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大肠杆菌tRNA与终止密码子重设计及其应用研究

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大肠杆菌tRNA与终止密码子重设计及其应用研究

作者：廖丹妮天津大学

学位级别：硕士

合成生物学是生命科学界的重大突破,促进了基因元件的挖掘及基因线路的重设计。tRNA作为生命中心法则中翻译过程的重要参与元件,其种类、丰度都会对蛋白质的正常合成产生巨大影响。近年来受到微生物tRNA的结构功能以及合成修饰过程的诸... 详细信息

合成生物学是生命科学界的重大突破,促进了基因元件的挖掘及基因线路的重设计。tRNA作为生命中心法则中翻译过程的重要参与元件,其种类、丰度都会对蛋白质的正常合成产生巨大影响。近年来受到微生物tRNA的结构功能以及合成修饰过程的诸多启发,密码子扩展的相关研究取得重大进展,实现了将非天然氨基酸引入特定位置从而获得新功能蛋白的愿景。同时,基于化学合成微生物基因组开展的密码子重编码工作也将释放更多的密码子与tRNA用于更加广泛的密码子扩展研究。本课题以提升合成生物学中tRNA相关深度设计以及扩展终止密码子应用为目标,主要进行了下列相关工作:(1)为构建TAG-tRNA开关和TGA-tRNA开关,本课题首先对不同氨基酸对应的20种tRNA构建起阿拉伯糖诱导型的含TAG和TGA反密码子突变的tRNA质粒,并利用红色荧光蛋白通过荧光显微镜及流式细胞仪检测等手段进行定性定量表征,最终筛选出对TAG终止密码子响应强度高的五种突变tRNA,分别是甘氨酸(gly)、亮氨酸(leu)、组氨酸(his)、谷氨酰胺(gln)、精氨酸(arg)对应的tRNA;以及对TGA终止密码子响应强度高的一种突变tRNA,是精氨酸(arg)对应的tRNA。成功构建起了TAG-tRNA开关和TGA-tRNA开关,同时揭示了TAG与TGA终止密码子的扩展原理。(2)为进一步拓展终止密码子的应用范围,本课题尝试将TAG和TGA两种终止密码子联合使用。设计构建了串联和并联两种应用策略,并在大肠杆菌体内成功实现了TAG和TGA两种终止密码子的同时应用:即它们可以用于共同调控同一条生物代谢途径,也可以用于分别调控两条不同的代谢通路。这极大的拓展了终止密码子的功能,可用于在基因加密及生物防逃逸领域应用,丰富了本研究的应用前景。

关键词：合成生物学 tRNA 终止密码子密码子扩展

纤毛虫eRFl终止密码子识别特异性的功能结构域分析

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纤毛虫eRFl终止密码子识别特异性的功能结构域分析

作者：于竞飞山西大学

学位级别：硕士

当mRNA上的终止密码子UAA,UAG或者UGA到达核糖体的A位点时,被肽链释放因子识别,蛋白质翻译终止。真核生物中,有两类肽链释放因子参与翻译终止过程,分别为eRF1和eRF3,但具体的机制尚不完全确定。大多数高等真核生物eRF1能识别三个终止密... 详细信息

当mRNA上的终止密码子UAA,UAG或者UGA到达核糖体的A位点时,被肽链释放因子识别,蛋白质翻译终止。真核生物中,有两类肽链释放因子参与翻译终止过程,分别为eRF1和eRF3,但具体的机制尚不完全确定。大多数高等真核生物eRF1能识别三个终止密码子,而纤毛虫eRF1却只能识别三个终止密码子中的一个或两个,称为密码子识别特异性eRF1。研究显示第一类肽链释放因子的N结构域负责终止密码子的识别,其包含3个高度保守的模体结构域：GT区,TASNIKS区和YCF区,对eRF1识别终止密码子的活性有较大影响。纤毛虫eRF1识别终止密码子的特异性是否受到N端三个保守模体或其中关键氨基酸的调控,以及三个模体结构之间的关系是值得探讨的问题,结果有助于进一步阐明肽链释放因子识别终止密码子的分子机制。本实验首先构建了嗜热四膜虫（Tetrahymena） eRFlN端结构域与酵母的M、C端结构域组成的嵌合体eRFl（Tt/Sc eRFl）。利用双荧光素酶报告体系,在eRF1基因敲除的酵母细胞株中测定嵌合体Tt/Sc eRFl识别终止密码子的性质和活性,结果显示,Tt/Sc eRFl对终止密码的识别具有一定的特异性,即对UAA和UAG的通读效率明显高于UGA,与四膜虫eRF1的性质一致（对UGA、UAG、UAA的通读效率分别为2.49%、4.07%、10.12%）。为了分析eRF1中影响终止密码子识别性质的关键模体和氨基酸,我们通过定点突变的方法将嵌合体Tt/Sc eRFl的N结构域中保守模体的一些关键氨基酸,突变为酵母eRF1相应的氨基酸。结果显示,TASNIKS模体内的突变K57T/T59S/D63S使嵌合体eRF1对UGA.UAG通读效率比野生型分别提高了13.45%、1.84%,对UAA的通读效率降低了3.48%;YCF模体内的突变F125L/S128N使嵌合体eRF1对UGA的通读效率提高了3.04%,对UAG、UAA通读的效率分别降低了1.89%、6.72%,说明关键模体内氨基酸的改变对四膜虫eRF1识别终止密码子的性质产生了不同程度的影响,说明这些氨基酸可能通过影响模体的结构改变了eRF1对密码子的识别活性。为了分析保守的模体结构或模体间的协同作用对eRF1性质的决定作用。我们进一步利用搭桥PCR的方法将原生动物蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lambiia）和嗜热四膜虫eRF1中保守模体及其相邻区域的氨基酸分别引入酵母eRF1中,构建成由不同模体组合而成的杂合N端嵌合体,以此探究eRF1的N端区域中关键模体对eRF1识别终止密码子特异性的影响。构建的贾第虫与酵母eRF1杂合的N端嵌合体为G1（1-84aa）/Sc（76-149aa）-N 和 Sc（1-75aa）/G1（85-157aa）-N;四膜虫与酵母eRF1的N端嵌合体为Tt（1-77aa）/Sc（76-149aa）-N、Sc（1-75aa）/Tt（78-151aa）-N;Sc（1-38aa）/Tt（41-77aa）/Sc（76-149aa）-N、Tt（1-40aa）/Sc（39-75aa） /Tt（78-151aa）-N。其中1-40aa包含GTx模体,41-77aa包含TASNIKS模体;78-151aa包含Y-C-F模体。同时,对N端结构域嵌合体中的一些关键的氨基酸位点进行突变,构建成N端嵌合体的突变体。将上述N端嵌合体及其突变体基因亚克隆至酵母表达载体pDB0948中。转化第一类肽链释放因子基因敲除的酵母菌株YDB447、利用双荧光素酶报告系统和质粒洗牌技术,分析了这些不同的N端结构域嵌合体eRFl识别终止密码子的性质。结果显示,G1/Sc-N对UGA、UAG通读效率分别提高了12.80%、0.81%,而对UAA的通读效率降低了3.54%;Sc/G1-N对UGA、UAG、UAA的通读效率较野生型分别降低了3.03%、2.92%、5.69%。贾第虫的eRF1的N端结构域中引入TASNIKS模体,Sc/G1-N对于eRF1识别三个终止密码子的效率都有所提高,而引入Y-C-F模体,G1/Sc-N对于终止密码子中第二位碱基的识别有所影响。引入四膜虫eRF1的模体,Tt/Sc-N eRF1对于三个终止密码子UGA、UAG和UAA的通读效率很高,分别达到了26.39%、8.02%、10.75%,不能识别终止密码子;Sc/Tt-N eRF1对三个终止密码子的通读效率都相对较低,分别为3.97%、2.09%、3.20%,即能够同时识别三个终止密码子,由此推测GTx和NIKS模体可能决定eRF1对UAG和UAA的识别。综上结果表明,四膜虫N端结构域中GTx和NIKS模体一定程度决定eRF1识别终止密码子第一位碱基U和第二位碱基A;Y-C-F模体决定eRF1识别终止密码子UGA的第二位碱基G。本研究结果为揭示肽链释放因子识别终止密码子的分子机制提供了重要的数据支持。

关键词： eRF1 N端嵌合体贾第虫四膜虫终止密码子

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肽链释放因子识别终止密码子的机制

中国生物化学与分子生物学报 2010年第1期26卷 22-29页

作者：王艳柴宝峰梁爱华化学生物学和分子工程教育部重点实验室山西大学生物技术研究所太原030006

肽链释放因子(polypeptide release factor,RF)是参与细胞内蛋白质合成终止过程中新生肽链释放的一组重要的蛋白质,包括两类,即第一类肽链释放因子(classⅠrelease factor,RFⅠ)和第二类肽链释放因子(classⅡrelease factor,RFⅡ).关于... 详细信息

肽链释放因子(polypeptide release factor,RF)是参与细胞内蛋白质合成终止过程中新生肽链释放的一组重要的蛋白质,包括两类,即第一类肽链释放因子(classⅠrelease factor,RFⅠ)和第二类肽链释放因子(classⅡrelease factor,RFⅡ).关于第一类肽链释放因子识别终止密码子的机制和功能位点是目前分子细胞生物学领域的一个研究热点,第二类肽链释放因子作为一类GTP酶,在第一类肽链释放因子识别终止密码子和肽链释放过程中的协同作用也备受关注.近些年来,通过构建体内和体外的测活体系,对第一类肽链释放因子识别终止密码子的机制的研究取得了一些进展,提出了多种假说和模型,尤其是对第一类肽链释放因子的晶体结构及两类肽链释放因子复合体的空间结构的研究,为揭示真核生物细胞内蛋白质合成终止机制提供了直接的证据.

关键词：肽链释放因子终止密码子识别机制 eRF1/eRF3/GTP复合体

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贾第虫GeRF1识别终止密码子性质分析

贾第虫GeRF1识别终止密码子性质分析

作者：杨睿山西大学

学位级别：硕士

蛋白质合成是细胞内最重要的生命活动之一,其中包括RNA-RNA,RNA-蛋白质和蛋白质之间的相互作用。这一过程包括核糖体上肽链合成的起始、延伸和新生肽链的释放。肽链的起始和延伸主要有起始因子和延伸因子的参与,而两类肽链释放因子（pol... 详细信息

蛋白质合成是细胞内最重要的生命活动之一,其中包括RNA-RNA,RNA-蛋白质和蛋白质之间的相互作用。这一过程包括核糖体上肽链合成的起始、延伸和新生肽链的释放。肽链的起始和延伸主要有起始因子和延伸因子的参与,而两类肽链释放因子（polypeptide release factor, RF）负责终止密码子的识别和新生肽链的释放。在真核生物中第一类肽链释放因子（eRF1）一级结构的序列有显著的同源性,由N、M、C三个不同功能结构域组成。结构域N在核糖体A位点识别三个终止密码子,它含有两个高度保守的序列TASNIKS和Y×C×××F。结构域M通常含有GGQ模体,与核糖体上的肽酰转移酶中心相互作用引起肽酰-tRNA的水解。eRF1的C结构域与eRF3相互作用。eRF3是一种G蛋白,其C端结构域负责与eRF1结合,在核糖体外形成稳定的复合体,参与新生肽链从核糖体上的释放,共同完成蛋白质多肽链的合成过程。高等真核生物第一类肽链释放因子识别三个通用的终止密码子,完成新生肽链的释放。在原生动物纤毛虫中终止密码子发生重新分配的现象,如Paramecium、Tetrahymena和Stylonychia将通用终止密码子UAA和UAG翻译成谷氨酸酰胺,将UGA识别为终止密码。Euplotes中UAA和UAG作为终止密码子,而通用终止密码子UGA翻译成半胱氨酸。这种现象提示我们,肽链释放因子识别终止密码子的活性和性质可能具有一定的进化学特征。蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia）为鞭毛类单细胞真核生物,是原生动物中最为原始的一个类群。细胞内没有典型的线粒体结构,认为是在线粒体形成之前产生的物种。其肽链释放因子的结构与进化程度较高的纤毛虫和高等真核生物相比具有明显的差异,为我们研究蛋白质合成终止机制的进化提供了理想了模式。本研究以蓝氏贾第鞭毛虫为材料,从基因组扩增得到了其两类肽链释放因子基因GeRF1和GeRF3。将它们分别连接到酵母表达载体pGADT7和pGBKT7中,共转化酵母菌株AH109,涂板培养。利用酵母双杂交技术证实贾第虫eRF1和eRF3在体内相互作用,说明在贾第虫中两类肽链释放因子通过协同作用参与蛋白质合成的终止过程。以往的研究表明,第一类肽链释放因子的N端结构域负责终止密码子的识别,故我们构建了由贾第虫eRF1的N端结构域与酿酒酵母的M和c端结构域组成的重组基因Gl／Sc eRF1。在第一类肽链释放因子被敲除的酵母菌株YDB447中分析贾第虫第一类肽链释放因子识别终止密码子的性质和活性。首先,将构建的Gl／Sc eRF1基因克隆至酵母表达质粒pDB984中,利用5’-FOA驱除含有酵母野生型eRF1基因的质粒,观察在重组质粒表达的融合蛋白Gl／Sc eRF1作为细胞中唯一肽链释放因子的情况下酵母细胞的活力,分析融合蛋白Gl／Sc eRF1识别终止密码子的活性和性质。结果显示,含有该融合蛋白的酵母细胞不能正常的生长,说明Gl／Sc eRF1在酵母细胞中不能识别终止密码子。进一步用双荧光素酶通读报告系统分析融合蛋白Gl／Sc eRF1分别对三个终止密码子的识别活性。证实融合的Gl／Sc eRF1不能识别三个终止密码子。对GeRF1的N端结构域中关键的氨基酸进行突变（T26L,G48K,N112E T113N,S134N）,使其与酵母相应位点的氨基酸一致。结果表明尽管突变体Gl／Sc eRF1识别三个终止密码子的活性发生了一些变化,但是与野生型相比,其识别活性不足以维持细胞的正常生存。尽管其他高等真核生物的第一类肽链释放因子的N端负责识别三个终止密码子,但在贾第虫细胞中除此之外,可能还有其它的因子诸如第一类肽链释放因子的M和C端结构域,甚至第二类肽链释放因子和其他因子对GeRF1识别终止密码子起到决定性作用。

关键词： G.lamblia 蛋白质合成终止肽链释放因子终止密码子通读活性

第一类肽链释放因子识别遗传密码子的分子机制

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第一类肽链释放因子识别遗传密码子的分子机制

作者：徐丽君山西大学

学位级别：硕士

在真核生物细胞内蛋白质的翻译终止过程中,有两类肽链释放因子参与,分别为eRF1和eRF3。eRFl识别UAA、UAG和UGA三个终止密码子,而eRF3是一类依赖于核糖体和第一类肽链释放因子的GTPase,协同eRFl促进肽链从核糖体上释放。大部分高等真核... 详细信息

在真核生物细胞内蛋白质的翻译终止过程中,有两类肽链释放因子参与,分别为eRF1和eRF3。eRFl识别UAA、UAG和UGA三个终止密码子,而eRF3是一类依赖于核糖体和第一类肽链释放因子的GTPase,协同eRFl促进肽链从核糖体上释放。大部分高等真核生物的eRFl识别UAA,UAG和UGA三个终止密码子。而在纤毛虫细胞中却发生密码子重新分配的现象,一个或两个终止密码子不被eRFl识别,而被阻抑性tRNA识别,成为有义密码子。 eRF1识别终止密码子的模型目前主要有“线性模型”和"Cavity模型”。线性模型认为eRF1的N端的TASNIKS结构域与终止密码子直接相互作用,而’Cavity’模型认为eRF1的N端包含的三个口袋形模体结构,分别识别终止密码子的三个碱基。近年来,用生物进化学和生物化学等技术和方法验证了’Cavity’模型,Kisselev和同事研究了eRF1的N端的一些氨基酸残基,这些氨基酸位点在高等真核生物中都是保守的,而在纤毛虫中不同。由此推测,N端口袋模体周围的一些氨基酸可能与终止密码子的识别和模体构象的维持有关。先前的研究显示真核生物eRFl的N端在终止密码子识别中起到主要作用,说明eRF1的N端决定了终止密码子的识别特异性。并且在不同的纤毛虫中有着不同的密码子识别模式。因此,在这些物种中,eRF1的N端的一些残基被认为与密码子的重新分配有关。首先,本实验构建了两个杂合的eRF1,将八肋游仆虫eRF1b （Eo-eRF1b）或日本赭纤虫eRE1（Bj-eRF1）的N端和酵母的M端和C端,构建成相应的Eo/Sc eRF1b和Bj/Sc eRF1杂合基因。由于N端主要负责终止密码子的识别,因此利用定点突变的方法将N端的一些关键的氨基酸残基进行突变,构建了一系列eRF1的突变体,以分析Eo-eRF1和Bj-eRF1识别终止密码子的活性和性质。然后,分析了两种eRF1识别密码子的性质。利用质粒洗牌技术来评估野生型和突变体Bj/Sc eRF1和Eo/Sc eRF1b能否支持酵母细胞的生长。实验结果显示Bj/SceRF1在30℃和22℃生长,在37℃是微弱的生长,说明Bj-eRF1在酵母细胞中呈现温度敏感的表型。且大多数含有Bj/Sc eRF1s突变体的酵母细胞YDB447能够生长。而Eo/Sc eRF1b不能够支持细胞的生长。接下来,进一步分析了两种eRF1识别密码子的活性。通过更换糖源敲减酵母菌株YDB447细胞内携带的野生型酵母eRF1基因（Gal启动子）的表达,同时提高杂合eRF1基因（SUP45启动子）及其突变体在细胞中的相对表达量,利用双荧光素酶报告系统来研究赭纤虫eRF1和游仆虫eRFlb及其突变体识别终止密码子的活性,从而确定eRF1在终止密码子识别过程中起关键作用的氨基酸。实验结果和先前报道的结果具有一定的一致性,eRF1的N端三个口袋模体对终止密码子的三个碱基的识别起重要作用。本实验的研究结果显示,在识别终止密码子过程中对三个口袋周围的一些氨基酸残基的功能进行了重新划分。口袋表面的亲水性氨基酸残基可能直接或间接与终止密码子的碱基相互作用,而内部疏水性氨基酸残基可能仅决定三个口袋模体的构象和相对位置。eRF1中绝对保守的氨基酸残基决定识别终止密码子的3个碱基所对应的三个口袋模体结构的方向。根据本研究的实验结果和先前的数据,推测eRF1的口袋3由G31,T32,V66,N67,S70和V71残基组成,决定了eRFl对终止密码子的第3位碱基的识别。这些残基的改变显著的影响了终止密码子的识别,说明这些氨基酸组成的模体结构决定着终止密码子第三位A或G的识别。口袋2是由L126、C127、D128、H132和底部的V110构成,D128或H132可能负责识别终止密码子的第二个碱基。D128识别终止密码子的碱基（第二位）A-N6,而C127参与调控碱基的识别过程。H132负责第二个碱基G的识别,而且受L126的调控。口袋1凹陷位置的疏水氨基酸包括L37,139,V48和L82,周围是由α2螺旋的R47,V48,M51和β4片层的S123,L124和Y125组成。S123可能与U-O：之间相互作用,决定终止密码子第一位碱基的识别。综上所述,对于纤毛虫eRF1突变体识别终止密码子活性的定量分析结果显示,eRF1的识别密码子的特异性可能并不是仅仅由一些特定的氨基酸残基来决定的,很可能还有一些其它因子的参与,决定纤毛虫中终止密码子重新分配的机制。 Betram明确提出eRF1是识别UAA, UAG和UGA,并且不识别编码有义密码子色氨酸的UGG。从理论上来讲,eRF1能够识别UGG,然而,在细胞中色氨酸tRNA的反密码子CCA优先与UGG密码子结合,导致eRF1没有机会与UGG结合。相似的,在纤毛虫中有抑制性tRNA的存在,例如游仆虫中存在识别UGA的tRNA

关键词：八肋游仆虫日本赭纤虫释放因子 eRF1 终止密码子

黑腹果蝇蛋白质编码区碱基分布与起始密码子及终止密码子的关系

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内蒙古科技大学学报 2007年第4期26卷 341-344页

作者：蔡禄崔向军刘辉内蒙古科技大学生物与化学工程学院内蒙古包头014010

对黑腹果蝇染色体上基因组进行统计分析,结果表明,蛋白质编码区(CDS)碱基分布具有不均匀性.对单核苷酸、双核苷酸及密码子的使用进行统计,结果表明,与起始密码子对应的组分中,NTG的使用倾向值相对高,终止密码子(TGA,TAA,TAG)对应的组合... 详细信息

对黑腹果蝇染色体上基因组进行统计分析,结果表明,蛋白质编码区(CDS)碱基分布具有不均匀性.对单核苷酸、双核苷酸及密码子的使用进行统计,结果表明,与起始密码子对应的组分中,NTG的使用倾向值相对高,终止密码子(TGA,TAA,TAG)对应的组合使用倾向值相对很低.由此得出结论:起如密码子对蛋白质编码区碱基的使用有一定的影响,终止密码子对蛋白质编码区碱基的使用具有较强限制作用.

关键词：起始密码子终止密码子碱基分布黑腥果蝇限制作用

RNASEH2C基因复合杂合变异所致艾卡迪综合征3型患儿1例的临床及遗传学分析

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中华医学遗传学杂志 2023年第1期40卷 81-86页

作者：刘娟胡继红覃蓉段雅琴周洪涛熊裕娟湖南省儿童医院康复科长沙410007

目的探讨1例RNASEH2C基因变异所致Aicardi-Goutières综合征3型(AGS 3)患儿的临床特征与遗传学病因。方法选取2021年3月27日于湖南省儿童医院就诊的1例AGS3患儿为研究对象。对患儿及其父母进行家系全外显子组测序,并利用Sanger测序对候... 详细信息

目的探讨1例RNASEH2C基因变异所致Aicardi-Goutières综合征3型(AGS 3)患儿的临床特征与遗传学病因。方法选取2021年3月27日于湖南省儿童医院就诊的1例AGS3患儿为研究对象。对患儿及其父母进行家系全外显子组测序,并利用Sanger测序对候选变异进行验证。对变异进行晶体结构模拟分析,并构建质粒进行蛋白表达。通过检索文献,总结AGS 3型的表型与遗传学特点。结果患儿RNASEH2C基因存在复合杂合变异c.494G>C(p.Ter165Ser)(父源)与c.434G>T(p.Arg145Leu)(母源),既往均未见报道。蛋白结构预测分析c.434G>T(p.Arg145Leu)变异可能破坏局部结构的稳定性,体外功能实验表明该变异将导致蛋白表达降低。c.494G>C(p.Ter165Ser)变异破坏了终止密码子,导致蛋白产物延长。结论本研究发现了两个RNASEH2C基因的新变异,进一步丰富了AGS 3型的表型与变异谱。

关键词： Aicardi-Goutières综合征3型 RNASEH2C基因终止密码子新变异

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真核基因起始与终止密码子旁侧序列特征分析

生物信息学 2004年第4期2卷 10-14页

作者：翁景然张宏耿美英张成岗军事医学科学院放射医学研究所北京100850 北京工业大学应用数理学院北京100022

真核基因起始与终止密码子旁侧序列的特征对于确定cDNA开放阅读框架 (ORF)和预测基因组序列中的编码区 (CDS)非常重要。基于高质量RefSeq数据库 ,在较大数据规模下统计分析了起始密码子旁侧序列所具有的“Kozak规则” ,发现不同物种之... 详细信息

真核基因起始与终止密码子旁侧序列的特征对于确定cDNA开放阅读框架 (ORF)和预测基因组序列中的编码区 (CDS)非常重要。基于高质量RefSeq数据库 ,在较大数据规模下统计分析了起始密码子旁侧序列所具有的“Kozak规则” ,发现不同物种之间存在差别。同时分析了不同终止密码子旁侧序列的统计学特征 ,给出了相应的正则表达式。由于发现多种基因中存在同相位起始、终止密码子串联使用的情况 ,亦对此进行了讨论。

关键词：真核基因 cDNA序列起始密码子终止密码子序列特征 Kozak规则

中国大陆新发现丙型肝炎病毒3′非编码区终止密码子变异

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肝脏 2005年第4期10卷 265-267页

作者：秦兆习丛旭蒋栋哈明昊魏来徐州市中心医院感染科 221009 北京大学肝病研究所

目的获得全长中国大陆1b型丙型肝炎病毒(HCV)3′非编码区(3′UTR)cDNA,并分析一级结构的变异,为进一步研究其在HCV复制、翻译中的调控机制和开发新的抗HCV药物奠定基础。方法利用逆转录套式聚合酶链反应(RT-PCR)限制性内切酶长度多态性... 详细信息

目的获得全长中国大陆1b型丙型肝炎病毒(HCV)3′非编码区(3′UTR)cDNA,并分析一级结构的变异,为进一步研究其在HCV复制、翻译中的调控机制和开发新的抗HCV药物奠定基础。方法利用逆转录套式聚合酶链反应(RT-PCR)限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)初步筛选出1例1b型HCV感染者,采用半套式RT-PCR法扩增出约400bp的cDNA片段,克隆测序。结果获得的全长1b型HCV3′端序列,由高变区、Poly(u)区、Poly(u/c)区及98碱基区4部分组成;首次发现终止密码子突变由TGA突变为TGG,可导致NS5B的翻译不能及时终止。结论半套式RT-PCR法可有效获得病毒基因组的全长末端序列;首次报道终止密码子突变导致NS5B区延长,3′UTR缩短。该发现对了解HCV的复制和翻译机制可能有一定的理论和实践意义。

关键词：丙型肝炎病毒 3′非编码区终止密码子