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微生物学报 1999年第5期39卷 408-415页

作者：马立新史巧娟周俊初陈华癸湖北大学生命科学院农业部农业微生物重点实验室华中农业大学武汉430070

将以绿荧光蛋白基因（ｇｆｐ）的ｃＤＮＡ为模板，用人工合成引物经ＰＣＲ扩增获得的０－９ｋｂＤＮＡ片段克隆到表达载体ｐＥＴ１１Ｃ上构建成ｇｆｐ表达载体ｐＨＮ１１５。从ｐＨＮ１１５上切下的不含启动子，但保留了ＳＤ... 详细信息

将以绿荧光蛋白基因（ｇｆｐ）的ｃＤＮＡ为模板，用人工合成引物经ＰＣＲ扩增获得的０－９ｋｂＤＮＡ片段克隆到表达载体ｐＥＴ１１Ｃ上构建成ｇｆｐ表达载体ｐＨＮ１１５。从ｐＨＮ１１５上切下的不含启动子，但保留了ＳＤ序列的ｇｆｐ基因经克隆载体ＳＫ（＋）和ｐＩＪ２９２５亚克隆后再克隆到广谱稳定性质粒ｐＴＲ１０２上构建成广谱、稳定、可视的启动子探针载体ｐＨＮ１２７。并用它从费氏中华根瘤菌ＨＮ０１的总ＤＮＡ中成功地钓出组成型和诱导型表达的启动子。

关键词：绿荧光蛋白基因中华根瘤菌启动子探针载体

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表达绿荧光蛋白的重组马立克氏病病毒814株的构建

表达绿荧光蛋白的重组马立克氏病病毒814株的构建

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作者：张晓巍中国农业科学院

学位级别：硕士

鸡马立克氏病(Marek's disease，MD)是由马立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)引起的鸡的一种高度传染性、淋巴组织增生性疾病。MDV疫苗株是一种良好的病毒载体，以它作为载体构建表达外源抗原的多价活疫苗来诱导免疫，可达到预... 详细信息

鸡马立克氏病(Marek's disease，MD)是由马立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)引起的鸡的一种高度传染性、淋巴组织增生性疾病。MDV疫苗株是一种良好的病毒载体，以它作为载体构建表达外源抗原的多价活疫苗来诱导免疫，可达到预防一种或多种禽病的目的。MDV血清Ⅰ型(MDV-1)814株是我国分离到的自然弱毒株，长期作为疫苗使用，免疫原性良好。选择其作为病毒载体构建重组病毒，可用于MD及其它禽病的防治，同时也可利用其研究MDV基因功能及肿瘤发生机制。本文利用MDV-1 814疫苗株作为载体，以病毒基因组US10基因区为插入位点，分别插入绿荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因表达盒、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)融合蛋白(Fusion，F)基因表达盒和禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)血凝素(Hemagglutinin，HA)基因表达盒，分别构建了包含NDV F基因、AIV HA基因和GFP基因的重组MDV转移载体质粒，同时获得了一株表达GFP的MDV 814株重组病毒。根据GenBank中已发表的MDV GA株US1-US10-SORF3基因序列，设计两对引物，并于各引物5’端引入酶切位点，以MDV 814株基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物作为同源重组的MDV同源臂。同源臂1的上游引物在US1基因中部，下游引物在US10基因上游，靠近起始密码子;同源臂2的上游引物在US10基因下游，靠近终止密码子，下游引物在SORF3基因中部。将两PCR产物按照预先设计的酶切位点，依次克隆入pUC19载体，构建成重组MDV转移载体质粒pUC-US10。经过与GA株序列比较，证实获得的MDV-1 814株同源臂序列与预期相符合。根据商品化表达质粒pEGFP-N1的序列，在其启动子上游及polyA下游分别设计一条引物，于引物5’端分别引入酶切位点，以质粒载体pEGFP-N1为模板进行PCR扩增，获得GFP基因表达盒，其中包含CMV启动子和SV40 polyA。将此基因表达盒克隆入载体质粒pUC-US10的SphI位点，获得包含GFP基因表达盒的重组MDV转移载体质粒pUC-US10-GFP。根据质粒pEGFP-F(包含NDV F基因表达盒)和pCIHA(包含AIV HA基因表达盒)核苷酸序列分别设计一对引物，PCR扩增其中的NDV F和AIV HA基因表达盒部分，并克隆入质粒pUC-US10的SphI位点，获得转移质粒载体pUC-US10-F和pUC-US10-HA。采用磷酸钙沉淀法，将MDV转移质粒载体pUC-US10-GFP与MDV 814株基因组总DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast，CEF)，经绿色荧光标记筛选，获得表达绿色荧光蛋白的重组MDV 814病毒。PCR鉴定证实GFP基因表达盒正确插入到MDV-1 814株US10基因中。重组病毒在CEF上继代20代后，PCR鉴定可检测到GFP基因，表明重组病毒能够在体外稳定遗传。通过测定重组病毒和亲本病毒的体外生长曲线，证明重组病毒的生长特性与亲本病毒无显著差异。本实验成功构建了表达绿色荧光蛋白的重组MDV 814株，为我国MD疫苗的研究及MDV基因功能的研究奠定基础。同时还构建了包含AIV HA基因和NDV F基因的重组转移载体质粒，在此基础上，可以通过反向筛选的方法获得表达AIV HA蛋白和NDV F蛋白的重组814病毒。AIV HA蛋白和NDV F蛋白都是抗原性非常好的蛋白，用它们构建重组MDV 814株，可以很好的诱导机体的体液免疫，从而达到同时预防几种禽病的目的。

关键词：马立克氏病病毒绿荧光蛋白基因重组病毒 US10基因 HA基因 F基囚

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早衰小鼠P1型（SAMP1）胚胎干细胞的建系研究

早衰小鼠P1型（SAMP1）胚胎干细胞的建系研究

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作者：程静波浙江理工大学

学位级别：硕士

自1981年小鼠胚胎干细胞成功建系以来,人们对胚胎干细胞的研究不断深入:（1）胚胎干细胞已成为研究细胞分化、器官发生以及了解胚胎发育机制的有效手段;（2）对胚胎干细胞进行基因操作有助于确定特定基因在发育、生理和病理过程中的作用... 详细信息

自1981年小鼠胚胎干细胞成功建系以来,人们对胚胎干细胞的研究不断深入:（1）胚胎干细胞已成为研究细胞分化、器官发生以及了解胚胎发育机制的有效手段;（2）对胚胎干细胞进行基因操作有助于确定特定基因在发育、生理和病理过程中的作用;（3）成功建系人类疾病动物模型的胚胎干细胞,结合近年来兴起的基因打靶（基因敲除或基因敲入）等生物技术,可以研究人类高血压、早衰等多种自发性疾病的发生机制,并对其治疗和预防提供科学依据。胚胎干细胞建系是进行所有这些研究的前提和基础。虽然胚胎干细胞建系技术已经获得了不断的丰富和完善,但是二十多年以来能够进行生殖系传代明确建系的种属仍然仅限于小鼠有限的几种品系,LIF加饲养层的有血清培养体系并不能通用于所有的小鼠及其他物种的胚胎干细胞建系工作。2008年华人科学家应其龙博士领头的研究小组基于“胚胎干细胞自我更新基态”理论利用2i小分子培养体系成功建立大鼠胚胎干细胞系为更多的小鼠品系甚至其它物种的胚胎干细胞建系工作带来了全新的理论与技术支持。本实验以医学研究热点之一的老年性疾病的动物实验模型早衰小鼠P1型即SAMP1小鼠作为研究对象,旨在通过应用新型的添加小分子的无血清2i新型培养体系对分离的SAMP1小鼠囊胚的内细胞团（ICM）进行培养而获得胚胎干细胞,成功建立SAMP1小鼠疾病动物模型的胚胎干细胞系。建立该疾病模型SAMP1小鼠胚胎干细胞系具有重大意义（:1）目前国内外从未有过早衰小鼠模型胚胎干细胞成功建系的报道,应用2i小分子培养体系建系成功很好的验证了这种培养体系的通用型;（2）对这种疾病模型小鼠胚胎干细胞的研究有助于人们清楚了解早衰的遗传学特征,从而确定疾病相关基因,并实施基因打靶等基因矫正技术,根据过早衰老、老年性耳聋等相关疾病的发生机理有的放矢,对症下药,为这类疾病最终的治疗和攻克奠定基础。本实验通过分离SAMP1小鼠囊胚内细胞团（ICM）、对其进行培养并对获得的胚胎干细胞进病毒感染,得出: 1. 3.5d SAMP1小鼠囊胚可以在2i培养条件下自然孵化出内细胞团（ICM）,进一步培养可获得类胚胎干细胞样克隆;2.对这些类胚胎干细胞样克隆进行AKP染色,Oct4,Sox2,SSEA-1基因表达免疫荧光染色以及Reverse Transcription PCR等胚胎干细胞的鉴定标准试验,表明这些呈克隆生长的细胞即为胚胎干细胞;3.用pCDNA-GFP慢病毒感染获得的SAMP1胚胎干细胞,可以得到持久携带绿荧光蛋白基因的SAMP1小鼠胚胎干细胞,传代次数30代以上仍可观察到荧光。

关键词：胚胎干细胞 SAMP1小鼠绿荧光蛋白基因

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重组腺相关病毒作为目标基因转移视网膜的载体的可行性研究(英文)

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国际眼科杂志 2008年第9期8卷 1740-1742页

作者：王建明范雅稚惠娜熊蕾冯海晓孙乃学西安交通大学医学院第二附属医院眼科中国陕西省西安市710004

目的:探讨重组腺相关病毒基因(recombinant adeno-associ-ated virus gene,rAAV)载体转导绿荧光蛋白基因(green fluorescent protein,gfp)基因至视网膜的可行性。方法:18只家兔随机选取一眼玻璃体内注射rAAV-gfp,对侧眼作为对照。分别... 详细信息

目的:探讨重组腺相关病毒基因(recombinant adeno-associ-ated virus gene,rAAV)载体转导绿荧光蛋白基因(green fluorescent protein,gfp)基因至视网膜的可行性。方法:18只家兔随机选取一眼玻璃体内注射rAAV-gfp,对侧眼作为对照。分别于注射后3,7,14d摘除眼球进行视网膜铺片观察视网膜的荧光。结果:家兔玻璃体注射rAAV-gfp后视网膜细胞浆内可见荧光点,提示gfp基因被有效转导至视网膜并进行荧光表达。结论:rAAV是一个可靠、简便易行的目标基因转移视网膜的载体。

关键词：重组腺相关病毒绿荧光蛋白基因基因转染视网膜

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