomolecular fluorescence complementation,Bi FC)和体外Pull-down实验证明OsIIP3和OsIIP4均能与OsIRO3互作。通过qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)分析OsIIP3和OsIIP4的组织表达模式和缺铁响应表达模式,发现OsIIP3和OsIIP4在水稻各生育期的各组织中均有表达,OsIIP3在叶鞘中表达量最高,OsIIP4在叶片、叶鞘及种子中表达量较高;OsIIP3在根和地上部的表达均受缺铁诱导,而OsIIP4在地上部的表达受缺铁诱导。通过烟草表皮细胞和水稻原生质体瞬时表达分析以及突变体回补实验结果显示,OsIIP3定位于细胞核,而OsIIP4定位于液泡前体(prevacuolar compartment)。进一步,利用CRISPR-Cas9技术获得OsIIP3和OsIIP4纯合突变体(osiip3和osiip4)。供铁(2μM Fe SO4)条件下,osiip3和osiip4的株高、根长和干重均显著低于野生型(WT);缺铁处理后,osiip3和osiip4突变体的株高、叶片SPAD值以及根系形态指标(总根长、根表面积、根体积、总根毛数、分叉数)与野生型相比差异进一步变大,表明osiip3和osiip4较WT对缺铁更敏感。通过ICP-MS分析WT、osiip3和osiip4的Fe含量,发现不管供铁还是缺铁条件下osiip3和osiip4根和地上部的铁含量都显著低于野生型。qRT-PCR结果显示,缺铁条件下,osiip3中缺铁响应相关基因OsNAS1、OsNAS2、OsNAS3、OsIRO2、OsIRO3和OsNNAT1的表达均显著高于WT,而供铁条件下,只有OsNAS3的表达显著的高于WT;而osiip4与WT相比,只发现缺铁条件下OsNAS3在osiip4中的表达量高于WT。通过双荧光素酶报告实验(Dual-luciferase reporter assay),发现OsIIP4可通过OsIRO3抑制OsNAS3启动子活性。其次,通过构建OsIIP3和OsIIP4的过表达材料(OsIIP3-OE和OsIIP4-OE),并进行缺铁处理,发现OsIIP3-OE和OsIIP4-OE同样对缺铁敏感,与野生型相比,株高、根长、叶片SPAD值均显著降低。ICP-MS结果显示,与WT相比,缺铁条件下OsIIP3-OE根中的铁含量显著升高,OsIIP4-OE中的铁含量无显著变化,而锌在根中积累,地上部降低,另外OsIIP3-OE和OsIIP4-OE糙米的铁和锌含量均显著提高。本研究明确了OsIIP3和OsIIP4为水稻缺铁响应负调控因子OsIRO3的互作蛋白。对它们相关遗传材料(突变体和过表达)进行缺铁生理和缺铁响应相关基因表达的详细分析,发现OsIIP3和OsIIP4均参与水稻缺铁响应的调控,双荧光素酶报告实验表明OsIIP4可通过OsIRO3抑制OsNAS3的表达。综上,本研究初步证明OsIRO3互作蛋白OsIIP3和OsIIP4在水稻的生长发育和缺铁响应中起着重要作用。

关键词：水稻铁缺铁响应 OsIRO3 OsIIP3 OsIIP4

转录因子OsbHLH062参与调控水稻缺铁响应

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转录因子OsbHLH062参与调控水稻缺铁响应

拟南芥bHLH Ib转录因子调控FIT的转录

第七届长三角植物科学研讨会暨青年学术报告会

作者：王武建陆文慧郑录庆南京农业大学

铁是维持植物生长发育所必需的微量元素。许多碱性螺旋-环-螺旋(b HLH)转录因子被证明调控植物铁稳态过程。我们证实水稻一个b HLH转录因子(Osb HLH062)在水稻铁稳态中发挥重要作用。Osb HLH062的表达在根部受缺铁诱导,而在地上部则受... 详细信息

铁是维持植物生长发育所必需的微量元素。许多碱性螺旋-环-螺旋(b HLH)转录因子被证明调控植物铁稳态过程。我们证实水稻一个b HLH转录因子(Osb HLH062)在水稻铁稳态中发挥重要作用。Osb HLH062的表达在根部受缺铁诱导,而在地上部则受缺铁显著的抑制。分析Osb HLH062在不同生长发育期及不同部位的表达情况,发现OsbHLH062在不同生长发育期的表达比较稳定,其在根中的表达量高于其它部位的表达量。缺铁处理下,过表达Osb HLH062植株的新叶比野生型的新叶黄化更严重且出现褐色坏死症状。进一步分析发现缺铁处理下Osb HLH062过表达植株地上部分叶绿素含量和铁含量都显著低于野生型,而在铁充足条件下没有差异。通过实时荧光定量PCR对缺铁响应相关基因表达情况进行分析发现,不管在铁充足还是缺铁条件下,Osb HLH062过表达植株中缺铁响应相关基因Os IRO3、Os IRO2、Os IRT1和Os YSL15的表达量都显著低于野生型。这些结果表明,Osb HLH062在水稻缺铁响应过程中发挥重要作用。

关键词：铁水稻转录因子 OsbHLH062 缺铁响应

来源： cnki会议评论

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广西植物 2023年第2期43卷 399-404页

作者：杨钰洁梁岗中国科学院西双版纳热带植物园热带植物资源可持续利用重点实验室昆明650223 中国科学院大学生命科学学院北京100049

FIT是调控拟南芥铁稳态的一个关键调控因子,它在转录水平上受到缺铁诱导,但其背后的调控机制还不甚清楚。该研究以拟南芥bHLH38和FIT的单、双过表达植物及bHLH Ib四突变体植物为材料,采用缺铁(-Fe)处理实验和定量RT-PCR的方法从RNA角度... 详细信息

FIT是调控拟南芥铁稳态的一个关键调控因子,它在转录水平上受到缺铁诱导,但其背后的调控机制还不甚清楚。该研究以拟南芥bHLH38和FIT的单、双过表达植物及bHLH Ib四突变体植物为材料,采用缺铁(-Fe)处理实验和定量RT-PCR的方法从RNA角度分析了FIT转录水平的变化。结果表明:(1)在铁充足时,bHLH38过表达植物中FIT的转录水平显著高于其在野生型中的水平。(2)在bHLH Ib四突变体植物中FIT的转录水平不受缺铁诱导。(3)FIT单过表达不能激活内源FIT的转录,而在加铁(+Fe)条件下bHLH38和FIT的双过表达则可以激活内源FIT的转录。(4)在缺铁条件下,所有植物中FIT的转录水平均与野生型中的FIT水平无明显差异。基于以上结果认为,bHLH Ib转录因子是缺铁诱导FIT转录的必要条件,而非充分条件。该研究结果为深入了解植物通过多种途径共同维持铁稳态提供了新的见解。

关键词：铁转录调控缺铁响应铁稳态拟南芥

OsbHLH156启动子结合蛋白的筛选及OsEIL3功能初探

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OsbHLH156启动子结合蛋白的筛选及OsEIL3功能初探

作者：高熊枫浙江大学

学位级别：硕士

铁(Fe)是植物各种代谢过程所需的关键微量营养元素之一,但在土壤中它主要以不溶性氢氧化物和氧化物的形式存在,尤其是在中性至碱性土壤中常因其有效性低造成植物缺铁。因此,研究植物的铁吸收调控机制从而提高植物对土壤中铁元素的吸收... 详细信息

铁(Fe)是植物各种代谢过程所需的关键微量营养元素之一,但在土壤中它主要以不溶性氢氧化物和氧化物的形式存在,尤其是在中性至碱性土壤中常因其有效性低造成植物缺铁。因此,研究植物的铁吸收调控机制从而提高植物对土壤中铁元素的吸收利用效率是一个植物营养的重要课题。前期本实验室发现水稻b HLH型转录因子OsbHLH156是一个缺铁响应的关键转录因子,OsbHLH156基因在根中受缺铁信号强烈诱导,转录组测序结果表明,osbhlh156突变体中绝大多数机制II缺铁响应基因的转录激活被抑制。但是,OsbHLH156的上游调控网络尚不明确。本研究利用OsbHLH156启动子序列,通过酵母单杂交试验,对包含1588个水稻转录因子的酵母文库进行了筛选,通过酵母单杂交一对一和双荧光素酶报告基因的实验验证,获得了一个与OsbHLH156启动子结合的转录因子OsEIL3(Ethylene Insensitive 3-like 3)。亚细胞定位显示OsEIL3定位于细胞核,组织表达分析显示OsEIL3在根中表达量最高,并且在根部受缺铁诱导表达,说明OsEIL3与OsbHLH156的时空表达模式一致。系统进化分析发现,OsEIL3所在的EIN3/EILs转录因子家族在水稻中共有6个同源蛋白。亚细胞定位显示OsEIL1、OsEIL2、OsEIL3、OsEIL4、OsEIL5均定位于细胞核,而OsEIL6不定位在细胞核中。组织表达分析发现OsEIL1、OsEIL2、OsEIL3和OsEIL4在根中表达量最高,而OsEIL5和OsEIL6在节间的表达量最高。上述6个EIN3/EILs基因中,OsEIL1、OsEIL2和OsEIL3表达量相对较高,而OsEIL4、OsEIL5和OsEIL6表达量相对较低。OsEIL2和OsEIL3在根部的表达受缺铁诱导。通过CRISPR/CAS9基因编辑的方法,创制了oseil3的突变体材料,并在不同供铁与乙烯处理条件下观察了oseil3突变体的缺铁表型。结果表明,在缺铁条件下oseil3突变体相比野生型叶片失绿更加严重。缺铁条件下外源添加乙烯可以部分回复野生型水稻的缺铁症状,但此回复效应在oseil3突变体中减弱。并且,缺铁与外源添加乙烯均会诱导OsEIL3和OsbHLH156表达上调。转录组测序发现,oseil3突变体与野生型之间的差异基因数量在缺铁条件下远多于供铁条件,同时大部分缺铁响应基因在缺铁条件下的表达量较野生型均有不同程度降低。以上实验结果说明OsEIL3功能缺失一定程度上抑制了缺铁信号对缺铁响应基因的诱导。综上所述,本研究发现OsEIL3通过OsbHLH156调控了水稻缺铁响应。研究结果丰富了水稻缺铁响应的核心转录因子OsbHLH156的上游调控网络,为水稻耐缺铁和富铁分子设计育种提供理论依据。

关键词：水稻缺铁响应乙烯 EIN3/EILs 转录因子

缺铁胁迫对梨氮代谢及赤霉素信号转导相关基因表达的影响

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缺铁胁迫对梨氮代谢及赤霉素信号转导相关基因表达的影响

作者：丁伟安徽农业大学

学位级别：硕士

铁是植物生长发育必需的营养元素,参与植物体内一系列的生物反应,如光合作用、呼吸作用和固氮作用等重要的代谢过程。缺铁条件下,植物对铁的吸收有两种机制:依赖于三价铁螯合物还原酶的机制Ⅰ类的双子叶和非禾本科单子叶植物和依赖于植... 详细信息

铁是植物生长发育必需的营养元素,参与植物体内一系列的生物反应,如光合作用、呼吸作用和固氮作用等重要的代谢过程。缺铁条件下,植物对铁的吸收有两种机制:依赖于三价铁螯合物还原酶的机制Ⅰ类的双子叶和非禾本科单子叶植物和依赖于植物根系分泌铁载体的机制Ⅱ类禾本科植物。缺铁会导致植物生长发育受阻,同时叶片表现出典型的的叶绿素含量降低。缺铁还可能造成其他营养元素的吸收和利用受阻,如大量元素氮,磷,钾等。梨树受到缺铁胁迫时,根际的H-ATPase向根际分泌H,造成土壤酸化,pH下降,三价铁溶解。并在三价铁螯合物还原酶的作用下,还原为二价铁,最后被二价铁转运体转运入梨树体内。随着H的外排,细胞内外的电化学势发生变化,影响植物对NO和K吸收。而梨树对矿质元素的吸收,主要依赖于其砧木的吸收能力。因此,本文以梨树砧木杜梨为材料,研究其在缺铁胁迫下的氮代谢的调控机制。同时研究‘砀山酥梨’叶片中GA含量变化及其信号转导相关基因的表达的差异。试验以杜梨组培苗为材料,克隆出与铁吸收及氮代谢的相关基因;测定不同缺铁时间下,Fe(III)-螯合物还原酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶等的酶活,并通过荧光定量PCR技术,分析不同缺铁时间下,铁吸收和氮代谢相关基因表达的差异。同时以‘砀山酥梨’组织培养试管苗叶片为试材,测定不同程度缺铁胁迫下叶片内源GA含量;采用荧光定量PCR技术,分析GA信号转导相关基因的表达差异。1、杜梨组培快繁体系的建立,杜梨试管苗的最适初代培养基是MS+6-BA 2.5mg/L+IAA 0.15 mg/L+GA3 0.05 mg/L;最适增殖培养基是MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.6 mg/L+GA3 0.6 mg/L;最适生根培养基为1/2 MS+IBA 0.5 mg/L。2、通过基因克隆,得到铁贮藏蛋白的4个家族基因(Fer1、Fer2、Fer3和Fer4),硝酸根离子低亲和转运系统3个家族基因(NRT1、NRT1.2和NRT1.3),硝酸根离子高亲和转运系统基因NRT2,三价铁螯合物还原酶基因(FRO2),硝酸还原酶基因NR、亚硝酸还原酶基因NIR,钾离子通道蛋白基因(SKOR、TP3和TP11),铁氧还蛋白的3个家族基因(Fd1、Fd2和Fd3),谷氨酸合成酶的2个家族基因(NADH-GOGAT、Fd-GOGAT),H-ATPase基因HA2,谷氨酰胺合成酶基因GILE,GA氧化酶基因GA2ox,共计得到21个基因的全长和1个基因的部分编码区。3、在缺铁处理前期,杜梨根中二价铁转运体基因IRT和三价铁螯合物还原酶基因FRO2表达量迅速上调,H-ATPase基因HA2也随后响应,基因表达量上调。同时,根中也检测到三价铁螯合物还原酶活性的升高。根中硝酸根低亲和转运家族基因NRT1.3和NRT1.2在缺铁后期发挥作用,表达量上调,而低亲和家族基因NRT1和高亲和家族基因NRT2则对缺铁胁迫没有明显的响应关系。缺铁胁迫下根中钾离子通道蛋白基因SKOR表达量上调,而TP11和TP3则没有明显的响应关系。4、杜梨叶片中硝酸还原酶基因NR和酶活性均在缺铁胁迫后期,表达量下调;亚硝酸还原酶基因NIR在缺铁胁迫前期,基因表达水平上调,而亚硝酸还原酶酶活的应答模式则比较复杂。受缺铁胁迫的影响,谷氨酰胺合酶基因GILE表达量上调而谷氨酰胺合酶酶活GS却下降;依赖于NADH提供电子的谷氨酸合酶基因NADH-GOGAT在缺铁初期基因表达水平上调,而依赖于铁氧还蛋白提供电子的谷氨酸合酶基因Fd-GOGAT表达量与谷氨酸合酶酶活变化趋势一致,均下调,推测响应缺铁胁迫的关键基因为谷氨酸合酶基因。同时对铁氧还蛋白的家族基因Fd1、Fd2和Fd3的表达量进行分析,发现铁氧还蛋白基因表达量并没有下调。5、‘砀山酥梨’叶片中GA含量会随着缺铁程度加重而增加,但是GA2ox基因表达量并未随缺铁程度增加而上调;赤霉素受体GID1的4个等位基因相对表达量均会随缺铁程度加重而增加,其相对表达量都与赤霉素含量呈正相关;DELLA蛋白的4个等位基因中,仅DELLA1相对表达量会随着缺铁程度加重而逐渐上调,表明它对缺铁胁迫最敏感。同时,缺铁诱导了赤霉素的合成,但并没有促进活性赤霉素向非活性赤霉素的转化。

关键词：组织培养缺铁响应钾转运氮代谢赤霉素