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河南师范大学学报（自然科学版） 2022年第4期50卷 107-111页

作者：徐亚奇王一伊李飞邱稳辉沈滟沈国民河南科技大学基础医学院河南洛阳471023 河南科技大学河南省血栓与止血国际联合实验室河南洛阳471023

维生素k环氧化物还原酶(VkOR)是开发抗凝药的重要靶点,其活性测定对鉴定靶向VkOR新型抑制剂具有重要的应用价值.目前测定VkOR活性的常用方法为基于报告基因的方法,是一种间接测定VkOR活性的方法,不能用于鉴定靶向VkOR新型抑制剂.为建立... 详细信息

维生素k环氧化物还原酶(VkOR)是开发抗凝药的重要靶点,其活性测定对鉴定靶向VkOR新型抑制剂具有重要的应用价值.目前测定VkOR活性的常用方法为基于报告基因的方法,是一种间接测定VkOR活性的方法,不能用于鉴定靶向VkOR新型抑制剂.为建立一种快速、直接测定VkOR活性的方法,首先建立了一种基于HPLC检测维生素k(Vk)和维生素k环氧化物(VkO)的方法,该方法简便快速,准确性高,重复性好,各检测物色谱峰分离良好.在此基础上,利用GGCX基因敲除的细胞,建立了直接测定细胞内VkOR活性的方法,更加便捷地鉴定靶向VkOR抑制剂,为研发靶向VkOR新型抗凝药提供帮助.

关键词：维生素k环氧化物还原酶高效液相色谱维生素k 维生素k环氧化物华法林

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人维生素k环氧化物还原酶催化维生素k环氧化物的机制研究

人维生素K环氧化物还原酶催化维生素K环氧化物的机制研究

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作者：苏改改河南科技大学

学位级别：硕士

人维生素k环氧化物还原酶(h VkOR)是位于内质网的整合膜蛋白,通过催化维生素k循环中的限速步骤,参与维生素k依赖性蛋白的翻译后修饰。临床常用抗凝血药华法林通过特异性靶向h VkOR,阻断维生素k循环,使肝脏合成的凝血因子的γ-羧基化受... 详细信息

人维生素k环氧化物还原酶(h VkOR)是位于内质网的整合膜蛋白,通过催化维生素k循环中的限速步骤,参与维生素k依赖性蛋白的翻译后修饰。临床常用抗凝血药华法林通过特异性靶向h VkOR,阻断维生素k循环,使肝脏合成的凝血因子的γ-羧基化受抑制而产生抗凝作用。目前,h VkOR催化维生素k环氧化物(kO)的机制是基于量子化学理论提出的,但是在细胞环境中具体的催化机制尚不清楚。因此,深入研究生理条件下h VkOR催化kO的催化机理具有重要的理论意义,也有助于我们理解华法林的抑制机制。目的:通过构建野生型h VkOR以及突变体的稳定细胞系,利用凝胶迁移实验、定量质谱以及分子模拟等方法,捕捉h VkOR在催化kO过程中形成的电子转移中间体,进一步揭示细胞环境下h VkOR催化kO的催化机制。方法:1.以pc DNA5/FRT为载体,利用快速克隆的方法构建表达野生型h VkOR以及相关半胱氨酸突变体的重组质粒,通过测序验证其是否构建成功。2.体外常规培养293T-REx细胞,将测序成功的重组质粒pc DNA5/FRT与p OG44以1:10的比例共转染293T-REx细胞。48h后,向培养基中加入一定浓度的抗生素(杀稻瘟菌素和潮霉素)筛选稳定的细胞系;通过向培养基中加入强力霉素,诱导目的蛋白表达。3.建立kO诱导的凝胶迁移实验。将稳定表达野生型h VkOR以及相关半胱氨酸突变体的细胞分为kO处理组与未处理组,分别进行还原和非还原的SDSPAGE电泳,用Western Blot检测kO处理对h VkOR各突变体电泳迁移的影响。4.从稳定细胞系中纯化表达野生型h VkOR以及各半胱氨酸突变体的蛋白,用定量质谱的方法分析每个半胱氨酸的氧化还原态。5.结合细菌ss VkOR的结构,利用计算机模拟的方法分别构建h VkOR与kO以及h VkOR与华法林结合形成的复合物结构模型。结果:1.利用pc DNA5/FRT成功构建表达野生型h VkOR以及各突变体的重组质粒。2.利用293T-REx细胞成功构建稳定表达野生型h VkOR以及各突变体的细胞系。***诱导的凝胶迁移实验结果显示,C43A突变体在加入kO处理之后,在非还原的SDS-PAGE电泳中出现了一个迁移带,迁移现象在还原的SDSPAGE电泳中消失,而其它突变体并未出现迁移现象。在C43AC135A、C43AC135S双突变体中,用同样的方法经kO诱导处理后,进行非还原的SDSPAGE电泳,发现C43A中kO诱导的凝胶迁移在这两个双突变体中均消失。4.对野生型h VkOR和各突变体进行定量质谱分析,结果显示C43A突变体中的C135在加入kO处理后变为氧化态,并且kO处理还诱导了C43A突变体中更多的C16和C85处于氧化态;其它突变体的C135在kO处理前后氧化还原态的变化不明显,除C43A突变体外,其它突变体中C16、C85、C96在kO处理前后氧化还原态无明显变化。结合以上结果,我们构建出h VkOR催化kO的催化机制模型。5.利用计算机模拟的方法成功构建了h VkOR与kO以及h VkOR与华法林结合的复合物结构模型,提示kO与华法林结合同一个口袋,进而我们提出一个华法林抑制h VkOR的模型。结论:1.在细胞内h VkOR具有两种或三种活性形式,分别是C51-C132形成二硫键并且C43和C135为游离巯基的状态以及具有C132和C135两个游离巯基的状态。这几类状态催化kO的效率可能不同。2.由于细胞内h VkOR存在两种或三种活性形式,因此细胞内h VkOR催化kO到k存在多个催化机制,细胞内h VkOR催化kO是一个混合催化机制。3.基于细胞内h VkOR催化kO的混合催化模型,我们认为华法林通过混合抑制模式抑制h VkOR的活性。

关键词：人维生素k环氧化物还原酶维生素k环氧化物维生素k 催化机制华法林巯基

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VkORC1-1639 G/A基因多态性与华法林应用剂量关系的研究

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中华临床医师杂志（电子版） 2008年第3期2卷 13-15页

作者：吴小盈章伟平陈慧骆杰伟福建医科大学省立临床医学院心内科福州350001 福建省立医院中医科

目的探讨维生素k环氧化物还原酶复合物1基因(VkORC1)-1639 G/A多态性对中国汉族人华法林应用剂量的影响。方法应用PCR-RFLP法检测129例长期口服华法林的患者和198例健康对照者VkORC1-1639 G/A多态性,比较VkORC1不同基因型间平均华法林... 详细信息

目的探讨维生素k环氧化物还原酶复合物1基因(VkORC1)-1639 G/A多态性对中国汉族人华法林应用剂量的影响。方法应用PCR-RFLP法检测129例长期口服华法林的患者和198例健康对照者VkORC1-1639 G/A多态性,比较VkORC1不同基因型间平均华法林剂量。结果病例组VkORC1-1639 AA、AG、GG基因型频率分别为74·4%(96/129)、23·3%(30/129)、2·3%(3/129),等位基因A和G频率分别为86%和14%。病例组与健康对照者VkORC1-1639 G/A多态性分布差异无统计学意义(P>0·05)。VkORC1-1639不同基因型患者所需华法林平均剂量差异有显著统计学意义(PkORC1-1639 AA型占多数有关。

关键词：华法林剂量效应关系,药物多态性,限制性片段长度维生素k环氧化物还原酶复合物1基因

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