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绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量PCR检测方法的建立

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绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量PCR检测方法的建立

作者：迟庆安新疆农业大学

学位级别：硕士

无浆体（Anaplasma）是一类经蜱传播的专性细胞内寄生菌，主要寄生于牛羊等反刍动物的血细胞中，其引起的疾病被称为无浆体病。已知的无浆体病原包括边缘无浆体（A. marginale）、绵羊无浆体（A. ovis）、中央无浆体（A. centrale）、... 详细信息

无浆体（Anaplasma）是一类经蜱传播的专性细胞内寄生菌，主要寄生于牛羊等反刍动物的血细胞中，其引起的疾病被称为无浆体病。已知的无浆体病原包括边缘无浆体（A. marginale）、绵羊无浆体（A. ovis）、中央无浆体（A. centrale）、牛无浆体（A. bovis）、嗜吞噬细胞无浆体（A. phagocytophilum）和扁平无浆体（A. platys）。建立高效快速准确的诊断方法，对于该病的防控具有重要作用。实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，使其很快成为疾病检测和诊断的热点技术。目前，国内外均未有检测绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量PCR方法的报道。利用实验室保存的12株绵羊无浆体的gltA基因进行克隆测序。然后根据获得的绵羊无浆体和GenBank上其他相近病原体的gltA基因序列设计出针对绵羊无浆体的实时荧光定量引物和探针，建立了一种检测绵羊无浆体的实时荧光定量PCR方法。该方法特异性强，与相近病原如边缘无浆体、牛无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、支原体、衣原体、螺旋体、巴贝斯虫（新疆分离株）和吕氏泰勒虫无交叉反应。检测灵敏度约10拷贝/μL。该方法具有较好的稳定性，组内试验和组间试验Ct值变异系数分别在在0.26％-0.97％和0.42%-1.5%。对野外采集的254份山羊血液样品分别使用该方法和普通PCR方法进行检测，阳性率分别为25.6%和9.06%，结果表明实时荧光定量PCR方法具有更高的敏感性。建立的绵羊无浆体实时荧光定量PCR方法可以有效检测绵羊无浆体感染。根据GenBank上牛无浆体及其他相近病原体16S rRNA基因序列设计出针对牛无浆体的实时荧光定量引物和探针，建立了一种检测牛无浆体实时荧光定量PCR方法。该方法特异性好，与相近病原如边缘无浆体、绵羊无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫、中华泰勒虫、巴贝斯虫（新疆分离株）、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、支原体、衣原体、螺旋体和弓形虫无交叉反应。检测灵敏度约10拷贝/μL。该方法稳定性好，组内试验和组间试验Ct值变异系数分别在0.10%-1.01%和0.61%-1.88%，对野外采集的196份牛和山羊血液样品分别使用实时荧光定量PCR方法和套式PCR方法进行检测，阳性率分别为62.2%和56.6%，结果表明实时荧光定量PCR方法具有更高的敏感性。建立的牛无浆体实时荧光定量PCR方法可以有效检测牛无浆体感染。

关键词：绵羊无浆体牛无浆体实时荧光定量PCR 检测

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新疆革蜱源性绵羊无浆体病原DNA检测

新疆农业科学 2016年第1期53卷 185-189页

作者：张玉婷孟元郭庆勇王振宝吴敏张杨巴音查汗新疆农业大学动医学院乌鲁木齐830052 浙江大学生科院杭州310058

【目的】探究新疆部分地区羊体表寄生的优势革蜱携带病原状况。【方法】采用形态学(借助显微镜)和分子生物学(革蜱种属特异性ITS-2F、ITS-2R引物进行扩增)方法,对采集于阿勒泰、巴音郭楞州等地州羊体表寄生的蜱虫(N=267)进行种属鉴定,... 详细信息

【目的】探究新疆部分地区羊体表寄生的优势革蜱携带病原状况。【方法】采用形态学(借助显微镜)和分子生物学(革蜱种属特异性ITS-2F、ITS-2R引物进行扩增)方法,对采集于阿勒泰、巴音郭楞州等地州羊体表寄生的蜱虫(N=267)进行种属鉴定,对其携带的绵羊无浆体病原(MSP4基因为靶标)DNA进行PCR检测。【结果】当地羊体表寄生的优势种革蜱为草原革蜱(***)、森林革蜱(***)和边缘革蜱(***),均能携带病原MSP4基因,且这三种革蜱种特异基因扩增产物序列(820 bp)与已登录记载的同种革蜱的核苷酸同源性为99%。被革蜱叮咬的126份羊全血样品中34份为绵羊无浆体阳性,均能扩增出850 bp目的基因条带。【结论】新疆阿勒泰地区、巴音郭楞州等地州羊群感染了绵羊无浆体病,其阳性率为27%(34/126)。为进一步研究新疆革蜱的公害州及羊无浆体病的综合防治提供科学依据。

关键词：革蜱鉴定绵羊无浆体病原DNA 检测

基于绵羊无浆体Groel基因的PCR方法的建立

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河南农业大学学报 2019年第6期53卷 891-895页

作者：赵姗姗彭永帅王坤轮闫亚群菅复春宁长申河南农业大学牧医工程学院

利用绵羊无浆体(Anaplasma ovis)高度保守的Groel基因,建立了快速、特异、敏感的绵羊无浆体检测方法。根据GenBank上登录的绵羊无浆体Groel基因序列(FJ460438),设计1对特异性引物,建立了绵羊无浆体PCR检测方法,并对其进行特异性、敏感... 详细信息

利用绵羊无浆体(Anaplasma ovis)高度保守的Groel基因,建立了快速、特异、敏感的绵羊无浆体检测方法。根据GenBank上登录的绵羊无浆体Groel基因序列(FJ460438),设计1对特异性引物,建立了绵羊无浆体PCR检测方法,并对其进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测。结果显示,该方法能特异性地检测绵羊无浆体,与山羊无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、牛无浆体、边缘无浆体、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、羊附红细胞体、弓形虫基因组均无交叉反应;该方法检测下限可达到7.7×10-15 g·μL-1,比文献报道的PCR敏感10倍(77×10-15 g·μL-1);具有良好的重复性;对81份羊临床血液样品检测结果表明,绵羊无浆体感染率为32.1%(26/81),高于文献报道的PCR(MSP4基因)检测结果(18.5%,15/81)。

关键词：绵羊无浆体无浆体病 Groel基因聚合酶链式反应

新疆部分地区优势种革蜱携带绵羊无浆体的检测及其进化关系

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中国兽医学报 2018年第9期38卷 1699-1703页

作者：闻秀秀王宁苏布赛刘世芳许正茂吾力江·卡马力巴音查汗新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 延边出入境检验检疫局吉林延边133003 和静镇畜牧兽医站新疆和静841300

为了研究新疆部分地区优势种革蜱携带绵羊无浆体的情况及其进化关系,将2015—2016年在新疆部分地区共13个县市的试验点采集的4种优势种革蜱做为试验材料,通过PCR方法检测其是否携带绵羊无浆体,将目的条带送去测序,测序结果在NCBI上进行B... 详细信息

为了研究新疆部分地区优势种革蜱携带绵羊无浆体的情况及其进化关系,将2015—2016年在新疆部分地区共13个县市的试验点采集的4种优势种革蜱做为试验材料,通过PCR方法检测其是否携带绵羊无浆体,将目的条带送去测序,测序结果在NCBI上进行BLAST比对,进行同源性分析。结果显示,该序列与绵羊无浆体（KU497712.1）同源性达98%,确定为绵羊无浆体;蜱源性检测绵羊无浆体的携带率为14.4%,仅检测出银盾革蜱和边缘革蜱携带绵羊无浆体,其携带率分别为33.6%,24.0%,可确定银盾革蜱及边缘革蜱为绵羊无浆体的媒介蜱。结果表明,明确绵羊无浆体的媒介蜱,控制其传播范围,从而降低该病在新疆地区暴发流行的可能性,为新疆绵羊无浆体病原及其传播媒介蜱的研究提供理论参考。

关键词：银盾革蜱优势种群绵羊无浆体遗传多样性

昌吉市及周边地区散养牛绵羊无浆体的PCR检测及感染情况调查

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黑龙江畜牧兽医 2019年第8期 64-66页

作者：于昊江闻秀秀吾力江赛迪拉木李仿鑫巴音查汗新疆昌吉州人力资源和社会保障局新疆昌吉831100 新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052

为了了解昌吉市、阜康市和呼图壁县散养牛携带绵羊无浆体情况,试验于2017年在昌吉市、阜康市和呼图壁县等3个市(县)的试验点采集牛血样共90份,通过PCR方法检测,最后经测序确诊病原。结果表明:PCR检测可特异地扩增出322 bp的目的片段,该... 详细信息

为了了解昌吉市、阜康市和呼图壁县散养牛携带绵羊无浆体情况,试验于2017年在昌吉市、阜康市和呼图壁县等3个市(县)的试验点采集牛血样共90份,通过PCR方法检测,最后经测序确诊病原。结果表明:PCR检测可特异地扩增出322 bp的目的片段,该序列与绵羊无浆体(HQ456350.1、KJ782397.1、HM063433.1)的同源性达99%,确定为绵羊无浆体。阜康市、昌吉市和呼图壁县散养牛感染绵羊无浆体的阳性率为分别为63%(19/30)、10%(3/30)、0(0/30),总感染率为24%(22/90)。说明阜康市、昌吉市散养牛携带绵羊无浆体,应该加强防范。

关键词：昌吉市阜康市呼图壁县散养牛绵羊无浆体 PCR检测感染调查

新疆优势种革蜱超微结构鉴定及其携带绵羊无浆体的分子诊断

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新疆优势种革蜱超微结构鉴定及其携带绵羊无浆体的分子诊断

作者：吴辉新疆农业大学

学位级别：硕士

蜱是动物体表依靠吸食血液生存的节肢动物,对病原的传播及危害程度仅次于蚊类,同时也是动物和人类多种疾病的贮藏宿主和传播媒介。蜱隶属节肢动物门(Arthropoda)、蛛形纲(Arachnida)、蜱螨亚纲(Acari)、寄螨总目(Parasitiformes)、蜱目(... 详细信息

蜱是动物体表依靠吸食血液生存的节肢动物,对病原的传播及危害程度仅次于蚊类,同时也是动物和人类多种疾病的贮藏宿主和传播媒介。蜱隶属节肢动物门(Arthropoda)、蛛形纲(Arachnida)、蜱螨亚纲(Acari)、寄螨总目(Parasitiformes)、蜱目(Ixodida)。新疆地区以革蜱和璃眼蜱为优势种,可引起无浆体病、Q热、巴贝斯虫病、泰勒虫病、森林脑炎、新疆出血热及莱姆病等,对畜牧业及人类健康造成了巨大的危害。在我区有关革蜱的研究报道甚少,尤其是超微形态学方面,本研究通过体视显微镜和扫描电子显微镜对新疆地区优势种革蜱形态特征进行了研究,并对其携带绵羊无浆体病原进行分子诊断,明确绵羊无浆体的媒介蜱,为媒介蜱的准确鉴定及蜱媒人畜共患病的综合防控提供了科学依据。(Ⅰ)本研究为了明确新疆优势种革蜱超微结构鉴别特征,以期准确鉴别媒介蜱;以新疆地区4种优势种革蜱—边缘革蜱(***)、草原革蜱(***)、森林革蜱(***)和银盾革蜱(***)为实验材料,先借助体视显微镜鉴定物种后,再通过扫描电子显微镜(SEM)进行超微结构观察。结果显示:银盾革蜱、森林革蜱、草原革蜱和边缘革蜱除躯体、盾板珐琅彩存在区别外,银盾革蜱和边缘革蜱的肢节Ⅳ(股节、胫节和跗节)腹面都具有3个齿状突,而草原革蜱的3个齿状突位于胫节和跗节,森林革蜱仅跗节有3个齿状突。此外,这4种优势种革蜱须肢腹面内侧缘刚毛排列、爪垫长度与爪长度之间的比例等特征相互区别。本次研究发现银盾革蜱、森林革蜱、草原革蜱及边缘革蜱以肢节Ⅳ腹面齿状突和气门板为鉴别特征,结合须肢腹面内侧缘刚毛排列、爪垫长度与爪长的比例等特征,可快速准确鉴别。(Ⅱ)本试验阐明了革蜱各发育阶段形态及其发育特点,为各龄期革蜱类的防治提供一定的科学依据。以革蜱属中的银盾革蜱为模式种,借助体视、扫描电子等显微镜对银盾革蜱各龄期虫体首次进行了较为详细的超微形态研究。银盾革蜱虫卵、幼蜱、若蜱和成蜱超微结构上存在明显区别,虫卵多为长椭圆形,随着孵化天数的增加,虫卵颜色及内部结构发生明显改变;幼蜱口下板齿式为2|2、肢节为3对(Ⅰ)、无气门板、无生殖孔、肛门瓣刚毛1对、无肛后沟等;若蜱口下板齿式为3-2|2-3、肢节为4对(Ⅰ)、无生殖孔但具有气门板、肛门瓣刚毛3对、假头基为三角形等;成蜱雄性的口下板齿式为3|3、具有生殖孔和气门板、肛门瓣刚毛5对半、肢节Ⅳ(股节、胫节和跗节)腹面都具有3个齿状突等;成蜱雌性的口下板齿式为4-3|3-4、每一侧孔区具有一根刚毛、肛门瓣刚毛5对、肢节Ⅳ无齿状突等。(Ⅲ)根据GenBank登录的MSP4(major surface protein 4)基因序列设计绵羊无浆体(Anaplasma ovis)种属特异性引物,对各优势种革蜱携带绵羊无浆体通过PCR方法进行检测,可特异性扩增到322 bp的片段,经测序后进行对比分析与绵羊无浆体(KU497712.1)同源性达98%,结果表明采自新疆阿勒泰地区、吐鲁番地区以及乌鲁木齐周边羊(绵羊、山羊)体表革蜱类绵羊无浆体的携带率14.4%(72/500),在上述采集地区革蜱源性绵羊无浆体病原PCR检测,仅检测出银盾革蜱和边缘革蜱携带绵羊无浆体,其携带率分别为33.6%(42/125),24.0%(30/125),可确定银盾革蜱及边缘革蜱为绵羊无浆体的媒介蜱。

关键词：革蜱超微结构分子检测绵羊无浆体新疆

昌吉部分地区牛感染蜱传绵羊无浆体的情况调查

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昌吉部分地区牛感染蜱传绵羊无浆体的情况调查

作者：于昊江新疆农业大学

学位级别：硕士

绵羊无浆体主要感染绵羊、山羊等,给养羊业造成了重大经济损失。有研究表明,绵羊无浆体还可以感染牛。目前,牛感染绵羊无浆体的报道较少。绵羊无浆体在不同宿主之间的传播需要蜱虫参与,而蜱虫分布具地理隔离特征,不同地区传播绵羊无浆... 详细信息

绵羊无浆体主要感染绵羊、山羊等,给养羊业造成了重大经济损失。有研究表明,绵羊无浆体还可以感染牛。目前,牛感染绵羊无浆体的报道较少。绵羊无浆体在不同宿主之间的传播需要蜱虫参与,而蜱虫分布具地理隔离特征,不同地区传播绵羊无浆体的媒介蜱可能不同,为了完善昌吉地区绵羊无浆体在牛群中的流行病学资料,本文将开展以下研究。(1)本文从昌吉市、阜康市、呼图壁县、奇台县、木垒县、吉木萨尔县、玛纳斯县7个县、市部分牛场、牧民的803头牛体表采集成蜱1046只。用体视显微镜观察这些蜱虫的外部结构,对蜱虫做出形态学鉴定分类。结果显示:牛体表感染蜱虫有6种,分别为边缘革蜱、小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、草原革蜱、血红扇头蜱、血蜱。牛感染蜱类优势度分别为边缘革蜱(39.7%)、小亚璃眼蜱(30.8%)、亚洲璃眼蜱(14.6%)。(2)分别提取了 1046只蜱虫的DNA,通过对绵羊无浆体MSP4基因的PCR扩增检测,发现牛体表蜱携带绵羊无浆体的阳性率最高的3种蜱分别是:小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和边缘革蜱。分析得出,上述三种蜱不仅是昌吉部分地区优势种群,也是绵羊无浆体的媒介蜱。(3)本实验在阜康市、昌吉市和呼图壁县3个试验采集点,抽取了 90份被携带绵羊无浆体的蜱虫叮咬过的牛全血,进行绵羊无浆体MSP4基因PCR检测。结果显示:阜康市、昌吉市和呼图壁县绵羊无浆体的阳性率为分别为63%(19/30)、10%(3/30)、0%(0/30),总感染率为24.4%(22/90)。说明牛不但感染了绵羊无浆体,且有些地区感染率较高。

关键词：牛蜱传绵羊无浆体感染调查昌吉

新疆南疆部分地区绵羊的绵羊无浆体病感染情况调查

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现代畜牧兽医 2021年第3期 65-69页

作者：林留霞桂成坤李莲瑞塔里木大学动物科学学院新疆阿拉尔843300 塔里木畜牧科技兵团重点实验室新疆阿拉尔843300

为了解南疆地区绵羊感染绵羊无浆体感染状况,试验从南疆4个地区(喀什、和田、阿克苏、巴音郭楞蒙古自治州)的21个县市采取绵羊血液样品,进行流行病学调查。对采集的637份血液样品中绵羊无浆体的16S rRNA进行巣式PCR扩增,并分析584 bp片... 详细信息

为了解南疆地区绵羊感染绵羊无浆体感染状况,试验从南疆4个地区(喀什、和田、阿克苏、巴音郭楞蒙古自治州)的21个县市采取绵羊血液样品,进行流行病学调查。对采集的637份血液样品中绵羊无浆体的16S rRNA进行巣式PCR扩增,并分析584 bp片段的阳性样品。结果表明:巴州、喀什、和田和阿克苏地区的感染率分别为75.8%、34.8%、23.3%和23.0%,平均感染率为33.3%;采样点各县市中感染率最高的为巴楚县91.4%,最低为阿瓦提县感染率10.3%,各地区感染率差异性较大。调查说明,新疆南疆地区属于绵羊无浆体病高发地区,急需采取科学防控措施。

关键词：南疆绵羊绵羊无浆体巢式PCR

伊吾县部分养殖场感染绵羊无浆体病的流行病学调查

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新疆畜牧业 2020年第2期35卷 27-31页

作者：姜媛马钰党娜娜祖力牙刘一凡范士龙巴音查汗新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 伊吾县农业农村局新疆伊吾839300

为了解2016~2018年伊吾县部分养殖场感染绵羊无浆体病的情况,实验采用统计学方法和分子生物学方法对羊体表媒介蜱进行种群结构分析,对疑似羊全血进行流行病学调查。结果表明,鉴定出硬蜱2属4种,璃眼蜱属为该地区羊体表寄生蜱的主要群落物... 详细信息

为了解2016~2018年伊吾县部分养殖场感染绵羊无浆体病的情况,实验采用统计学方法和分子生物学方法对羊体表媒介蜱进行种群结构分析,对疑似羊全血进行流行病学调查。结果表明,鉴定出硬蜱2属4种,璃眼蜱属为该地区羊体表寄生蜱的主要群落物种,残缘璃眼蜱和小亚璃眼蜱染蜱率、蜱指数较高,亚洲璃眼蜱蜱指数最低为0.15;吐葫芦乡种群结构较为丰富、多样,盐池镇、淖毛湖镇种群结构参数相似;蜱源性病原检测仅小亚璃眼蜱检测出携带绵羊无浆体,蜱源性无浆体病总阳性率为3.96%,血源性绵羊无浆体总阳性率为14.60%(87/596),其中淖毛湖镇绵羊无浆体阳性率最高为20.13%(30/149),1绵羊无浆体感染较高为7.55%(45/596)。本次调查结果为伊吾县媒介蜱和绵羊无浆体病的综合防控提供参考依据。

关键词：璃眼蜱绵羊无浆体分子检测流行病学