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中国医药 2013年第4期8卷 472-474页

作者：李杰刘双郭伟陈勇高元明首都医科大学附属北京安贞医院呼吸科北京市心肺血管疾病研究所 100029

目的建立一种快速、准确、简便、经济的检测维生素k环氧化物还原酶复合体亚单位1（VkORC1）和细胞色素P450 2C9（CYP2C9）基因型的方法。方法提取220例肺栓塞患者外周血的DNA，针对2个基因的SNP位点设计特异性引物，并进行荧光聚合酶链... 详细信息

目的建立一种快速、准确、简便、经济的检测维生素k环氧化物还原酶复合体亚单位1（VkORC1）和细胞色素P450 2C9（CYP2C9）基因型的方法。方法提取220例肺栓塞患者外周血的DNA，针对2个基因的SNP位点设计特异性引物，并进行荧光聚合酶链反应（PCR），根据荧光PCR的熔解曲线分析样本的基因型。同时对样本进行传统的限制性酶切片段长度多态性（PCR—RFLP）基因分型，从时间、通量、费用、准确性等方面对2种方法进行比较。结果VkORC1 1693G〉A和CYP2C91 075A〉C两个SNP位点的不同基因型具有不同的熔解曲线峰型。220例样本中，VkORC1基因AA型184例，AG型34例，GG型2例，各占83．6％、15．5％、0．9％；CYP2C9基因＊1／＊1型加1例，＊1／＊3型19例，各占91．4，％、8．6％，无＊3／＊3型纯合子。PCR-RFLP检测结果与上述结果基本相同。2种方法相比，前者较后者操作步骤少，用时少，费用相当，结果更准确。结论利用荧光PCR检测VkORC1及CYP2C9的SNP分型操作简便、快速、经济、准确，适用于临床实验室开展基因分型。

关键词：荧光聚合酶链反应维生素k环氧化物还原酶细胞色素P450 2C9

一种基于细胞测定维生素k环氧化物还原酶活性的方法

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河南师范大学学报（自然科学版） 2022年第4期50卷 107-111页

作者：徐亚奇王一伊李飞邱稳辉沈滟沈国民河南科技大学基础医学院河南洛阳471023 河南科技大学河南省血栓与止血国际联合实验室河南洛阳471023

维生素k环氧化物还原酶(VkOR)是开发抗凝药的重要靶点,其活性测定对鉴定靶向VkOR新型抑制剂具有重要的应用价值.目前测定VkOR活性的常用方法为基于报告基因的方法,是一种间接测定VkOR活性的方法,不能用于鉴定靶向VkOR新型抑制剂.为建立... 详细信息

维生素k环氧化物还原酶(VkOR)是开发抗凝药的重要靶点,其活性测定对鉴定靶向VkOR新型抑制剂具有重要的应用价值.目前测定VkOR活性的常用方法为基于报告基因的方法,是一种间接测定VkOR活性的方法,不能用于鉴定靶向VkOR新型抑制剂.为建立一种快速、直接测定VkOR活性的方法,首先建立了一种基于HPLC检测维生素k(Vk)和维生素k环氧化物(VkO)的方法,该方法简便快速,准确性高,重复性好,各检测物色谱峰分离良好.在此基础上,利用GGCX基因敲除的细胞,建立了直接测定细胞内VkOR活性的方法,更加便捷地鉴定靶向VkOR抑制剂,为研发靶向VkOR新型抗凝药提供帮助.

关键词：维生素k环氧化物还原酶高效液相色谱维生素k 维生素k环氧化物华法林

孕期脱氢乙酸钠暴露对孕鼠及胎鼠骨代谢影响及其机制初探

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孕期脱氢乙酸钠暴露对孕鼠及胎鼠骨代谢影响及其机制初探

作者：毕思才扬州大学

学位级别：硕士

脱氢乙酸钠(Sodiumdehydroacetate,DHA-S)因其广谱的抗菌作用而被广泛的应用于食品、饲料以及化妆品等领域。本课题组前期研究表明,DHA-S通过抑制大鼠维生素k环氧化物还原酶(Vitamin2,3-exoxidereductase,VkOR)的两个亚酶VkOR亚基 1(VkO... 详细信息

脱氢乙酸钠(Sodiumdehydroacetate,DHA-S)因其广谱的抗菌作用而被广泛的应用于食品、饲料以及化妆品等领域。本课题组前期研究表明,DHA-S通过抑制大鼠维生素k环氧化物还原酶(Vitamin2,3-exoxidereductase,VkOR)的两个亚酶VkOR亚基 1(VkOR complexsubunit 1,VkORC1)和 VkORC1 样蛋白 1(VkORC1-likeprotein 1,VkORC1L1)的活性及表达,引起Vk循环异常,使得Vk、Vk依赖的凝血因子生成减少,从而导致凝血障碍。骨钙素和骨膜蛋白等Vk依赖性蛋白,在机体骨骼和血管钙化的过程中发挥重要作用。DHA-S可通过VkORC1/L1抑制Vk依赖蛋白的活化,但对骨骼生长的影响报道较少。本文通过孕期灌胃给予大鼠DHA-S,检测孕鼠及胎鼠的血药浓度、血清或骨组织中骨代谢相关指标及VkORC1与VkORC1L1表达水平,了解DHA-S在孕鼠与胎鼠的血药浓度关系、对孕鼠及胎鼠股骨生长和代谢的影响,初步探究DHA-S对孕鼠与胎鼠骨代谢影响的机制。Wistar大鼠孕期分别经口给予10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg剂量的DHA-S,连续21 d,设空白对照组。于孕20d采集孕鼠及胎鼠的血清和股骨组织。测量胎鼠体重、体长、股骨长度、颅骨直径、HE染色及Von kossa染色分析对骨骼生长的影响;采用HPLC法测定孕鼠及胎鼠的血药浓度,初步了解DHA-S在孕鼠与胎鼠的血药浓度关系;采用ELASA法检测血清骨代谢相关指标骨钙素(BGP)、骨保护素(OPG)、Ⅰ型前胶原N端前肽(PINP)、碱性磷酸酶(ALP)、核因子κB受体活化因子配体(RANkL)、Ⅰ型胶原蛋白C端交联末端肽(CTX-I)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP);Western Blot法及免疫荧光法研究DHA-S对孕鼠及胎鼠骨代谢相关蛋白、VkORC1与VkORC1L1表达水平;分别进行孕鼠或胎鼠的血药浓度与其骨代谢指标间的相关性分析。在孕鼠中,除了 10mg/kg DHA-S 组血清 BGP、OPG、PINP 和 ALP,以及 30mg/kg组血清中PINP、ALP,与对照组比较无显著性差异(P>0.05)外,其他DHA-S处理组BGP、OPG、PINP、ALP均显著或极显著降低(Pkg和30 mg/kg剂量组RANkL、CTX-I和TRAP,与对照组无显著性差异(P>0.05),50 mg/kg组RANkL、CTX-I和TRAP均显著或极显著升高(PkL、CTX-I和TRAP呈显著正相关(Pkg剂量组BGP、OPG、RANkL、VkORC1、VkORC1L1 均无显著性变化(P>0.05);30 mg/kg、50 mg/kg 组均 BGP、OPG、VkORC1、VkORC1L1 显著或极显著降低(PkL 显著升高。ELASA法检测Vk含量,10 mg/kg剂量组孕鼠血清Vk无显著性差异,30 mg/kg及50 mg/kg剂量组孕鼠血清Vk显著性下降(Pkg、50mg/kg组胎鼠体重、体长、股骨长、颅骨直径显著少于对照组(Pkg剂量组BGP、OPG、PINP与对照组比较无显著差异(P>0.05);30 mg/kg、50 mg/kg组BGP、OPG、PINP、ALP均显著或极显著下降(Pkg和300mg/kg剂量组胎鼠血清骨吸收指标RANkL、CTX-I和TRAP均无显著性差异(P>0.05),50 mg/kg组RANkL、CTX-I和TRAP均显著或极显著升高(PkL、CTX-I和TRAP呈显著正相关(Pkg剂量组胎鼠股骨组织

关键词：脱氢乙酸钠骨代谢维生素k 维生素k环氧化物还原酶

糜蛋白酶提高膜蛋白质谱分析序列覆盖率的胶内消化方法

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生物工程学报 2020年第11期36卷 2435-2442页

作者：刘红丽沈滟高稳稳于海川席守民沈国民河南科技大学医学院河南洛阳471023 新乡医学院医学检验学院河南新乡453003

近年来,质谱技术在膜蛋白结构与功能研究中被广泛应用。由于膜蛋白的跨膜结构域含有大量疏水性氨基酸,常常导致液质串联质谱检测的序列覆盖率较低,从而限制了质谱技术在膜蛋白结构与功能研究中的应用。文中利用人的整合膜蛋白维生素k环... 详细信息

近年来,质谱技术在膜蛋白结构与功能研究中被广泛应用。由于膜蛋白的跨膜结构域含有大量疏水性氨基酸,常常导致液质串联质谱检测的序列覆盖率较低,从而限制了质谱技术在膜蛋白结构与功能研究中的应用。文中利用人的整合膜蛋白维生素k环氧化物还原酶为模型,优化胶内消化条件,建立了一种稳定提高膜蛋白质谱序列覆盖率的糜蛋白酶胶内消化方法。通过探索钙离子浓度、pH值和缓冲体系对序列覆盖率、检测特异肽段的总数和类型以及特异肽段大小的影响,发现在5–10 mmol/L钙离子浓度、pH 8.0–8.5的Tris-HCl缓冲液中,可以兼顾序列覆盖率和肽段的多样性。该方法可以使膜蛋白的质谱覆盖率达到80%以上,将在膜蛋白结构与功能、膜蛋白相互作用位点的鉴定以及膜蛋白与小分子药物结合位点的鉴定等研究中具有广泛的应用价值。

关键词：膜蛋白胶内消化序列覆盖率糜蛋白酶液质串联质谱维生素k环氧化物还原酶膜蛋白结构

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华法林抵抗的诊断及处理

中南大学学报（医学版） 2013年第3期38卷 313-317页

作者：谭胜蓝周新民李智张伟刘昭前周宏灏中南大学临床药理研究所长沙410078 中南大学湘雅二医院胸心外科长沙410011

华法林抵抗指少数患者需服用显著高于常规剂量华法林才能达到目标国际标准化比值(internationalnormalized ratio,INR)治疗范围,甚至无法达到目标INR的现象。华法林抵抗可分为遗传性抵抗和获得性抵抗两类,或分为药代动力学抵抗和药效动... 详细信息

华法林抵抗指少数患者需服用显著高于常规剂量华法林才能达到目标国际标准化比值(internationalnormalized ratio,INR)治疗范围,甚至无法达到目标INR的现象。华法林抵抗可分为遗传性抵抗和获得性抵抗两类,或分为药代动力学抵抗和药效动力学抵抗两类。临床上确诊华法林抵抗后,应尽快找出抵抗原因,对因治疗。患者依从性差、遗传变异、服用导致华法林吸收减少或清除加快的药物、摄入富含维生素k的饮食等是导致华法林抵抗最常见的原因。教育患者用药知识、增加华法林剂量或换用其他抗凝药可有效避免华法林抵抗。

关键词：华法林抵抗诊断治疗维生素k环氧化物还原酶

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遗传性联合维生素k依赖凝血因子缺乏症

中国实用内科杂志 2021年第7期41卷 639-642页

作者：彭婕陈敏刘怡晨李田田施小凤江苏大学附属医院血液科江苏镇江212000

遗传性联合维生素k依赖凝血因子缺乏症(vitamin k-dependent coagulation factors deficiency,VkCFD)是一种罕见的常染色体隐性遗传出血性疾病,其特征是促凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ及抗凝血蛋白C、S和Z活性降低,导致出血相关的临床表现。... 详细信息

遗传性联合维生素k依赖凝血因子缺乏症(vitamin k-dependent coagulation factors deficiency,VkCFD)是一种罕见的常染色体隐性遗传出血性疾病,其特征是促凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ及抗凝血蛋白C、S和Z活性降低,导致出血相关的临床表现。依据变异的基因不同可将本病分为2种亚型:VkCFD1(OMIM#277450),因γ-谷氨酰羧化酶(gamma glutamyl carboxylase,GGCX)突变所致。

关键词：维生素k依赖凝血因子遗传 γ谷氨酰羧化酶维生素k环氧化物还原酶维生素k

拟南芥VkOR蛋白功能研究及必需半胱氨酸的确定

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拟南芥VKOR蛋白功能研究及必需半胱氨酸的确定

作者：王亮山东农业大学

学位级别：硕士

二硫键是蛋白质链内或链间两个Cys之间的共价连接,二硫键的形成是氧化型蛋白质折叠和成熟过程中的重要步骤,它可以提高蛋白质的稳定性,避免蛋白质变性,降低蛋白水解酶对蛋白质的降解作用,为蛋白质形成正确的结构和行使正确的功能所必需... 详细信息

二硫键是蛋白质链内或链间两个Cys之间的共价连接,二硫键的形成是氧化型蛋白质折叠和成熟过程中的重要步骤,它可以提高蛋白质的稳定性,避免蛋白质变性,降低蛋白水解酶对蛋白质的降解作用,为蛋白质形成正确的结构和行使正确的功能所必需。大肠杆菌中催化二硫键的系统现在已经研究的比较透彻,该系统主要通过DsbA蛋白和DsbB蛋白实现电子的传递过程。近年来,在微生物中发现了一条新的催化二硫键形成的途径(维生素k环氧化物还原酶途径,VkOR途径),其中VkOR蛋白是这条途径中催化二硫键形成的关键组分。高等植物中普遍存在编码VkOR同源蛋白的基因,但是该基因编码的蛋白其功能如何还几乎一无所知,为此,我们选取拟南芥VkOR作为研究对象,对高等植物VkOR催化二硫键形成功能进行了初步研究,并利用定点突变技术确定了植物VkOR催化二硫键形成所必需的半胱氨酸,主要结果如下:(1)拟南芥VkOR信号肽预测及结构分析。利用TargetP、PredSL和ChloroP在线程序预测该基因编码蛋白的信号肽为N-末端45个氨基酸。将拟南芥VkOR蛋白与已发现的催化二硫键形成的蛋白进行二级结构及拓扑结构比对,结果表明,拟南芥VkOR蛋白为一融合蛋白,有两个结构域即膜蛋白结构域和水溶性结构域组成,N-末端跨膜区与人类维生素k环氧化物还原酶(VkOR)同源,C-末端亲水区与大肠杆菌DsbA蛋白同源。我们将拟南芥VkOR全长命名为AtVkOR-DsbA,N-末端跨膜区命名为AtVkOR(45-214),C-末端亲水区命名为AtDsbA(204-376)。(2)AtVkOR-DsbA、AtVkOR-DsbA不带信号肽、AtVkOR结构域、AtDsbA结构域的克隆。从NCBI上查出拟南芥AtVkOR的基因序列,并依据该序列设计引物,以拟南芥的总cDNA为模板,分别扩增带信号肽AtVkOR-DsbA、去除信号肽AtVkOR-DsbA以及AtVkOR(45-214位氨基酸)、AtDsbA(204-376位氨基酸)基因片段,并将基因片段分别连在表达载体pTrc99a,分别构建原核表达载体pTrc99a-TP-AtVkOR-DsbA(全长)、pTrc99a-AtVkOR-DsbA(不含信号肽全长),pTrc99a-AtVkOR和pTrc99a- AtDsbA。(3)用细胞运动性检测拟南芥VkOR催化二硫键形成的功能。大肠杆菌缺失DsbA或DsbB会丧失催化二硫键形成能力,不能为鞭毛蛋白FlgI引入对其功能必须的二硫键,造成细胞丧失运动性。我们上述表达载体分别转化二硫键形成缺陷型大肠杆菌细胞,检测了AtVkOR-DsbA及各结构域催化二硫键形成的能力。实验结果表明:缺失信号肽的AtVkOR-DsbA能够恢复二硫键形成缺陷型大肠杆菌的二硫键形成能力,形成有功能的鞭毛蛋白,使大肠杆菌细胞恢复运动性。说明AtVkOR-DsbA具有二硫键形成功能。但是带有信号肽的VkOR全长、AtVkOR、AtDsbA都不能单独恢复二硫键形成缺陷型菌株的二硫键形成功能。(4)用半乳糖苷酶活性检测拟南芥VkOR催化二硫键形成的功能。选用的受体大肠杆菌细胞其基因组整合了膜蛋白MalF与β-半乳糖苷酶的融合基因,膜蛋白MalF将β-半乳糖苷酶的N-末端固定于细胞膜上,当β-半乳糖苷酶形成二硫键时则失去活性。实验结果表明,当去除信号肽的AtVkOR-DsbA全长蛋白表达时,β-半乳糖苷酶以无活性形式存在,说明有二硫键的形成,而分别表达带信号肽的全长、AtVkOR或AtDsbA时,β-半乳糖苷酶以还原态存在时,能够分解X-gal生成深蓝色物质,说明带信号肽的全长、AtVkOR或AtDsbA不能催化二硫键的形成,该结果与细胞运动性实验结果吻合。(5)用基因定位突变技术确定必需半胱氨酸残基。我们利用Quickchange定点突变技术,在基因水平上分别将AtVkOR-DsbA的十个半胱氨酸突变为丙氨酸,并且将同一跨膜区的一对半胱氨酸双突变为丙氨酸,研究半胱氨酸对AtVkOR-DsbA功能的影响,实验结果表明:硫氧还蛋白典型原件C-X-X-C结构中的半胱氨酸(Cys195-Cys198,Cys293-Cys296)以及相距较远的两对保守半胱氨酸(Cys109-Cys116,Cys316-Cys331)对于AtVkOR-DsbA的二硫键形成功能是必需的。另外两个位点的非保守半胱氨酸(Cys46、Cys230)对于AtVkOR-DsbA的功能无明显的影响。

关键词：维生素k环氧化物还原酶二硫键定位突变半胱氨酸