检索结果-南通市图书馆

作者：付涵芬河南农业大学

学位级别：硕士

纤维素的有效降解与利用一直以来都是一个热门话题,近年来发现的一类纤维素酶辅助蛋白——扩展蛋白(expansin)可以有效提高纤维素酶对纤维素的降解效率。扩展蛋白是非水解性的小分子蛋白,它可以使纤维素致密的结构变疏松,从而提高纤维... 详细信息

纤维素的有效降解与利用一直以来都是一个热门话题,近年来发现的一类纤维素酶辅助蛋白——扩展蛋白(expansin)可以有效提高纤维素酶对纤维素的降解效率。扩展蛋白是非水解性的小分子蛋白,它可以使纤维素致密的结构变疏松,从而提高纤维素酶对纤维素的可及性。来自黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)的扩展蛋白Y189具有良好的p H稳定性和热稳定性,而来自杀线虫真菌(Arthrobotrys sp.)的扩展蛋白Cx EXL22与纤维素酶共同作用滤纸时具有较好的活性。本研究旨在通过结构域置换获得同时拥有稳定性较好以及活性较高的多功能结构域重组蛋白,并对这些蛋白进行反应参数的探究以及功能验证,研究结果如下:(1)利用Uniprot中Align功能对氨基酸序列进行序列比对,划分扩展蛋白结构域,并对单独结构域D1和D2进行活性测定,在本研究中发现单独结构域D1和D2仍然具有活性,但与完整扩展蛋白的活性相比有不同程度的降低。通过聚合酶链式反应(PCR)以及同源重组技术,构建扩展蛋白结构域重组质粒,获得结构域重组扩展蛋白YDEB、EBYD、YBED和EDYB。(2)对结构域重组扩展蛋白进行性质测定,我们发现:协同活性与扩展蛋白浓度、纤维素酶浓度均成正比,在p H为5.5、扩展蛋白浓度为1000μg/g底物、纤维素酶浓度为0.04 FPU/g底物时,协同活性出现最大值,并且结构域重组扩展蛋白YDEB和EBYD的协同活性甚至高于出发扩展蛋白Cx EXL22,但随着扩展蛋白浓度和纤维素酶浓度的升高,协同活性出现降低的趋势,这表明扩展蛋白和纤维素酶与纤维素的结合具有竞争关系。(3)同时扩展蛋白与纤维素酶的协同活性也取决于缓冲液的p H值。Y189与Cx EXL22在p H为5-7的范围内表现出截然不同的宽泛性,YDEB和EBYD的p H宽泛性有轻微的改善。Y189、Cx EXL22、YDEB和EBYD在p H5.5的柠檬酸-磷酸缓冲液中保存12 h后仍然保留了各自最大协同活性的80%以上。40℃保温12 h后,Cx EXL22保留了62.30%的相对活性,Y189、YDEB和EBYD保留了85%左右的相对活性。(4)通过SEM、FT-IR以及XRD检测结构域重组扩展蛋白YDEB处理后的滤纸发现,经扩展蛋白处理后的滤纸和秸秆表面变得粗糙膨胀,并且滤纸中羟基的含量升高,总结晶度和无定形区结晶度降低,说明扩展蛋白通过打断纤维素微纤维丝间的氢键,使结晶区变成无定形区,从而破坏纤维素的结构。当结构域重组扩展蛋白YDEB和纤维素酶共同作用于滤纸时,产物主要是纤维二糖与葡萄糖,当底物是玉米秸秆时,产物只有葡萄糖,均没有发现木糖和阿拉伯糖等单糖的产生。基于以上研究结果,结构域重组扩展蛋白YDEB和EBYD表现出了比出发扩展蛋白Y189和Cx EXL22更高的活性,以及比Cx EXL22更好的p H宽泛性和稳定性,所以可以通过结构域重组获得多功能的结构域重组蛋白。

关键词：纤维素酶扩展蛋白结构域重组协同作用

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多结构域酶的结构域进化关系

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生命的化学 2012年第1期32卷 39-43页

作者：焦豫良王淑军吕明生房耀维刘姝淮海工学院海洋学院连云港222005 江苏省海洋资源开发研究院连云港222001

近年来随着生命科学新技术、新方法的涌现,酶蛋白结构和功能研究逐渐深入。具有多结构域的酶蛋白中各个结构域常具有独立的催化或结合底物的功能,在重组酶和组合生物合成研究中具有极大的研究和应用价值。这些结构域功能和组织方式的多... 详细信息

近年来随着生命科学新技术、新方法的涌现,酶蛋白结构和功能研究逐渐深入。具有多结构域的酶蛋白中各个结构域常具有独立的催化或结合底物的功能,在重组酶和组合生物合成研究中具有极大的研究和应用价值。这些结构域功能和组织方式的多样性,是研究分子进化的基础。对结构域进行进化分析对于研究多结构域酶的进化过程、功能相近酶之间的关系,以及对酶的分类鉴定等有重要意义。本文从结构域的重复性、结构域的水平基因转移和结构域的重组等方面出发,对多结构域酶中结构域之间进化关系的研究成果进行综述。

关键词：多结构域酶分子进化结构域重复结构域重组水平基因转移

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聚己内酯解聚酶结合聚酯底物的机制研究

聚己内酯解聚酶结合聚酯底物的机制研究

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作者：马玉东北师范大学

学位级别：硕士

酶对不溶性高分子聚酯材料进行降解时首先要吸附结合到底物表面,目前的研究显示这种吸附作用大都是由专门的底物结合结构域来实现的。本实验室前期筛选了一种对多种聚酯底物具有降解活性的聚己内酯解聚酶(PCLase),结构分析显示该酶为只... 详细信息

酶对不溶性高分子聚酯材料进行降解时首先要吸附结合到底物表面,目前的研究显示这种吸附作用大都是由专门的底物结合结构域来实现的。本实验室前期筛选了一种对多种聚酯底物具有降解活性的聚己内酯解聚酶(PCLase),结构分析显示该酶为只有催化结构域的单结构域酶类。那么这种解聚酶是如何在没有底物结合结构域的辅助下与固相聚酯底物结合进而发挥高效降解作用的,目前尚不清楚。本实验主要对PCLase与聚酯底物的吸附结合作用进行研究,通过对酶的结构分析推测可能参与底物结合过程的表面氨基酸,基于氨基酸的疏水特性,采用一步质粒定点突变PCR方法构建了23个突变体,检测了野生型PCLase和突变体对不溶性聚酯PCL膜片的吸附和降解作用,同时测定了PCLase及突变体对可溶性底物p-NPC12和PCL乳化液的结合和催化能力,阐明单结构域PCLase与底物结合的机理。另外,采用蛋白质工程的方法对PCLase进行了底物结合结构域的添加,通过检测重组杂合酶对底物结合作用的变化,探讨底物结合结构域修饰对单结构域酶类的影响。具体研究结果如下:(1)PCLase是通过表面疏水性氨基酸与PCL底物进行结合的,发挥重要作用的是活性口袋外部四个区域的氨基酸。其中Hy R1区域的G79,Hy R2区域的I174、G175、L176和G177,Hy R3区域的G197、I200、I202和L205,Hy R4区域的F229对酶与聚酯底物表面的吸附作用影响显著。此外,实验结果还显示出,Hy R1区域的G79对酶与分子链的结合具有重要影响,Hy R2和Hy R3区域的I174、G175、L176、G177、G197、I200、I202和L205可能也参与了酶与分子链的结合过程。Hy R1区域中的T82和Hy R4区域中的P231在酶与底物的结合过程中可能存在空间位阻的影响。(2)通过将同源的PHBase的不同底物结合结构域SBD添加到单一结构域的PCLase上,构建了含有不同底物结合结构域的杂合酶PCLase S1、PCLase S2和PCLase S12,检测了杂合酶对PCL聚酯表面的吸附作用及对PCL聚酯等底物的降解能力。结果显示,增加底物结合结构域的杂合酶对PCL聚酯表面的吸附作用有所加强,PCLase S1和PCLase S2对固相底物的吸附率分别是野生型的1.1倍和1.03倍,PCLase S12对固相底物的吸附能力与野生型持平。三种杂合酶对PCL乳化液底物的降解活力都没有明显变化,但对PCL薄膜的降解效率显著提高,PCLase S1、PCLase S2和PCLase S12的降膜率分别是野生型的1.29倍、1.13倍和1.05倍。说明PCL的降解可能促进了薄膜表面的变化,结晶区的暴露更有利于底物结合结构域发挥吸附作用。另外,对杂合酶的酶学性质进行了测定,结果显示增加了底物结合结构域后,杂合酶的温度稳定性提高,添加SBD1和SBD12的PCLase最适反应温度由55℃提高到60℃。添加底物结合结构域SBD2和SBD12的PCLase在酸性条件下的p H稳定性提高。该部分实验结果表明,底物结合结构域对PCLase具有修饰作用,除了增加其对固相底物的吸附和降解外,还能够改善酶的其它特性,通过结构域重组对聚酯降解酶进行分子改造可能成为改善酶降解活力和特性的有效手段。

关键词：聚己内酯(PCL) PCL解聚酶(PCLase) 定点突变结构域重组诱导表达

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基于系统生物学的融合蛋白辅助筛选系统初探

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昆明学院学报 2010年第3期32卷 62-65页

作者：王斌王德斌邱莎郭庆申时凯昆明学院生命科学与技术系云南昆明650031 昆明学院计算机与网络技术系云南昆明650031

通过分析基因进化过程,以"融合"蛋白产生新功能或新蛋白质为实例,总结出蛋白融合的相关规则,规则包括协同作用、联合作用、多功能组合、多聚体组合和结构域重组等,根据这些规则设计了一个融合蛋白辅助筛选系统,用于融合蛋白规律的探讨... 详细信息

通过分析基因进化过程,以"融合"蛋白产生新功能或新蛋白质为实例,总结出蛋白融合的相关规则,规则包括协同作用、联合作用、多功能组合、多聚体组合和结构域重组等,根据这些规则设计了一个融合蛋白辅助筛选系统,用于融合蛋白规律的探讨以及为蛋白改造和设计提供辅助方案.

关键词：蛋白融合蛋白质设计结构域重组蛋白簇

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