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极细链格孢菌激活蛋白PeaT1结构域分析与功能研究

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极细链格孢菌激活蛋白PeaT1结构域分析与功能研究

作者：李明勇中国农业科学院

学位级别：硕士

PeaT1是一种从极细链格孢菌中分离纯化的激活蛋白,具有促进植物生长、提高植物抗性的作用。为了阐明PeaT1多效机制是否取决于分子内部可能存在的功能域,本文分析了PeaT1的结构域,构建了PeaT1及其三个缺失突变体表达载体,分别诱导表达目... 详细信息

PeaT1是一种从极细链格孢菌中分离纯化的激活蛋白,具有促进植物生长、提高植物抗性的作用。为了阐明PeaT1多效机制是否取决于分子内部可能存在的功能域,本文分析了PeaT1的结构域,构建了PeaT1及其三个缺失突变体表达载体,分别诱导表达目的蛋白,以期分析PeaT1结构域对其生物学效应和蛋白特性的影响。主要研究结果如下:***1及其缺失突变体表达载体的构建通过提取极细链格孢菌的总RNA,反转录成cDNA,进而扩增获得了peaT1基因。利用生物信息学对PeaT1蛋白进行了初步分析,得知其有两个结构域:NAC(49-108位AA)和UBA/TS-N(162-206位AA)。用PCR方法扩增了3个缺失基因片段:peaT1-△CD99、peaT1-△ND49和peaT1-△ND108,将这三个片段分别与pET-28a连接构建了三个缺失突变体的融合表达载体。***1及其三个缺失突变体蛋白的表达和纯化将peaT1和三个缺失基因片段的表达载体转入*** BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导进行表达,获得了PeaT1及其缺失突变体蛋白。用蛋白纯化系统(AKTA Explorer10.0)对表达蛋白进行His?Tag亲和层析和脱盐处理,通过生物质谱技术获得了PeaT1的标准分子量为26.319kD,与理论蛋白的分子量26.259kD相符。***1及其突变体蛋白的功能比较与分析三个缺失突变体与PeaT1蛋白一样,对小麦生长和抗病性都有显著的促进作用,而各表达蛋白之间的生物活性没有显著差异。结合生物信息学分析和前人研究结果推测:PeaT1蛋白NAC保守区域的作用机理,可能是其充当分子伴侣的作用,促进蛋白的正确折叠,以及其通过OB结合域的方式与TBP等转录因子结合,通过转录共激发子的作用促进下游某些基因的转录来促进植物生长,提高抗性;UBA/TS-N保守区域,与翻译延伸因子EF1B(EF-Ts)相似,可能更多的是担当一种翻译共激发子来诱导植株生长和增强植物抗逆。由此推测,PeaT1的2个结构域可能具有独立或类似的生物功能。4.稳定同位素标记技术研究PeaT1及其突变体蛋白诱导日本晴蛋白的差异表达分别用15N和14N培养基培养日本晴幼苗,在相同的生长环境下,用PeaT1及其突变体蛋白处理15N标记的水稻(14N标记水稻作为对照)。通过质谱测定获得了近百种上调表达的蛋白,确定了PeaT1和3个缺失基因片段编码的蛋白均能引起水稻日本晴蛋白的差异表达。通过对33种差异蛋白的功能分析,得知它们与植物叶绿体光系统Ⅰ、光系统Ⅱ和翻译起始因子相关,为激活蛋白作用机理的研究提供了理论基础。***1及其三个突变体蛋白的热稳定性分析对表达的PeaT1和三个突变体蛋白的耐热性进行了分析,结果显示它们都具有很好的热稳定性。通过氨基酸组成特性、三级结构的作用力分析了蛋白的耐热机制。分析显示,PeaT1及其突变体蛋白的氨基酸组成具有如下共同特征:含有较多的带电氨基酸形成盐桥;含有较多疏水氨基酸形成强大的疏水作用力;含有较多的Ala、Glu使蛋白更容易形成α-螺旋。含有极少的Gln、Asn、Trp和Cys等,避免它们分别因为脱氨、氧化和二硫键断裂等而致使蛋白不稳定。通过热稳定性分析结果,结合PeaT1蛋白的二级结构预测,推测NAC和UBA/TS-N两个结构域在空间是以相对独立而非聚集的形式存在。

关键词：激活蛋白PeaT1 结构域分析缺失突变促生长作用抗病性热稳定性

苹果磷脂酰乙醇胺结合蛋白PEBP家族基因的鉴定与比较分析

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植物生理学报 2021年第10期57卷 1996-2010页

作者：王寻高凝张富军韩月彭王小非由春香郝玉金山东农业大学园艺科学与工程学院作物生物学国家重点实验室山东果蔬优质高效生产协同创新中心山东泰安271018 中国科学院武汉植物园中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室武汉430074

磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)控制植物开花转变和营养生长。本研究在GDDH13苹果参考基因组中鉴定了9个苹果PEBP基因。通过序列比较和进化分析,苹果(Malus domestica) PEBP蛋白由1个MFT-like蛋白、1个FT-like蛋白、6个TFL1-like蛋白和另外... 详细信息

磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)控制植物开花转变和营养生长。本研究在GDDH13苹果参考基因组中鉴定了9个苹果PEBP基因。通过序列比较和进化分析,苹果(Malus domestica) PEBP蛋白由1个MFT-like蛋白、1个FT-like蛋白、6个TFL1-like蛋白和另外的1个PEBP-like成员构成。在保守位点的位置和组成方面,这四组PEBP蛋白具有一定的相似性,且在组内也有独特性。9个苹果PEBP成员具有相似的结构域分布和蛋白质结构, Motif 4、Motif 3、Motif 1和Motif 2共同构成了PEBP结构域,无规卷曲在二级结构中占有较大比例。苹果PEBP启动子区含有多种调控元件,如响应光照的G-box、响应低温的LTR、响应脱落酸的ABRE元件等。通过表达分析,发现不同的MdPEBP基因具有多样化的表达模式,部分成员可能参与低温过程、脱落酸和水杨酸响应。

关键词：苹果 PEBP基因序列比较氨基酸位点结构域分析表达特征

Hc-fau基因结构域功能及Hc-FAU天然融合蛋白现象的初步研究

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Hc-fau基因结构域功能及Hc-FAU天然融合蛋白现象的初步研究

嗜酸氧化亚铁硫杆菌RND家族转运蛋白基因(rnd-1)的克隆及生物信息学分析

中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会

作者：郭筱璐闫宝龙杨怡黄艳丁豪杰郑秀平陈学秋杜爱芳浙江大学动物科学学院浙江省动物预防医学重点实验室

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)为吸血性寄生虫,能够在L4早期阶段进入滞育状态来躲避不利于自身生存的恶劣条件。本研究旨在研究Hc-fau基因各结构域所发挥的功能以及Hc-FAU天然融合蛋白特性分析。实验利用模式生物秀丽隐杆线虫(Cae... 详细信息

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)为吸血性寄生虫,能够在L4早期阶段进入滞育状态来躲避不利于自身生存的恶劣条件。本研究旨在研究Hc-fau基因各结构域所发挥的功能以及Hc-FAU天然融合蛋白特性分析。实验利用模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)对同源基因Ce-rps30进行基因沉默以及过表达,综合分析虫体的表型变化;利用HEK293细胞系表达Hc-FAU,通过表达时间及对HEK293细胞系进行处理,观察融合蛋白的变化;并通过Western blot检测蛋白的裂解情况;最后通过SwissModel对结构域进行预测。结果显示,通过虫体表型分析,可以得知UBil和S30结构域对于体细胞和性腺细胞的调节具有协同作用,且UBil主要调节性腺细胞的发育而S30结构域主要调节体细胞的发育。Western blot结果显示Hc-FAUA在细胞中既有融合的形式也有裂解的形式。而Hc-FAUB则主要以融合的形式存在。在单独表达UBil或是S30结构域时,它们可以与其它蛋白相互作用。Hc-FAUB在N端比Hc-FAUA缺少的23个氨基酸由2个β折叠和1个α螺旋组成,结合试验结果分析,这个结构对于Hc-FAUA-UBil的功能起到抑制的作用。综上所述,本实验通过结构预测和实验验证,证实了S30的核定位信号,并鉴定出了其核仁定位信号。

关键词：捻转血矛线虫 Hc-fau 结构域分析天然融合蛋白

来源： cnki会议评论

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基因组学与应用生物学 2017年第6期36卷 2410-2416页

作者：冷非凡魏清伟王永刚景艳军孙尚琛麻慧王艳玲马建忠兰州理工大学生命科学与工程学院兰州730050 兰州兰石能源装备工程研究院有限公司兰州730000

RND(resistance-nodulation-division)家族转运蛋白广泛分布于革兰氏阴性细菌中,具有催化胞内活性物质(胆酸盐,脂肪酸等)和外排金属离子(Cu^+,Ag^+)的作用。为探究嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobaeillus ferrooxidans,***)RND transporter的功能特性,以本实验室分离鉴定的*** GB2为材料,采用PCR扩增技术克隆了rnd-1基因。运用生物信息学在线分析软件对该基因编码的氨基酸序列的理化性质、结构特征、功能结构域、系统发育以及可能参与的代谢通路等进行了预测。数据表明:该基因cDNA序列全长1 320 bp,编码439个氨基酸,分子式为C_(2100)H_(3330)N_(610)O_(604)S_(13),相对分子质量为47.204 kD,为亲水性蛋白;无信号肽,富含延伸链和无规则卷曲结构,三维结构预测表明其符合4KKU结构生物学特点;采用最大似然法构建系统发生树发现RND transporter蛋白在嗜酸氧化亚铁硫杆菌与嗜酸氧化硫硫杆菌中亲缘关系比较近;肽链含有10处磷酸化位点,10处糖基化位点,可能参与细胞质中磷酸化反应,从而对重金属胁迫进行感知和表达。本研究推测该基因在微生物抗重金属过程中有重要的作用。

关键词：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 RND transporter 结构域分析系统进化树

IRE1与ERS时细胞增殖及凋亡的实验研究

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IRE1与ERS时细胞增殖及凋亡的实验研究

作者：刘平重庆医科大学

学位级别：硕士

目的根据IRE1组成的四个不同结构域,分别构建IRE1全长、缺失体及截短型真核表达载体;构建靶向IRE1的RNA干扰质粒pSUPER-IRE1,运用MTT、细胞计数、BrdU、流式细胞术等方法研究肝癌细胞在ERS时,IRE1与细胞增殖及凋亡的关系。方法（1... 详细信息

目的根据IRE1组成的四个不同结构域,分别构建IRE1全长、缺失体及截短型真核表达载体;构建靶向IRE1的RNA干扰质粒pSUPER-IRE1,运用MTT、细胞计数、BrdU、流式细胞术等方法研究肝癌细胞在ERS时,IRE1与细胞增殖及凋亡的关系。方法（1）使用Oligo Engine软件设计两条IRE1 siRNA序列,合成两对干扰序列,分别插入到空载体pSUPER中,构建靶向IRE1的两条干扰质粒pS1-IRE1和pS2-IRE1。将构建好的干扰质粒分别转染到HeLa细胞和HepG2细胞中,RT-PCR方法分别检测pS1-IRE1和pS2-IRE1转染前后IRE1转录的变化;免疫印迹分别检测pS1-IRE1和pS2-IRE1转染前后IRE1蛋白表达的变化。（2）应用PCR重组技术,以pCMV-IRE1为模板分别扩增IRE1全长、缺失体和截短型序列,利用DNA重组技术将片段定向插入到真核表达载体pcDNA3.1（-）中,经酶切及测序鉴定后,免疫印迹检测各重组载体在细胞中的表达,并利用SWISS-MODEL在线软件预测IRE1各组成结构域的蛋白结构;以免疫荧光技术检测IRE1在不同细胞中的定位分布。（3）以内质网应激诱导剂衣霉素Tm建立ERS细胞模型,将构建好的各重组质粒和空质粒分别转染肝癌细胞SMMC-7721,运用MTT、细胞计数以及BrdU检测ERS时IRE1与细胞增殖的关系。（4）Tm刺激细胞建立细胞应激模型,运用流式细胞术检测转染上述各组重组质粒后细胞周期分布及凋亡率,研究ERS时IRE1及各结构域与细胞凋亡的关系。结果（1）成功构建IRE1的干扰质粒pS1、pS2;转染HeLa和HepG2细胞后IRE1的mRNA水平和蛋白水平与对照组相比均有明显降低,mRNA水平pS1抑制率分别是69.67%和57.14%,pS2抑制率分别是67.85%和55.79%;蛋白水平pS1抑制率分别为pS1 71.14%和54.65%,pS2抑制率为67.26%和44.62% ,差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）成功构建真核表达载体pIRE1、pD-Kinase、pD-RNase、pNLD、pKinase、pR+K和pRNase,转染HEK293细胞后,均能在细胞中检测到正确表达,免疫荧光检测不同细胞中IRE1均定位分布于细胞质中。（3）ERS状态下,过表达IRE1对于SMMC-7721细胞增殖具有促进作用;而转染pS1-IRE1和pS2-IRE1干扰质粒、IRE1缺失体真核载体pD-Kinase和pD-RNase以及IRE1各截短型真核载体pNLD、pKinase、pR+K和pRNase,对于SMMC-7721细胞的增殖均有抑制作用,各组差异均具有统计学意义（P＜0.05）。其中IRE1组成结构域Kinase和RNase与细胞增殖作用密切相关,而IRE1的每一个组成结构域对细胞增殖的作用是不同的。（4）ERS状态下,过表达IRE1明显抑制SMMC-7721细胞的凋亡;而转染pS1-IRE1和pS2-IRE1干扰质粒、IRE1缺失体真核载体pD-Kinase和pD-RNase以及IRE1各截短型真核载体pNLD、pKinase、pR+K和pRNase,对于SMMC-7721细胞的凋亡均有促进作用,各组差异均具有统计学意义（P＜0.05）。其中IRE1组成结构域Kinase和RNase与细胞凋亡密切相关,而IRE1的每一个组成结构域对细胞凋亡的作用是不同的。结论成功构建IRE1全长真核载体pIRE1、IRE1缺失体真核载体pD-Kinase和pD-RNase及IRE1截短型真核载体pNLD、pKinase、pR+K、pRNase和pS1-IRE1和pS2-IRE1干扰质粒;ERS时,过表达IRE1促进细胞增殖,抑制细胞凋亡;IRE1组成结构域Kinase和RNase与细胞增殖及凋亡密切相关。

关键词： ERS IRE1 结构域分析细胞增殖细胞凋亡

费氏中华根瘤菌HN01pmrA所在基因簇的结构分析

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广西农业生物科学 2007年第1期26卷 14-19页

作者：曹永强隆文杰梁善范陈钢陆祖军武波广西大学生命科学与技术学院广西南宁530005

经原位杂交,从费氏中华根瘤菌HN01基因组文库中钓出含有pmrA基因的阳性克隆pGXHN 300,对其进行亚克隆测序得到pm rA两翼6.8 kb的DNA序列。生物信息学分析显示,该序列包括6个完整的ORF和1个不完整ORF。pm rA所在的基因簇含有4个ORF:ORF a... 详细信息

经原位杂交,从费氏中华根瘤菌HN01基因组文库中钓出含有pmrA基因的阳性克隆pGXHN 300,对其进行亚克隆测序得到pm rA两翼6.8 kb的DNA序列。生物信息学分析显示,该序列包括6个完整的ORF和1个不完整ORF。pm rA所在的基因簇含有4个ORF:ORF a、ORFb、ORF c、ORFd(pm rA)。其中,ORF a与Rh izobium etli的cy sG(CAA 04958.1)在氨基酸水平一致性为79%,相似性为87%。对ORF c序列分析发现与亚硫酸及亚硝酸还原相关的保守结构域。通过融合PCR方法,将两个潜在的启动子序列分别连在gus上游,以pTR102为载体导入HN 01中。在完全培养基YMA上两个启动子均不表达,在以硝酸钠为氮源,亚硫酸钠、硫酸钠或甲硫氨酸分别为硫源的MM培养基上生长均表达出GU S活性,表明这两个潜在的启动子与硫、氮代谢相关。

关键词：费氏中华根瘤菌基因文库结构域分析启动子