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口蹄疫病毒结构蛋白vp1在谷氨酸棒状杆菌中的表达及优化

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微生物学通报 2023年第12期50卷 5427-5438页

作者：崔思楠金凌鹏闵远乐王浩王一凡谢佳康刘秀霞白仲虎江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心江苏无锡214122

【背景】口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的感染牛、羊和猪等偶蹄动物的主要疫病之一。口蹄疫病毒的结构蛋白vp1包含多个能够引起机体免疫反应的主要位点,因此vp1是研究亚单... 详细信息

【背景】口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的感染牛、羊和猪等偶蹄动物的主要疫病之一。口蹄疫病毒的结构蛋白vp1包含多个能够引起机体免疫反应的主要位点,因此vp1是研究亚单位疫苗的方向靶标。谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为安全生产菌株,是医药用蛋白生产的优势细胞工厂。【目的】利用***作为受体菌株表达外源蛋白的优势实现vp1的外源表达。【方法】根据vp1结构蛋白的基因序列、相应功能和***的密码子偏好性设计并合成vp1基因,与pXMJ19载体连接构成重组质粒pXMJ19-vp1。*** CGMCC 1.15647菌株用于表达vp1-6×his蛋白,并对蛋白表达元件启动子、5′非翻译端(5′UTR)、目的蛋白自身N端等进行优化,同时对培养条件等进一步优化,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测vp1蛋白的表达情况。最后应用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定本研究中生产的vp1的免疫活性。【结果】SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明vp1蛋白能在*** CGMCC 1.15647菌株成功表达,将Ptac启动子替换为合成型启动子PH36能提高蛋白产量。在此基础上,通过插入不同的5′UTR序列和vp1蛋白N端氨基酸的改变能进一步提高蛋白产量并可利用CspB信号肽实现分泌表达。发酵试验表明,vp1摇瓶发酵培养最优条件为30℃、24 h。ELISA试验表明,本研究中的vp1可与阳性血清特异性结合。【结论】本研究在谷氨酸棒状杆菌中成功表达FMDV的vp1蛋白,并通过优化蛋白表达元件的方法进一步提高了产量,为开发新型FMD免疫诊断试剂和安全高效的亚单位疫苗奠定了良好的基础。

关键词：谷氨酸棒状杆菌口蹄疫病毒结构蛋白vp1 蛋白表达元件发酵优化

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白vp1基因的克隆与序列分析

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中国兽医科技 2004年第4期34卷 52-56页

作者：裴仉福张永光王永录潘丽王宝琴刘庆军吕建亮刘力宽胡永浩甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV L1和FMDV L2的RNA,用1对通用引物经RT PCR扩增出2株病毒vp1基因的DNA片段,将扩增的vp1编码序列克隆到质粒载体pGEM TEasy中,转入大肠埃希氏菌JM109,得到大量携带目的基因的质粒;经过重组质粒的鉴定、测序获得... 详细信息

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV L1和FMDV L2的RNA,用1对通用引物经RT PCR扩增出2株病毒vp1基因的DNA片段,将扩增的vp1编码序列克隆到质粒载体pGEM TEasy中,转入大肠埃希氏菌JM109,得到大量携带目的基因的质粒;经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列;利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV L1和FMDV L2以及作为参考毒株的A22/India/17/77进行序列分析。结果表明,核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列,氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG βH环内,其中毒株FMDV L1和FMDV L2RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异,分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。

关键词：口蹄疫口蹄疫病毒克隆序列分析结构蛋白vp1 基因

口蹄疫病毒结构蛋白vp1上B细胞表位的筛选鉴定

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华北农学报 2009年第5期24卷 81-85页

作者：张昱王永录张永光方玉珍潘丽蒋守田吕建亮刘力宽张中旺张淑刚李正丰杜进鑫中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046

以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白vp1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72vp1的核苷酸序列和推导氨基酸序列... 详细信息

以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白vp1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72vp1的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析结构蛋白vp1的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位肽段进行筛选鉴定,结果显示,表位vp1a和vp1d为病毒株AF72结构蛋白vp1的优势B细胞表位,该结果为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供有价值的参考依据。

关键词：口蹄疫病毒结构蛋白vp1 间接ELISA B细胞表位

口蹄疫病毒vp1基因的克隆及结构蛋白vp1的原核表达

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中国动物检疫 2007年第2期24卷 23-25页

作者：董志强张志李晓成陈德坤洪军张燕霞黄保续西北农林科技大学陕西杨凌712100 中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032

根据Genbank中的O型口蹄疫病毒全基因序列设计了一对扩增口蹄疫病毒vp1基因的引物,用该特异性表达引物从口蹄疫阳性质粒pMD-P1中扩增得到目的基因vp1(639bp),用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体PET32a后构建重组表达载体,转化... 详细信息

根据Genbank中的O型口蹄疫病毒全基因序列设计了一对扩增口蹄疫病毒vp1基因的引物,用该特异性表达引物从口蹄疫阳性质粒pMD-P1中扩增得到目的基因vp1(639bp),用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体PET32a后构建重组表达载体,转化宿主菌BL21(DE3),经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序证明目的基因正确插入了表达载体,用不同浓度的IPTG诱导vp1基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明,vp1结构蛋白在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为41Ku,并能被口蹄疫阳性血清所识别,经分析表达蛋白约占菌体蛋白的34%。口蹄疫病毒vp1蛋白在大肠杆菌中高效表达且表达产物具有免疫原性。

关键词：口蹄疫病毒 vp1基因结构蛋白vp1 克隆表达

口蹄疫病毒AF/72株结构蛋白vp1的H-2d限制性T细胞表位筛选与鉴定

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口蹄疫病毒AF/72株结构蛋白VP1的H-2d限制性T细胞表位筛选与鉴定

作者：刘新生中国农业科学院

学位级别：硕士

表位肽疫苗作为一种新型疫苗,已成为口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)疫苗研究的热点之一。由于细胞免疫在口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)的免疫应答中发挥着重要作用,而结构蛋白vp1内又包含着FMDV的主要抗原位点。... 详细信息

表位肽疫苗作为一种新型疫苗,已成为口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)疫苗研究的热点之一。由于细胞免疫在口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)的免疫应答中发挥着重要作用,而结构蛋白vp1内又包含着FMDV的主要抗原位点。因此,筛选和鉴定vp1蛋白有效的H-2Ld限制性T细胞抗原表位,不仅可为进一步研究针对FMDV自然宿主的T细胞抗原表位提供方法和依据,也可为进一步研制FMDV表位肽疫苗奠定基础。本研究通过扩增并测序,获得了完整的FMDV AF/72株vp1序列。采用密码子优化表达方法,在大肠杆菌中高效表达了该vp1蛋白。经过SDS-PAGE电泳及Western Blotting检测,其分子量与预期大小相符合,并且保持了良好的免疫原性。与此同时,利用相关生物信息学软件对vp1中潜在的H-2Dd、H-2Kd、H-2Ld限制性T细胞表位进行了预测分析,初步筛选并合成了30个10肽片段作为候选表位肽段。将vp1蛋白免疫BALB/c小鼠,制备经vp1蛋白致敏的脾淋巴细胞,与30个候选表位肽段分别进行体外共培养刺激,经淋巴细胞增殖实验和γ干扰素ELISPOT实验,鉴定出2个H-2d限制性T细胞表位,即H-2Kd限制性T细胞表位pK1(AYHKGPFTRL)和H-2Dd限制性T细胞表位pD7(TGESADPVTT)。本研究筛选并鉴定了FMDV AF/72株结构蛋白vp1中的H-2d限制性T细胞表位,为FMDV T细胞表位的研究提供方法和依据,为进一步研制FMDV表位肽疫苗奠定了基础。此外,通过鉴定小鼠这一FMDV研究中常用动物模型的CTL T细胞表位,也有利于了解细胞毒性淋巴细胞在抗FMDV方面的作用。

关键词： FMDV 结构蛋白vp1 T细胞表位 H2-d限制性表位预测

A型口蹄疫病毒结构蛋白vp1单克隆抗体的制备及初步应用

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A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1单克隆抗体的制备及初步应用

作者：李菁中国农业科学院

学位级别：硕士

口蹄疫(Foot-and-mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)所引起的一种偶蹄动物的急性高度接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病之首,给流行国家和地区的政治、经济和社会问题带来了不利... 详细信息

口蹄疫(Foot-and-mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)所引起的一种偶蹄动物的急性高度接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病之首,给流行国家和地区的政治、经济和社会问题带来了不利影响,而单克隆抗体以其特异性强、重复性好、稳定性高的优点已成为口蹄疫诊断和研究的焦点。本研究利用重组菌pGEM-vp1为模板成功克隆出vp1基因,将其连接到表达载体上诱导表达出融合蛋白。可溶性分析表明表达的融合蛋白是以包涵体的形式存在,超声裂解菌体后利用镍离子亲和层析的方法进行蛋白纯化,SDS-PAGE分析显示得到了较纯的融合蛋白,并以此作为免疫原免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠,加强免疫后取其脾脏和骨髓瘤细胞(Sp2/0)进行融合,通过间接ELISA法初步筛选,有限稀释法进行亚克隆,最终获得了4株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为7B11、7H11、8G2、8H4。利用SDS-PAGE、间接ELISA法、Western blot分析和间接免疫荧光法进行了生物学特性的分析和鉴定。实验结果表明获得的4株单抗具有较高的抗体效价和特异性,抗体亚类鉴定结果显示,7B11和7H11均属于IgG1,8H4和8G2属于IgG2a,杂交瘤细胞的染色体数目均在98-108条之间,辛酸-饱和硫酸铵法纯化的单抗只有抗体的重链和轻链两条链,大小分别为50ku和25ku,相对亲和力为8G2>8H4>7H11>7B11。用纯化的单抗与乳胶致敏,初步建立了快速检测A型FMDV抗原的方法,对致敏抗体浓度、致敏时间和温度等条件进行优化。确定包被单抗(7B11,7H11)的稀释倍数为1:40,37℃致敏4h能达到较好的实验效果。特异性试验显示,该方法与O型、Asia1型FMDV病毒的反应均呈阴性。本研究成功制备了针对A型FMDV的单克隆抗体,并对其生物学特性进行了分析和鉴定,在此基础上建立了反向乳胶凝集法检测A型口蹄疫病毒抗原的方法,这为口蹄疫的诊断和研究提供了平台。

关键词： A型口蹄疫病毒结构蛋白vp1 单克隆抗体反向乳胶凝集

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口蹄疫病毒结构蛋白vp1生物信息学分析

今日养猪业 2023年第4期 54-57页

作者：蔡维杰遵义市播州区泮水镇农业农村服务中心

vp1是组成口蹄疫病毒衣壳的重要蛋白,具有该病毒的主要抗原位点,其基因序列分析已被广泛用于分子流行病学调查研究。从GenBank数据库检索并下载我国上传的FMDV vp1基因序列36个,以贵州A型FMDV vp1为参考,对蛋白理化性质、二级结构、同... 详细信息

vp1是组成口蹄疫病毒衣壳的重要蛋白,具有该病毒的主要抗原位点,其基因序列分析已被广泛用于分子流行病学调查研究。从GenBank数据库检索并下载我国上传的FMDV vp1基因序列36个,以贵州A型FMDV vp1为参考,对蛋白理化性质、二级结构、同源性等进行分析。结果显示vp1基因编码区长度为636bp,共编码212个氨基酸,含有α-螺旋、β-转角等丰富的二级结构。同源性分析表明我国FMDV vp1基因核苷酸相似性为50.3%~99.2%。

关键词： vp1基因口蹄疫病毒病毒衣壳抗原位点 FMDV 二级结构基因序列分析结构蛋白vp1

O型口蹄疫病毒结构蛋白vp1的原核表达与抗原性分析

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动物医学进展 2007年第6期28卷 14-18页

作者：徐程陈亚波方维焕浙江大学动物预防医学研究所浙江省动物预防医学重点实验室浙江杭州310029

研究分析了O型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白vp1与当前猪FMDV疫苗血清的免疫反应性。将vp1基因克隆至原核表达载体pET32c,并在大肠埃希菌BL21中得到了表达,Western blot分析表明该重组蛋白与豚鼠O型FMDV标准阳性血清具有良好免疫反应性。目... 详细信息

研究分析了O型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白vp1与当前猪FMDV疫苗血清的免疫反应性。将vp1基因克隆至原核表达载体pET32c,并在大肠埃希菌BL21中得到了表达,Western blot分析表明该重组蛋白与豚鼠O型FMDV标准阳性血清具有良好免疫反应性。目的蛋白经纯化后用ELISA分析其与猪疫苗血清的免疫反应性,结果显示该重组vp1蛋白(rvp1)只能与部分O型FMDV疫苗血清反应。推测当前使用的不同O型FMDV疫苗毒株在vp1重要中和抗原位点G-H环(134 aa^158 aa)与C末端(200 aa^213 aa)存在较大差异。

关键词： O型口蹄疫病毒结构蛋白vp1 免疫反应性疫苗毒株中和抗原位点

EV71结构蛋白 vp1对核因子κB 活化的影响

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中国实用医刊 2017年第3期44卷 90-92页

作者：林创兴蔡晓莹林广裕汕头大学医学院第二附属医院儿科广东汕头515041

目的：研究肠道病毒71型（EV71）结构蛋白 vp1对核因子κB（NF-κB）活化的影响。方法将 EV71结构蛋白 vp1 cDNA 连入表达载体 pcDNATM3.1/ myc-His（-）A，转入大肠杆菌 TOP10，将酶切和 PCR 鉴定阳性的重组质粒转染至肺腺癌上皮细胞... 详细信息

目的：研究肠道病毒71型（EV71）结构蛋白 vp1对核因子κB（NF-κB）活化的影响。方法将 EV71结构蛋白 vp1 cDNA 连入表达载体 pcDNATM3.1/ myc-His（-）A，转入大肠杆菌 TOP10，将酶切和 PCR 鉴定阳性的重组质粒转染至肺腺癌上皮细胞，并诱导表达，同时设立对照组，凝胶迁移试验检测各组 NF-κB 的活化程度。结果 EV71 vp1重组质粒转染肺腺癌上皮细胞不会引起 NF-κB 表达量的明显变化。结论质粒 pcDNATM 3.1/myc-His-vp1转染 A549细胞成功表达后，细胞内 NF-κB 的表达量并无明显变化，这可能与多种细胞因子参与 NF-κB 的激活通路有关。

关键词：肠道病毒71型结构蛋白vp1 手足口病核因子κB 脓毒症