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经血源性间充质干细胞来源外泌体治疗大鼠宫腔粘连的研究

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经血源性间充质干细胞来源外泌体治疗大鼠宫腔粘连的研究

作者：常琦圆中国医科大学

学位级别：硕士

目的:宫腔粘连常见于人工流产、自然流产刮宫术、产后感染及宫腔手术后,是我国妇女继发性不孕的第二大病因。间充质干细胞移植在损伤修复和疾病治疗方面应用广泛,其中经血源性间充质干细胞(menstrual blood-derived stromal cells,MenS... 详细信息

目的:宫腔粘连常见于人工流产、自然流产刮宫术、产后感染及宫腔手术后,是我国妇女继发性不孕的第二大病因。间充质干细胞移植在损伤修复和疾病治疗方面应用广泛,其中经血源性间充质干细胞(menstrual blood-derived stromal cells,MenSCs)在具有间充质干细胞共性的同时,还具有获取容易、来源丰富以及低免疫原性的特点,在干细胞再生医学领域拥有广阔的发展前景。我们之前的研究结果已经证实了MenSCs对重度宫腔粘连患者以及大鼠宫腔粘连模型的治疗作用,在探究其治疗机制时,我们发现MenSCs可能通过其旁分泌发挥部分的治疗效应。为了进一步探索MenSCs的旁分泌作用,我们用MenSCs来源的外泌体(MenSCs-Exos)治疗大鼠宫腔粘连模型,以观察MenSCs-Exos的治疗效果,并探索其可能的作用机制。研究方法:超速离心法分离提取MenSCs无血清培养上清中的外泌体,通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析(NTA)和western blot技术对其进行鉴定,Shotgun法对其进行测序分析;采用机械损伤法建立大鼠模型,造模后大鼠随机分为三组,分别注射PBS、MenSCs和MenSCs-Exos进行治疗;通过组织病理学染色、胶原蛋白表达以及妊娠情况,评价治疗后宫腔粘连大鼠的子宫内膜形态、纤维化沉积以及生育力的改善;通过免疫组化染色检测治疗后子宫内膜上的细胞增殖情况;通过三维成像技术观察MenSCs和MenSCs-Exos在子宫内的分布以及对子宫内膜腺体和血管再生的影响;通过western blot技术检测治疗后子宫内膜容受性蛋白的表达情况。结果:成功分离提取MenSCs-Exos,透射电镜观察MenSCs-Exos呈典型的圆形杯状囊泡样,有完整的膜结构,NTA结果显示粒径大小介于30-150nm之间,western blot鉴定外泌体标志CD63和CD81的表达;MenSCs和MenSCs-Exos经子宫移植后能够显著促进宫腔粘连大鼠内膜再生,增加其腺体数量,减少胶原纤维沉积;生育结果显示,MenSCs组和MenSCs-Exos组的胚胎数量显著高于对照组;免疫组化检测结果显示,MenSCs组和MenSCs-Exos组与对照组相比,上皮细胞胞核阳性表达Ki67的数量显著增多,胞浆CK-18阳性表达量显著增加;三维成像结果显示,MenSCs-Exos移植后可迁移至再生腺体周围,MenSCs移植后可迁移至血管附近,二者均可促进子宫内膜的腺体和血管再生;Western blot的检测结果显示,MenSCs和MenSCs-Exos治疗显著提高子宫内膜容受性蛋白的表达。结论:MenSCs来源的外泌体具有损伤趋向性,可以有效修复受损内膜,增加内膜的腺体和血管形成,提高子宫内膜容受性,恢复IUA大鼠的生育能力,能够获得与MenSCs同等的治疗效果。我们的研究结果证明了MenSCs来源的外泌体在MenSCs治疗中的重要作用,为MenSCs-Exos作为一种替代MenSCs的无细胞疗法治疗IUA提供了理论基础。

关键词：宫腔粘连经血源性间充质干细胞外泌体再生医学干细胞疗法

经血源性间充质干细胞修复子宫内膜损伤的Th1/Th2细胞免疫调节研究

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经血源性间充质干细胞修复子宫内膜损伤的Th1/Th2细胞免疫调节研究

作者：刘苗苗河北医科大学

学位级别：硕士

目的:研究发现经血源性间充质干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs)可有效修复子宫内膜损伤,其作用机制尚不清楚。本文就MenSCs在修复损伤性子宫内膜过程中对IFN-γ、IL-2以及IL-6的影响进行探讨,为进一步研... 详细信息

目的:研究发现经血源性间充质干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs)可有效修复子宫内膜损伤,其作用机制尚不清楚。本文就MenSCs在修复损伤性子宫内膜过程中对IFN-γ、IL-2以及IL-6的影响进行探讨,为进一步研究MenSCs的免疫调节机制。方法:1.建立小鼠子宫内膜损伤模型。每天同一时间用生理盐水冲洗小鼠阴道取阴道分泌物,并采用HE染色方法检测,来判断动情周期。于动情期当天的下午宫腔灌注95%乙醇并滞留15 s,建立子宫内膜损伤模型。建模三个动情周期后于动情期当天的下午收集子宫组织,并通过HE染色观察子宫内膜组织形态及厚度。2.研究MenSCs修复损伤性子宫内膜的Th 1/Th 2细胞免疫调节作用。实验分为三组:正常对照组、PBS移植组及干细胞移植组。正常对照组:未建立子宫内膜损伤模型及未作任何处理,PBS移植组:小鼠宫腔灌注95%乙醇并滞留15 s后立即原位移植PBS,干细胞移植组:小鼠宫腔灌注95%乙醇并滞留15 s后立即原位移植MenSCs,并于三个动情周期后收集子宫组织,通过Western Blot及实时荧光定量PCR方法,测定三组子宫内膜组织中的干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)、IL-2以及IL-6表达量,进而了解MenSCs修复子宫内膜损伤的免疫调节机制。结果:1.小鼠动情周期检测:动情前期的阴道分泌物涂片可见大量有核上皮细胞以及少量的角化细胞,动情期涂片可见满视野角化上皮细胞以及少量的有核上皮细胞,动情后期的涂片可见少量角化上皮细胞以及白细胞,动情间期的涂片可见大量的白细胞;***染色观察:子宫内膜损伤组子宫内膜明显变薄,腔上皮细胞受损甚至断裂,腺体减少,证明模型成功;3.使用Western Blot方法检验免疫因子的蛋白表达量,其中干细胞移植组IFN-γ的表达量低于PBS移植组(P干细胞移植组IL-2的表达量低于PBS移植组(P干细胞移植组IL-6的表达量高于PBS移植组(P干细胞移植组IFN-γ的m RNA表达量低于PBS移植组(P干细胞移植组IL-2的m RNA表达量低于PBS移植组(P干细胞移植组IL-6的m RNA表达量高于PBS移植组(P细胞为主的炎症反应,并且可能抑制了抑炎因子IL-6发挥保护机体免疫耐受的作用。2.在经过MenSCs原位移植后的小鼠则出现IL-6的高表达,以Th 2细胞为主的抗炎反应,其有利于子宫内膜修复,同样也可能抑制促炎因子IFN-γ、IL-2引起的免疫异常反应。***治疗后小鼠子宫内膜炎症反应仍存在,故所使用干细胞治疗剂量需进一步改善。

关键词：经血源性间充质干细胞子宫内膜损伤 Th1/Th2细胞免疫调节

经血源性间充质干细胞分化潜能及对人子宫内膜间质细胞作用研究

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经血源性间充质干细胞分化潜能及对人子宫内膜间质细胞作用研究

作者：赵元习河北医科大学

学位级别：硕士

目的:比较贴壁法和密度梯度离心法分离提取经血源性间充质干细胞;探讨经血源性间充质干细胞对子宫内膜间质细胞的作用,为其临床应用提供依据。方法:1.使用无菌月经杯收集年龄<35岁的健康女性第2-4天的月经血,通过Ficoll密度梯度离心法... 详细信息

目的:比较贴壁法和密度梯度离心法分离提取经血源性间充质干细胞;探讨经血源性间充质干细胞对子宫内膜间质细胞的作用,为其临床应用提供依据。方法:1.使用无菌月经杯收集年龄性第2-4天的月经血,通过Ficoll密度梯度离心法和贴壁法提取Men SCs,并采用流式细胞术鉴定。2.通过添加生长因子和17-β-戊酸雌二醇构建Men SCs向子宫内膜细胞方向分化的微环境,诱导Men SCs的转化,通过免疫荧光法检测ESCs特异性标记蛋白Vimentin和上皮细胞特异性标记蛋白CK,评估Men SCs的转化能力。3.选取行宫腔镜刮宫的患者,收集子宫内膜组织,通过二次网筛法分离ESCs并培养,采用免疫荧光法进行鉴定。4.间接共培养Men SCs与ESCs,通过CCK-8法评估Men SCs对正常ESCs的增殖作用,Western-blot检测共培养后ESCs胞质内的Vimentin和VEGF的表达量,观察Men SCs培养基培养后对这两种蛋白的表达影响。结果:***密度梯度离心法所提取出的细胞表面标志物的阳性表达率分别为83.88%、98.69%、98.78%、99.80%,贴壁法表面标志物的阳性表达率分别为61.39%、65.15%,99.66%、100.00%。两种方法提取的Men SCs表面HLA-DR、CD34和CD45表达均为阴性;*** SCs经生长因子和17-β-戊酸雌二醇诱导后,形态开始发生改变,由短梭形向长梭形变化,形态趋于ESCs的长梭形,呈现抱团式、旋涡式生长。Vimentin和CK表达阳性;3.加入Men SCs培养基培养24 h,48 h,72 h的子宫内膜间质细胞吸光度值,较单独培养的子宫内膜间质细胞明显增高。实验组Vimentin、VEGF蛋白的表达量高于对照组,有显著性差异(P细胞和上皮细胞。*** SCs可促进人子宫内膜间质细胞增殖,增强VEGF的表达,改善子宫内膜容受性。

关键词：经血源性间充质干细胞子宫内膜间质细胞薄型子宫内膜

经血源性间充质干细胞与温敏性水凝胶构建细胞支架复合物的体外研究

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经血源性间充质干细胞与温敏性水凝胶构建细胞支架复合物的体外研...

作者：高华郑州大学

学位级别：硕士

背景宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUA)是指子宫内膜因多种因素受损,从而出现内膜修复障碍,表现子宫内膜薄、月经异常(经量减少或闭经)。手术、激素治疗、物理屏障的放置是目前IUA治疗的主要方法,但是这些未能明显改善中重度IUA患... 详细信息

背景宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUA)是指子宫内膜因多种因素受损,从而出现内膜修复障碍,表现子宫内膜薄、月经异常(经量减少或闭经)。手术、激素治疗、物理屏障的放置是目前IUA治疗的主要方法,但是这些未能明显改善中重度IUA患者的生育能力,因此需要寻找新的治疗方法来促进子宫内膜的修复和再生,从而改善生殖能力。随着细胞治疗在组织损伤和修复中的发展,干细胞疗法在IUA中的研究越来越多,并且国内外大量研究表明干细胞对子宫内膜的修复具有一定的治疗效果。目前用于IUA研究的干细胞有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和子宫内膜间充质干细胞等。其中经血源性间充质干细胞(menstrual derived mesenchymal stem cells,MenSCs)因来源广、可周期性获得、无创等优点,成为治疗IUA自体干细胞移植理想的细胞来源,但是单纯的干细胞灌注定植率较低,联合水凝胶可以增加干细胞在子宫内膜表面的粘附,有助于提高干细胞的存活和定植率。聚丙交酯-乙交酯/聚乙二醇/聚丙交酯-乙交酯(PLGA-PEG-PLGA)水凝胶是一种人工合成的温敏性水凝胶,在人体生理温度下可以变成凝胶,当温度在室温时变成溶胶,可用于原位注射。并且该水凝胶被证明无毒、对人体无害,是一种有潜力的载体介质。目前尚未有研究将MenSCs与PLGA-PEG-PLGA水凝胶构建细胞支架复合物的报道。本实验针对IUA所致薄型子宫内膜患者构建一种高效的MenSCs分离培养方法,并将MenSCs与改良的PLGA-PEG-PLGA水凝胶构建细胞支架复合物,检测其细胞在水凝胶中的增殖和释放能力,以期提高自体MenSCs移植治疗IUA的移植效率,从而提高IUA所致薄型子宫内膜患者干细胞移植的成功率。目的1.构建一种稳定、高效、可重复的IUA所致薄型子宫内膜患者MenSCs的分离培养体系,为干细胞移植治疗奠定基础。2.以MenSCs为种子细胞,温敏性水凝胶为支架制备细胞支架复合物,以期增加干细胞移植的成功率,从而提高IUA所致薄型子宫内膜患者的生育能力。方法1.将收集的月经血分别使用过滤法、全月经血培养法和密度梯度离心法分离MenSCs,观察细胞生长形态和细胞克隆的情况,确定MenSCs最佳的分离方法。并通过流式细胞仪检测干细胞表面标志物表达情况,体外成脂、成骨和成软骨分化实验来检测分离的细胞的多向分化潜能。2.利用紫外照射法、过滤法和高压蒸汽灭菌法对PLGA-PEG-PLGA水凝胶或共聚物除菌,确定除菌方式。通过除菌前后共聚物的结构、溶解时间、水凝胶的成胶温度的测定及体外降解实验分析除菌对水凝胶性能的影响。3.分别采用液体交换法和酸碱中和法对水凝胶进行改良,通过改良前后水凝胶中石蕊指示剂颜色变化、PH值、相变温度、渗透压评估改良方法对温敏性水凝胶性能的影响,从而选择合适的改良方法。***与PLGA-PEG-PLGA水凝胶按一定比例混合,通过活死细胞染色鉴定、流式细胞术和PI染色评估改良前后及改良后不同浓度水凝胶对MenSCs的细胞毒性。利用免疫荧光染色和发光检测法检测MenSCs在水凝胶中的增殖和扩散情况,评估MenSCs与PLGA-PEG-PLGA水凝胶构建细胞支架复合物的相容性。结果1.使用过滤法、全血培养法、密度梯度离心法均能分离长梭形、贴壁生长的MenSCs,其中过滤法培养的MenSCs细胞形态较为一致,并且细胞克隆团最多,是最佳的分离方法。流式细胞仪检测到分离的细胞高表达CD73、CD90和CD 105,不表达CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR。成脂诱导分化可见被油红O大量红染的脂滴,成骨诱导分化可见被茜红素染成橙色的钙盐,成软骨染色可见蓝染的蛋白,说明所培养的细胞具有间充质干细胞的特性。2.与紫外照射法和过滤法相比,高压蒸汽灭菌法具有可行性。高压蒸汽灭菌前后共聚物的结构未发生明显变化,溶解时间明显缩短,并且所配制的水凝胶均具有温敏特性,相变温度相似,有利于水凝胶的快速制备和下一步实验的应用。3.液体交换法和酸碱中和法均能使紫色石蕊指示剂变为蓝色。未改良、经液体交换改良与酸碱中和改良的水凝胶PH值分别为3.02±0.03、7.44±0.07、7.44±0.07。两种方法改良的水凝胶相变温度相近。经酸碱中和改良的7.5%、10%、15%、20%水凝胶的渗透压分别为 347.33±2.52、375±2.00、405±1.52、486.67±3.51 mOsmol/kg,而经液体交换法改良的水凝胶渗透压分别为310.33±2.51、315.33±1.15、314±1.00、315.67±0.58 mOsmol/kg。液体交换法改良的水凝胶因更加接近生理的PH值和渗透压,可用于后续的实验研究

关键词：经血源性间充质干细胞水凝胶聚丙交酯-乙交酯/聚乙二醇/聚丙交酯-乙交酯宫腔粘连薄型子宫内膜

脱细胞异种神经桥接体联合经血源性间充质干细胞对大鼠坐骨神经缺损的影响

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神经解剖学杂志 2020年第2期36卷 175-181页

作者：王红燕王贺颖梁雪云贾桦段昉张博闻仇莽莽何仲义宁夏医科大学基础医学院人体解剂与组织胚胎学系银川750004 宁夏医科大学总医院精子库银川750004 宁夏医科大学总医院干细胞研究所银川750004 宁夏医科大学附属银川市妇幼保健医院银川750004 宁夏医科大学附属自治区人民医院银川750004

目的:研究脱细胞异种神经桥接体(ANX)联合经血源性间充质干细胞(MenSCs)对大鼠坐骨神经缺损的影响。方法:将SD大鼠随机分为自体移植组、单纯ANX组和ANX+MenSCs共培养组,制备SD大鼠右侧坐骨神经缺损模型,将不同组的桥接体移植到SD大鼠右... 详细信息

目的:研究脱细胞异种神经桥接体(ANX)联合经血源性间充质干细胞(MenSCs)对大鼠坐骨神经缺损的影响。方法:将SD大鼠随机分为自体移植组、单纯ANX组和ANX+MenSCs共培养组,制备SD大鼠右侧坐骨神经缺损模型,将不同组的桥接体移植到SD大鼠右侧坐骨神经缺损处,移植术后8周,用热板实验检测大鼠感觉功能的恢复,斜坡实验来检测运动功能的恢复,通过坐骨神经功能指数(SFI)检测大鼠坐骨神经功能,通过胫骨前肌湿重比率检测神经肌肉的功能,用透射电镜来观察髓鞘的恢复情况。结果:扫描电镜显示ANX组内原有的细胞及结构基本去除,完整保留了神经的基膜及外膜,ANX+MenSCs组可见圆形的细胞在基膜间稳定黏附生长;免疫荧光染色显示神经生长因子(NGF)在ANX+MenSCs共培养组中有阳性表达;移植术后8周,ANX+MenSCs组的患肢回缩时间显著短于单纯ANX组(P0.05),但自体组的SFI值显著增高(P细胞治疗的潜在候选种子细胞。

关键词：经血源性间充质干细胞脱细胞异种神经桥接体共培养体系坐骨神经缺损修复大鼠

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经血源性间充质干细胞的研究进展

中华肺部疾病杂志（电子版） 2016年第4期9卷 430-433页

作者：贾方萍丁浩王剑江苏大学附属第一人民医院呼吸科镇江212002

经血源性间充质干细胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenS Cs）是近年来发现的新型间充质干细胞,研究表明MenS Cs具有与其他组织来源的间充质干细胞相似的功能特性,由于其比较容易获取,因此在科研中日益成为研究热... 详细信息

经血源性间充质干细胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenS Cs）是近年来发现的新型间充质干细胞,研究表明MenS Cs具有与其他组织来源的间充质干细胞相似的功能特性,由于其比较容易获取,因此在科研中日益成为研究热点。现对MenS Cs目前在科研中的研究进展做一综述。一、

关键词：经血源性间充质干细胞支气管肺癌肺部疾病

氯化锂对经血源性间充质干细胞增殖和神经分化的影响

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郑州大学学报（医学版） 2015年第2期50卷 153-157页

作者：周云帆马珊珊孟楠王梦然郭天宇杨波关方霞郑州大学生命科学学院郑州450001 河南农业职业学院现代农业工程系郑州451450 郑州大学第一附属医院郑州450052 华东师范大学生命科学学院上海200241 中山大学生命科学学院广州510275

目的:探讨Wnt/β-catenin通路激活剂氯化锂(Li Cl)对经血源性间充质干细胞(MMCs)增殖和神经分化的影响。方法:CCK-8法检测不同浓度(0、4、10、20、40 mmol/L)Li Cl作用4 d对MMCs增殖的影响,采用半定量PCR和Western blot法检测4 mmol/L L... 详细信息

目的:探讨Wnt/β-catenin通路激活剂氯化锂(Li Cl)对经血源性间充质干细胞(MMCs)增殖和神经分化的影响。方法:CCK-8法检测不同浓度(0、4、10、20、40 mmol/L)Li Cl作用4 d对MMCs增殖的影响,采用半定量PCR和Western blot法检测4 mmol/L Li Cl对MMCs中β-catenin表达的影响;采用免疫细胞化学检测对照组、诱导分化组(DMSO和β-ME联合诱导分化)和4 mmol/L Li Cl诱导组细胞中NF和NSE阳性细胞率,采用半定量PCR检测NF和NSE在转录水平的表达。结果:低浓度(4、10 mmol/L)Li Cl促进MMCs增殖,高浓度(20、40 mmol/L)Li Cl抑制MMCs增殖。与对照组相比,4 mmol/L Li Cl处理可增加β-catenin蛋白的表达水平(t=64.500,P细胞中NF和NSE mRNA的表达水平及蛋白的阳性表达率升高(P性表达率降低(P<0.05)。结论:4 mmol/L Li Cl可通过增强β-catenin蛋白的表达激活Wnt/β-catenin信号通路,促进MMCs的增殖;而在诱导分化过程中,Li Cl通过抑制NF和NSE在转录和蛋白水平的表达抑制MMCs向神经元分化。

关键词：氯化锂经血源性间充质干细胞 β-catenin 增殖分化

聚三亚甲基碳酸酯负载经血源性间充质干细胞对大鼠跟腱缺损修复的研究

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聚三亚甲基碳酸酯负载经血源性间充质干细胞对大鼠跟腱缺损修复的...

作者：李炜沈阳体育学院

学位级别：硕士

研究目的:使用溶液浇铸法制备聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)薄膜并用纤维连接蛋白(FN)进行表面修饰。将经血源性间充质干细胞(Men SCs)种植到PTMC/FN膜后用于SD大鼠跟腱缺损的修复。通过对跟腱大体、炎症水平、组织病理及免疫组化的结果进行... 详细信息

研究目的:使用溶液浇铸法制备聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)薄膜并用纤维连接蛋白(FN)进行表面修饰。将经血源性间充质干细胞(Men SCs)种植到PTMC/FN膜后用于SD大鼠跟腱缺损的修复。通过对跟腱大体、炎症水平、组织病理及免疫组化的结果进行分析以评价不同干预方式对SD大鼠跟腱缺损的修复作用。研究方法:1.使用差示扫描量热仪、热重分析仪、傅里叶变换红外光谱仪、分光光度计、水接触角分析仪和万能拉力测试机检测PTMC或PTMC/FN膜的玻璃化转变温度(Tg)、热分解温度(Td)、红外光谱、FN含量、亲疏水性和力学性能。2.采用黏附实验、细胞形态学观察、PKH26染色、细胞周期实验、划痕实验及MTT法检测PTMC/FN膜对Men SCs黏附、形态、增殖、周期、迁移及细胞毒性的影响。3.使用脂肪酶溶液进行材料的体外降解实验。通过宏观形貌、微观形貌、失重率、降解速率常数(k)、厚度损失、吸水率及酶溶液的p H值表征PTMC、PTMC/FN和PTMC/FN/Men SCs膜的降解情况。4.将30只健康雄性10w龄SD大鼠随机分为对照组(C组)、未干预组(N组)、PTMC/FN组(PF组)、Men SCs组(M组)和PTMC/FN/Men SCs组(PM组),每组6只。2%戊巴比妥钠麻醉大鼠后在其左右后肢跟腱的中部制作约5×2mm的缺损区。N组清创后直接缝合。PF组大鼠损伤部位清创后将PTMC/FN膜包裹在跟腱缺损处。将Br DU标记的Men SCs消化、重悬、计数后注射到M组大鼠跟腱缺损部位。将长满Men SCs的PTMC/FN膜包裹在PM组跟腱缺损处。使用医用缝合针及线对伤口进行缝合。在大鼠损伤部位依次包裹碘伏纱布和石膏纱布。动物模型建立及干预完成后定期取血以用于炎症相关因子IL-10和TNF-α的分析。分别于2w、4w取跟腱组织固定,石蜡包埋跟腱,切片后进行HE、COLⅠ和COLⅢ染色。5.通过宏观形貌、微观形貌、失重率、降解速率常数(k)、厚度损失、吸水率表征PTMC/FN和PTMC/FN/Men SCs膜在体内的降解情况。研究结果:***的Tg为-16.5℃,Td为239.5℃。FN吸附到PTMC表面,但含量略低于理论值。FN对PTMC膜的亲疏水性及力学性能没有影响。2.生物扫描电镜结果表明Men SCs在PTMC/FN膜上具有较好的细胞形态。黏附率的实验结果显示PTMC/FN组干细胞的黏附率最高,与对照组(P细胞周期结果显示负载FN的PTMC膜可正向调控Men SCs的周期。细胞增殖结果表明PTMC/FN膜培养Men SCs 3天后的细胞数量最多,与对照组(P细胞示踪结果表明Men SCs可在跟腱内存活4w。跟腱宏观评价结果显示3种干预方式均有利于跟腱缺损的修复,其中PTMC/FN/Men SCs膜的修复效果最显著。Men SCs可显著改善跟腱损伤后的炎症反应,优化胶原纤维的排列,促进COLⅠ和COLⅢ的表达。PTMC/FN与Men SCs的联合运用加强了这一作用,更有利于跟腱缺损后的恢复。5.体内降解结果表明,PTMC/FN和PTMC/FN/Men SCs膜在跟腱部位仍具有较好的降解性能。与体外酶解实验结果一致,PTMC/FN/Men SCs膜的降解程度要大于PTMC/FN膜。研究结论:***上的FN载量低于理论值。FN对PTMC的亲疏水性、力学等性能没有影响。***对Men SCs无毒副作用。在此基础上,FN修饰的PTMC膜可促进Men SCs的黏附、增殖和迁移等。***和Men SCs均可影响PTMC的体内和体外降解速率。PTMC/FN/Men SCs膜的体内及体外降解速率明显高于PTMC/FN膜。***/FN、Men SCs和PTMC/FN/Men SCs膜均可促进跟腱缺损的修复,PTMC/FN/Men SCs膜的作用效果最显著。

关键词：经血源性间充质干细胞聚三亚甲基碳酸酯纤维连接蛋白跟腱缺损

ANX联合经血源性间充质干细胞对大鼠坐骨神经缺损的影响

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ANX联合经血源性间充质干细胞对大鼠坐骨神经缺损的影响

作者：王贺颖宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的探究ANX联合MenSCs对于SD大鼠坐骨神经缺损的影响。方法1.用Percoll分层液分离培养原代MenSCs,CCK-8法检测P6代细胞的增殖情况,流式细胞术鉴定细胞表面标志物;2.化学萃取法制备新西兰大白兔胫神经来源的ANX,用HE染色后光镜观察ANX... 详细信息

目的探究ANX联合MenSCs对于SD大鼠坐骨神经缺损的影响。方法1.用Percoll分层液分离培养原代MenSCs,CCK-8法检测P6代细胞的增殖情况,流式细胞术鉴定细胞表面标志物;2.化学萃取法制备新西兰大白兔胫神经来源的ANX,用HE染色后光镜观察ANX脱细胞情况;3.将P6代的MenSCs悬液用微量注射器注入ANX后共培养4d,透射电镜观察组织学情况,用免疫荧光法检测共培养体系分泌神经生长因子(NGF)和神经营养因子-3(NT3)的情况;4.制备SD大鼠右侧坐骨神经缺损模型,随机分为自体移植组、单纯ANX组和ANX+MenSCs共培养组,将不同组的支架移植到SD大鼠右侧坐骨神经缺损处;5.移植术后在4w和8w两个不同的时间点,用热板实验、斜坡实验来检测大鼠感觉、运动功能的恢复,通过胫骨前肌湿重比率、和坐骨神经指数(SFI)来检测大鼠神经肌肉功能,甲苯胺蓝染色定位,透射电镜观察髓鞘的恢复情况。结果1.绘制细胞增殖生长曲线显示MenSCs在第3天时增长迅速,细胞活性较强;2.流式细胞仪鉴定MenSCs表达CD90和CD73,不表达CD34和HLA-DR;***染色结果显示化学萃取法去除了ANX内的髓鞘及细胞结构,外膜结构完整;4.扫描电镜结果显示ANX组可见基膜结构,ANX和MenSCs共培养体系可见椭圆形的MenSCs在基膜间黏附生长;***内不表达NGF、NT3,ANX与MenSCs共培养体系内阳性表达NGF、NT3;6.移植术后4w实验结果显示,ANX+MenSCs组的患肢回缩时间优于单纯ANX组,且具有统计学意义(P0.05),在数值上自体组优于其他两组,而ANX+MenSCs组又优于ANX组,自体移植组的SFI值和胫骨前肌湿重比率都优于ANX+MenSCs组和ANX组,且具有统计学意义(P0.05),但自体组的SFI值显著增高(P性良好,共培养体系分泌出NGF和NT3,ANX和MenSCs共培养体系可以作为SD大鼠坐骨神经的缺损和修复实验理想的连接体且其修复效果良好。

关键词：经血源性间充质干细胞脱细胞异种神经桥接体桥接体移植坐骨神经损伤