检索结果-南通市图书馆

作者：俞敏锋扬州大学

学位级别：硕士

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)是一种典型的人兽共患病食源性病原菌,在自然界中普遍存在。由于其具有感染人类和多种动物而导致严重李斯特菌病的特性,该菌已引起了广泛关注。p60蛋白为该病原菌产生的一种胞外蛋白,... 详细信息

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)是一种典型的人兽共患病食源性病原菌,在自然界中普遍存在。由于其具有感染人类和多种动物而导致严重李斯特菌病的特性,该菌已引起了广泛关注。p60蛋白为该病原菌产生的一种胞外蛋白,与李斯特菌的致病性密切相关。现有的研究结果表明p60蛋白在Lm发病机理中的主要作用与细胞分裂、宿主细胞入侵、细菌细胞表面结构的维持及免疫活性细胞壁成分的释放有关。因此,p60蛋白也被称为侵染辅助蛋白(invasion-associated protein, Iap)。p60蛋白的三级结构预测结果显示：若在270位氨基酸附近将p60蛋白切开,可以获得两个能够彼此独立存在的结构域(N端结构域和C端结构域)。同时,氨基酸序列分析显示：p60蛋白的N端不仅含有两个LysM结构域的氨基酸基序,其间还存在着一个SH3结构域的氨基酸基序,而p60蛋白的C端只含有一个NlpC/P60家族结构域的氨基酸基序。但到目前为止,这些结构域在p60蛋白中的确切功能还不清楚。本研究表达和纯化了全长p60蛋白、LysM1结构域、LysM2结构域、SH3结构域、C端结构域、LysM1-SH3结构域共存体以及LysM1结构域缺失体共七种重组蛋白。本研究利用Insoluble Pulldown法鉴定出p60蛋白的N端结构域行使结合功能,且LysM1、SH3、LysM2结构域均具有结合活性但LysM1的活性较弱,而p60蛋白的C端结构域则完全不具有结合活性。随后,本研究利用复性SDS-PAGE法鉴定出p60蛋白的C端结构域行使裂解功能。此外,本研究发现LysM1-SH3结构域共存体的结合活性不单单是LysM1与SH3结构域结合活性的简单相加,这表明LysM1与SH3结构域之间可能存在着协同结合底物的作用。最后,本研究综合运用Insoluble Pulldown法和比浊法测定了LysM1结构域缺失体的结合活性和裂解活性,实验结果表明：虽然LysM1结构域的缺失只导致p60蛋白整体的结合活性下降约10%,但会使p60蛋白整体裂解活性的降幅达到70%。已有研究显示：p60蛋白具有裂解细菌细胞壁的活性,其对细胞壁的裂解可以帮助Lm逃避宿主的先天免疫系统,而使其能在宿主细胞中存活和繁殖,导致宿主出现严重的李斯特菌病。而p60蛋白与底物的识别与结合是其发挥裂解活性的首要前提,因此对p60蛋白的底物结合特性进行全面研究也是本研究的一项重要工作。本研究确定了p60蛋白不是金属蛋白且该蛋白内不含有二硫键。当温度为36℃,pH值为7.5时,p60蛋白的结合活性达到最大,且其活性能被10mM的Na+、K+、和Ca2+分别提高11%、15%以及21%。本研究还发现,p60蛋白作为一种细菌LysM蛋白并不区分GlcNAc-MurNAc与GlcNAc多聚物。本研究也得出了N-乙酰葡糖胺C2’位置上的酰胺基在结合反应中是至关重要的结论。最后,分子筛层析实验结果表明p60蛋白在缓冲液中是以单体的形式存在。

关键词：单核细胞增生李斯特菌 p60蛋白结构域功能 LysM结构域底物识别结合

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计算机辅助模拟、设计和分析α-L-鼠李糖苷酶结构域的功能

计算机辅助模拟、设计和分析α-L-鼠李糖苷酶结构域的功能

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作者：刘嘉男集美大学

学位级别：硕士

α-L-鼠李糖苷酶能够水解末端带有鼠李糖基的糖苷类物质如柚皮苷、芦丁等,是一种常见的糖苷水解酶,已经在食品加工、食品风味改良等方面投入使用。作为一种重要的绿色、经济型催化剂,催化效率是决定酶应用于食品工业的关键因素。本论文... 详细信息

α-L-鼠李糖苷酶能够水解末端带有鼠李糖基的糖苷类物质如柚皮苷、芦丁等,是一种常见的糖苷水解酶,已经在食品加工、食品风味改良等方面投入使用。作为一种重要的绿色、经济型催化剂,催化效率是决定酶应用于食品工业的关键因素。本论文通过建立塔宾曲霉α-L-鼠李糖苷酶三维结构模型、设计结构域替换来构建重组子、进行异源表达和性质表征;在综合分析催化活性、动力学参数、氨基酸残基间作用力的基础上探究了不同结构域的功能,为后续改良催化效率、拓展该酶在食品加工中的应用范围和深度提供了理论基础。主要结果如下:(1)对塔宾曲霉α-L-鼠李糖苷酶和白曲霉α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列进行比对,比对结果相似性92%。使用Modeller 9.15软件对塔宾曲霉α-L-鼠李糖苷酶进行建模,进一步通过能量最小化优化得到评价合理的三维结构模型。对模型和结构域分析发现塔宾曲霉α-L-鼠李糖苷酶由两个β折叠结构域和一个(α/α)6桶状结构域组成。分子对接结果发现,底物与模型直接的结合部位位于桶状结构域的底部。(2)通过计算机辅助分析结构域连接处氨基酸残基的相互作用,确定了以Gly400和Asn787为替换位点,将白曲霉α-L-鼠李糖苷酶的桶状结构域替换为塔宾曲霉α-L-鼠李糖苷酶对应的结构域,构建了重组子AK-rhaαT进行重组表达。酶活结果显示,重组酶的酶活是白曲霉α-L-鼠李糖苷酶的38倍;动力学参数表明,重组酶Km值为0.33 mM,kcat值催化常数为3.06×10 s。(3)在桶状结构域替换的基础上分别将塔宾曲霉α-L-鼠李糖苷酶其余两个结构域替换到白曲霉α-L-鼠李糖苷酶上,构建重组子AK-rhaαTβT1、AK-rhaαTβT2并进行表达。测定酶活和动力学参数显示,酶活分别是白曲霉α-L-鼠李糖苷酶的129.3和132.4倍;动力学参数两个重组酶中Km值分别为0.37 mM、1.5 mM,kcat值分别为3.67×104 s-1、9.17×104 s-1。(4)对重组酶的酶学性质进行分析,重组酶的最适温度为60℃、最适pH为4.0,在pH为4.0-6.0时具有较好稳定性、重组酶AK-rhaαT、AK-rhaαTβT1、AK-rhaαTβT2在60℃半衰期分别为4.5 h、6 h、5 h,在65℃半衰期分别为50 min、60 min、55 min。通过对白曲霉α-L-鼠李糖苷酶和塔宾曲霉α-L-鼠李糖苷酶序列中差异位点氨基酸残基氢键作用力分析,发现与白曲霉α-L-鼠李糖苷酶相比,塔宾曲霉α-L-鼠李糖苷酶两个β结构域上残基间的氢键作用力更少、桶状结构域中残基间氢键作用力更多,该差异可能是塔宾曲霉α-L-鼠李糖苷酶催化常数变大,催化反应速度变快,酶活远高于白曲霉α-L-鼠李糖苷酶的主要原因。

关键词： α-L-鼠李糖苷酶结构域功能计算机辅助同源建模分子对接

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MFG-E8作为外泌体载体蛋白的作用与功能

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生物技术通报 2022年第4期38卷 288-294页

作者：黎智康刘晨雪璇谭楚敏熊盛谢秋玲暨南大学生命科学技术学院广州510632 基因工程药物国家工程研究中心广州510632

构建MFG-E8全长和截短体的重组质粒,分析各截短体蛋白能否将目的蛋白带到外泌体上并确定其位置,以探讨MFG-E8各结构域功能及其作为外泌体上载体蛋白的效率。利用PCR扩增出带有信号肽的MFG-E8及其截短体基因,与EGFP基因连接,构建7种重组... 详细信息

构建MFG-E8全长和截短体的重组质粒,分析各截短体蛋白能否将目的蛋白带到外泌体上并确定其位置,以探讨MFG-E8各结构域功能及其作为外泌体上载体蛋白的效率。利用PCR扩增出带有信号肽的MFG-E8及其截短体基因,与EGFP基因连接,构建7种重组质粒。之后PEI介导瞬转HEK293F细胞进行表达,利用EGFP的荧光,通过Western blot和激光共聚焦显微镜检测蛋白表达情况及其在胞内的位置。同时提取转染细胞分泌的外泌体,通过Western blot和电镜检测重组蛋白在外泌体中的情况。最后将含有重组蛋白的外泌体转染293T细胞,荧光显微镜观察外泌体将重组蛋白带入受体细胞中的情况。结果表明,成功构建MFG-E8全长及截短体重组质粒并在HEK293F细胞中表达,各重组蛋白在胞内均有表达,其中EGF-L表达量最高,C2最低,细胞上清中只能检测到EGF-L、C1、EC1的表达。转染细胞分泌的外泌体只检测到MFG-E8、EC1和C1C2三种蛋白。含有这3种蛋白的外泌体转染HEK293T细胞,3组细胞均有荧光,其中MFG-E8-EGFP的外泌体效果最好。MFG-E8能够作为蛋白载体将目的蛋白带到外泌体膜上,其C1、C2结构域对该过程至关重要,EGF-L的存在可以促进蛋白表达。

关键词：乳脂肪球表皮生长因子Ⅷ(MFG-E8) 截短体外泌体载体蛋白结构域功能

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人PRMT5基因的生物信息学分析

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基因组学与应用生物学 2019年第5期38卷 2259-2264页

作者：郭萍任晨霞麻丽霞郭颖曹文君长治医学院中心实验室

PRMT5 (Protein arginine methyltransferase 5)已经广泛地作为组蛋白甲基转移酶修饰H4R3、H2AR3和H3R8,从而潜在地影响多个信号传导途径。本研究为了对人PRMT5基因进行生物信息学方面的深入分析,以PRMT5基因序列及编码蛋白序列为材料,... 详细信息

PRMT5 (Protein arginine methyltransferase 5)已经广泛地作为组蛋白甲基转移酶修饰H4R3、H2AR3和H3R8,从而潜在地影响多个信号传导途径。本研究为了对人PRMT5基因进行生物信息学方面的深入分析,以PRMT5基因序列及编码蛋白序列为材料,通过生物信息学方法分析了PRMT5基因的DNA序列、启动子及CpG岛、RNA结构,及该蛋白的理化性质、亚细胞定位、信号肽与跨膜区域、互作蛋白、系统发育等。研究结果表明,人PRMT5在物种间的保守性相对较高,位于染色体14q11.2,大小为1 911 bp,潜在核心启动子在1 014~1 064 bp,没有预测到CpG岛。PRMT5基因编码637个氨基酸残基,分子量为10 157 Da,等电点为5.88,不稳定系数是44.33;该蛋白更可能定位于细胞质,无明显的信号肽及跨膜结构;主要的二级结构元件是α-螺旋结构和无规卷曲,包含一个SAM-dependent MTase功能结构域,同时有10个可能的互作蛋白;进化分析表明黑猩猩和猕猴与人PRMT5蛋白亲缘关系最近。

关键词： PRMT5基因结构域功能生物信息学分析

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水稻OsMDH基因的克隆及其生物信息学分析

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信阳师范学院学报（自然科学版） 2023年第2期36卷 243-248页

作者：彭波孙晓宇张庆茜彭娟娄安琪孙艳芳庞瑞华周伟汪全秀信阳师范学院生命科学学院/大别山农业生物资源保护与利用研究院河南信阳464000 信阳市植保植检站河南信阳464000

水稻(Oryza sativa L.)OsAAP6基因是控制水稻种子蛋白质含量的主效数量性状座位(quantitative trait locus,QTL)基因,对水稻品质性状产生重要影响,而OsMDH蛋白能够与OsAAP6基因发生相互作用。利用生物信息学策略对OsMDH蛋白的理化性质... 详细信息

水稻(Oryza sativa L.)OsAAP6基因是控制水稻种子蛋白质含量的主效数量性状座位(quantitative trait locus,QTL)基因,对水稻品质性状产生重要影响,而OsMDH蛋白能够与OsAAP6基因发生相互作用。利用生物信息学策略对OsMDH蛋白的理化性质、蛋白结构及功能进行预测,探究OsMDH基因的生物学功能。结果表明:水稻OsMDH基因的编码区(coding sequence,CDS)区长999 bp,编码332个氨基酸;编码蛋白为疏水蛋白且不存在信号结构,包含两个跨膜结构。通过蛋白互作分析,发现OsMDH可能与柠檬酸合酶、延胡索酸酶等发生相互作用,参与三羧酸循环过程。

关键词：水稻 OsMDH基因结构域功能生物信息学分析

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