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双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

生物工程学报 2010年第12期26卷 1696-1703页

作者：李军华韩翠芹邓捷王华岩西北农林科技大学动物医学院陕西省干细胞工程技术研究中心陕西省农业分子生物学重点实验室杨凌712100

利用DNA同源重组方法(基因打靶)对动物基因组进行修饰是转基因研究的重要手段之一。为了构建一个高效的通用型基因打靶载体,本研究以pBS246质粒为骨架,在两个LoxP序列之间插入正筛选标记新霉素磷酸转移酶(neo)基因和绿色荧光蛋白(EGFP)... 详细信息

利用DNA同源重组方法(基因打靶)对动物基因组进行修饰是转基因研究的重要手段之一。为了构建一个高效的通用型基因打靶载体,本研究以pBS246质粒为骨架,在两个LoxP序列之间插入正筛选标记新霉素磷酸转移酶(neo)基因和绿色荧光蛋白(EGFP)基因;在两个LoxP序列外侧分别插入两组携带"8碱基"酶切位点的多克隆位点序列(MCS-1和MCS-2)和负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因,构建成通用型基因打靶载体pGT-V1,并且在C2C12细胞中验证了载体中各个元件的功能。该载体具有如下特点:1)在载体中引入绿色荧光标记,可以实时监控载体的转染效率,而转染效率的提高为高效基因打靶提供了保证;2)在两个LoxP位点间插入绿色荧光标记,可以直观监测打靶后遗留的筛选标记的去除情况,并且可以通过流式细胞仪或免疫磁珠法,将最终去除了筛选标记的阳性细胞(即丢失绿色荧光的细胞)分选出来,降低筛选标记在中靶细胞中可能产生的负面影响;3)采用"8碱基"酶切位点的MCS序列,便于DNA大片段的连接和重组,极大提高了该载体的通用性。总之,该载体优化了基因打靶的技术手段,为有效开展基因打靶和转基因动物研究提供了新平台。

关键词：同源重组绿色荧光标记打靶载体 Cre-LoxP

利用藻酸盐与骨髓间充质干细胞及前列腺癌细胞混合培养:观察干细胞对癌细胞增殖速度及成簇大小的影响

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中国组织工程研究与临床康复 2010年第6期14卷 1009-1014页

作者：解杰陈安民郭风劲王建超廖晖柳昊陈超华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科湖北省武汉市430030

背景:肿瘤外环境研究的模型主要集中在实验室细胞的二维培养与体外动物实验,缺乏三维立体模型的研究与构建。目的:体外模拟肿瘤骨转移的三维模型,并比较在有无骨髓间质干细胞时前列腺癌细胞的增殖速度与成簇大小以及成簇率。方法:清洁... 详细信息

背景:肿瘤外环境研究的模型主要集中在实验室细胞的二维培养与体外动物实验,缺乏三维立体模型的研究与构建。目的:体外模拟肿瘤骨转移的三维模型,并比较在有无骨髓间质干细胞时前列腺癌细胞的增殖速度与成簇大小以及成簇率。方法:清洁级SD大鼠2只用于提取骨髓间质干细胞。利用藻酸盐模拟骨髓微环境,将前列腺癌细胞与SD大鼠骨髓间质干细胞在藻酸钙中共培养。通过显微镜与组织切片观察细胞在模型中的生长情况。利用绿色荧光蛋白转染肿瘤细胞,通过培养在普通光及荧光显微镜下观察三维模型中肿瘤单克隆的生长扩增情况。结果与结论:有干细胞存在共培养的三维藻酸钙微环境中前列腺癌细胞的成簇速度、数量及成瘤率均较对照组高。对照组在7.75d、有干细胞的混合培养组在6.00d能形成单克隆细胞簇,10d后对照组瘤簇细胞计数为(95.13±11.63)个;有干细胞的混合培养组为(112.53±14.67)个,荧光细胞克隆形成率对照组为(77.10±6.85)%;有干细胞的混合培养组为(64.55±6.21)%;两者相比均有显著性意义。结果提示前列腺癌细胞与骨髓基质干细胞在藻酸钙微球环境中,有利于细胞增殖及成簇性发展。

关键词：前列腺癌骨转移模型共培养藻酸钙凝胶绿色荧光标记骨髓间充质干细胞

pBBR1MCS2-Tac-EGFP广宿主载体适宜标记Ralstonia solanacearum

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热带作物学报 2021年第6期42卷 1700-1705页

作者：肖熙鸥林文秋陈卓邹春香金辉邹华芬中国热带农业科学院南亚热带作物研究所广东湛江524091 农业农村部热带果树生物学重点实验室广东湛江524091 甘肃农业大学农学院甘肃兰州730070 广州市园林建筑工程公司广东广州510180

利用标记基因追踪病原菌在植物体内的入侵和定殖,是研究病原菌-寄主互作的重要手段。本研究利用电转化法将广宿主载体pBBR1MCS2-Tac-EGFP导入青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)GMI1000菌株中,获得了青枯雷尔氏菌带绿色荧光标记的转... 详细信息

利用标记基因追踪病原菌在植物体内的入侵和定殖,是研究病原菌-寄主互作的重要手段。本研究利用电转化法将广宿主载体pBBR1MCS2-Tac-EGFP导入青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)GMI1000菌株中,获得了青枯雷尔氏菌带绿色荧光标记的转化子。转接试验结果表明,转化子的抗生素抗性和绿色荧光强度有良好的遗传稳定性。pBBR1MCS2-Tac-EGFP不影响GMI1000菌株的致病力,且EGFP蛋白能够在植物中稳定表达。灌根法接种试验结果表明,病原菌在第1天即完成对根系的侵染,并在第6天扩散至其他组织,随后造成植株萎蔫。研究结果表明所获转化子可用于后续的病原菌侵染机理等方面的研究。

关键词：青枯雷尔氏菌绿色荧光标记侵染动态 pBBR1MCS2-Tac-EGFP载体

绿色荧光蛋白标记的枯草芽胞杆菌R31在西芹根际定殖研究

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中国农学通报 2014年第9期30卷 237-241页

作者：陈燕红黎永坚喻国辉陈远凤珠海市农业科学研究中心广东珠海519070

为了更直观地了解植物内生枯草芽胞杆菌R31在西芹根际定殖情况,评估其定殖能力,为西芹黄萎病生物防治提供依据。通过原生质体转化法将携带绿色荧光蛋白基因的质粒pHT315-gfp导入枯草芽胞杆菌R31细胞中,对菌株进行gfp标记,然后利用gfp标... 详细信息

为了更直观地了解植物内生枯草芽胞杆菌R31在西芹根际定殖情况,评估其定殖能力,为西芹黄萎病生物防治提供依据。通过原生质体转化法将携带绿色荧光蛋白基因的质粒pHT315-gfp导入枯草芽胞杆菌R31细胞中,对菌株进行gfp标记,然后利用gfp标记菌株灌根处理西芹苗,研究其在西芹根际的定殖形式和能力。结果获得了携带pHT315-gfp质粒的R31-gfp菌株,该质粒可以在R31细胞中稳定表达,标记菌R31-gfp在蓝光激发下可以稳定发出强的绿色荧光。利用标记菌接种西芹幼苗后,可以在根系表皮检测到绿色荧光膜。对其定殖量的检测发现,接种3天后标记菌在根表和根际土中稳定定殖,定殖量分别达到1.4×104cfu/g和7.6×104cfu/g,并长期以该水平稳定定殖,到第65天仍可在根表和根际土检测到9.1×104cfu/g和3.17×105cfu/g的R31-gfp。由此得出,R31可以在西芹根表形成菌膜,并在根际长期稳定定殖。

关键词：枯草芽胞杆菌绿色荧光标记西芹根际定殖

类芽孢杆菌QHZ11-gfp在马铃薯植株上的定殖特征及促生效果

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微生物学通报 2021年第11期48卷 4075-4086页

作者：董爱菊邱慧珍董莉周洋子陈兰兰王友玲王川甘肃农业大学资源与环境学院甘肃省干旱生境作物学重点实验室甘肃兰州730070 甘肃省畜禽废弃物资源化利用工程研究中心甘肃兰州730070 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

【背景】生防菌在作物根系的有效定殖是其功能发挥的前提,而直观的跟踪技术和有效的定量方法是研究生防菌根系分布规律的重要工具。【目的】研究马铃薯黑痣病病原菌立枯丝核菌(Rhizo ctonia solani)JT18的拮抗菌QHZ11在马铃薯植株上的... 详细信息

【背景】生防菌在作物根系的有效定殖是其功能发挥的前提,而直观的跟踪技术和有效的定量方法是研究生防菌根系分布规律的重要工具。【目的】研究马铃薯黑痣病病原菌立枯丝核菌(Rhizo ctonia solani)JT18的拮抗菌QHZ11在马铃薯植株上的定殖特征及对马铃薯的促生效果。【方法】采用绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)对QHZ11进行标记,将标记菌株菌悬液、生物有机肥和无菌水分别接种至灭菌土壤,通过激光共聚焦显微技术和实时荧光定量PCR等方法观察和测定标记菌株在马铃薯植株不同部位的定殖特征、数量变化及对马铃薯的促生效果。【结果】pHAPII质粒成功导入QHZ11并可稳定遗传40代,记为QHZ11-gfp;菌株标记前后的菌落形态、生长曲线和对R. solani JT18的拮抗能力等基本一致。从第7天开始,相继在马铃薯芽上和根上发现了绿色荧光,说明QHZ11-gfp成功定殖到了马铃薯的芽、根等部位。QHZ11-gfp在根系和匍匐茎的定殖数量均呈现先升高至块茎形成期达到峰值后下降的趋势,并且在整个生育期根系的定殖数量始终大于匍匐茎。菌悬液和生物有机肥处理均显著促进了马铃薯根系的生长,并通过增加株高等农艺性状提高了块茎产量。其中,生物有机肥处理在各部位的荧光强度、定殖数量和对马铃薯的促生效果均显著优于菌悬液。【结论】QHZ11-gfp可在马铃薯植株上成功定殖并对马铃薯有良好的促生效果,将其制成生物有机肥促进了其定殖,使促生效果也更好。

关键词：类芽孢杆菌绿色荧光标记定殖特征实时荧光定量PCR 促生作用

烟草新驱动蛋白NtTKR过表达对酵母生长的影响

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河南师范大学学报（自然科学版） 2014年第6期42卷 97-102页

作者：李芬任向波腾飞吴秀丽田树娟河南师范大学生命科学学院河南新乡453007 河南师范大学资源微生物与功能分子河南省高校重点实验室培育基地河南新乡453007 河南省科学院郑州450008 武汉大学生命科学学院武汉430072

为了解烟草新驱动蛋白NtTKR功能信息,构建了EGFP融合的NtTKR基因酵母表达载体并转入酿酒酵母W303诱导表达,荧光显微镜观察结果表明,诱导条件下的转化细胞发出明亮的绿色荧光,表明转入的NtTKR得到了高效表达.转化株在诱导和非诱导条件下... 详细信息

为了解烟草新驱动蛋白NtTKR功能信息,构建了EGFP融合的NtTKR基因酵母表达载体并转入酿酒酵母W303诱导表达,荧光显微镜观察结果表明,诱导条件下的转化细胞发出明亮的绿色荧光,表明转入的NtTKR得到了高效表达.转化株在诱导和非诱导条件下培养3d,可见NtTKR过表达菌落比对照小的多;但通过绘制8h内生长曲线发现二者细胞数目无显著差别;表明NtTKR过表达对酵母细胞生长的抑制可能更多的是因为抑制其体积增大,而非分裂速度减慢引起的细胞数目降低.已知NtTKR在烟草受精卵、发育各个时期的胚、幼叶、根尖及茎尖等细胞分裂旺盛部位均优势表达,推测该基因在烟草中可能与上述各部位新生细胞的体积增大相关.

关键词：驱动蛋白 NtTKR 绿色荧光标记细胞分裂体积增大

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阜新地区人工增雨潜力分析与对策研究

中国农学通报 2015年第9期31卷 237-246页

作者：孙宝利张旭孙可曹铭书辽宁省阜新市气象局辽宁阜新123099

为了有效开发空中云水资源,增加地面降水量,笔者利用1981—2010年辽宁省阜新市国家基本气象观测站历史天气资料和降水实况数据,依据人工增雨技术原理,统计、分析了阜新地区云水资源分布特征和人工增雨潜力,并对人工增雨对策进行研究。... 详细信息

为了有效开发空中云水资源,增加地面降水量,笔者利用1981—2010年辽宁省阜新市国家基本气象观测站历史天气资料和降水实况数据,依据人工增雨技术原理,统计、分析了阜新地区云水资源分布特征和人工增雨潜力,并对人工增雨对策进行研究。结果表明:(1)阜新地区年均拥有云水资源总量238.4×108m3,而实际年均降水量只有471.8 mm,相当于水资源量47.2×108m3,仅为所拥有云水资源总量的16.5%,可见阜新地区具有较大的人工增雨潜力;(2)利用本研究建立的适合阜新地区人工增雨的天气模型和技术指标,开展具有针对性的12次人工增雨作业试验,增雨效率平均为18.3%,比原来提高了5.2%,年均可增加水资源量约2.5×108m3,对阜新地区科学、有效实施人工增雨作业,最大限度地开发云水资源,增加全市水资源总量,缓解干旱,具有较大的指导意义。

关键词：枯草芽胞杆菌绿色荧光标记西芹根际定殖