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细菌铁蛋白释放铁的动力学研究

生物物理学报 1996年第1期12卷 33-38页

作者：黄河清张凤章陈灿和邱雪慧许良树曾定厦门大学生物学系

棕色固氮菌细菌蛋白在可见光谱区中有定性的特征吸收峰。细菌铁蛋白经过量Ｎａ２Ｓ２Ｏ４还原后，该蛋白的α、β和Ｓ峰的吸光度随着蛋白还原程度增大而递增。细菌铁蛋白的氧化还原状态可分为氧化态、半还原态和深度还原态。细菌铁蛋白... 详细信息

棕色固氮菌细菌蛋白在可见光谱区中有定性的特征吸收峰。细菌铁蛋白经过量Ｎａ２Ｓ２Ｏ４还原后，该蛋白的α、β和Ｓ峰的吸光度随着蛋白还原程度增大而递增。细菌铁蛋白的氧化还原状态可分为氧化态、半还原态和深度还原态。细菌铁蛋白铁核中的磷铁组成存在着非均匀性，该蛋白释放铁核表层的铁的反应为一级反应，推测这一过程受蛋白壳中的血红素调控。细菌铁蛋白释放铁核内层的铁的反应为零级反应。

关键词：棕色固氮菌细菌铁蛋白铁释放动力学

细菌铁蛋白电子光谱和释放铁动力学的新颖特性

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厦门大学学报（自然科学版） 2006年第5期45卷 717-721页

作者：胡晓慧黄河清厦门大学生命科学学院生物化学与生物技术学系福建厦门361005

棕色固氮菌细菌铁蛋白(Bacterial ferritin ofAzotobacter vinelandii,AvBF)分子结构由蛋白壳、铁核和横跨蛋白壳的电子隧道组成.细菌铁蛋白由24个相同类型的亚基组成,其分子量略高于魟鱼肝铁蛋白(Liver ferritin ofDasyatis aka-jei,DA... 详细信息

棕色固氮菌细菌铁蛋白(Bacterial ferritin ofAzotobacter vinelandii,AvBF)分子结构由蛋白壳、铁核和横跨蛋白壳的电子隧道组成.细菌铁蛋白由24个相同类型的亚基组成,其分子量略高于魟鱼肝铁蛋白(Liver ferritin ofDasyatis aka-jei,DALF).电泳纯的AvBF在可见光谱区内呈现出4个特征吸收峰,波长分别位于414(α峰),525(β峰),555(S峰)和585(未知)nm.经Na2S2O4还原后,其AvBF在紫外可见区内的整体吸收峰强度明显增高.经物理铂金电极还原后,AvBF的α特征吸收峰(414 nm)强度随着控制还原电位降低(-200,-400,-600 mV vs NHE)而增强.动力学研究表明,在弱碱(pH8.0)条件下,AvBF和DALF均以二分之一级反应动力学方式释放铁,均未表现出释放铁速率转换行为,认为AvBF和DALF的释放铁速率和铁蛋白蛋白壳的柔性调节速率处于同步进行状态,使铁蛋白释放铁的过程符合二分之一级反应动力学规律.

关键词：细菌铁蛋白棕色固氮菌电子光谱释放铁动力学

棕色固氮菌突变种UW3部分提纯的固氮酶CrFe蛋白溶液中残存细菌铁蛋白的晶体生长及鉴定

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Acta Botanica Sinica 2004年第11期46卷 1331-1337页

作者：赵剑峰刘合力周会娜汪志平赵颖边少敏李树兴毕汝昌黄巨富中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室，北京100093 中国科学院生物物理研究所，北京100101 浙江大学原子核农业科学研究所，杭州310029

从无钼、无氨而含铬的固氮培养基中生长的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种UW3中纯化得到了部分纯的CrFe蛋白。在试图培养CrFe蛋白大晶体时发现，棕色晶体和砖红色晶体可同时或单独出现。SDSPAGE和厌氧天然PAGE皆表明... 详细信息

从无钼、无氨而含铬的固氮培养基中生长的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种UW3中纯化得到了部分纯的CrFe蛋白。在试图培养CrFe蛋白大晶体时发现，棕色晶体和砖红色晶体可同时或单独出现。SDSPAGE和厌氧天然PAGE皆表明，棕色晶体主要由与固氮酶钼铁蛋白(Avl)类似大小的亚基(～60kD)组成，而砖红色晶体则由～20kD亚基组成。免疫分析表明只有～60kD的亚基可与固氮酶钼铁蛋白的抗体反应，而～20kD亚基则无这种反应。在部分纯的CrFe蛋白溶液中，～20kD的总蛋白含量远低于～60kD蛋白的含量，表明由这种小亚基组成的蛋白只是CrFe蛋白溶液中的一种污染蛋白。用3，5-二氨基苯甲酸染色的天然电泳表明，形成砖红色和棕色晶体的蛋白是迁移率不同的两种含铁蛋白。质谱分析表明砖红色晶体蛋白为棕色固氮菌的细菌铁蛋白。分辨率为2．34A的X射线衍射结果也表明，砖红色晶体属于H3空间群，晶胞参数为a=124．965A^°，b=124．965A^°和c=287．406A^°。即将发表的三维结构解析表明，此砖红色晶体确为24聚体的细菌铁蛋白。

关键词：晶体生长及鉴定细菌铁蛋白部分纯铬铁蛋白棕色固氮菌突变种

根癌农杆菌细菌铁蛋白的体外组装及组装体稳定性研究

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根癌农杆菌细菌铁蛋白的体外组装及组装体稳定性研究

作者：高苗苗扬州大学

学位级别：硕士

铁是生物所必需的一种元素,作为蛋白的辅助因子参与生物体内多种重要的生理生化过程。缺铁会影响生长、代谢以及致病菌的毒力等,而铁过量会引发芬顿反应,对细胞造成氧化性损伤。铁蛋白能够利用O2或H2O2将二价铁氧化为三价铁存储在内腔中... 详细信息

铁是生物所必需的一种元素,作为蛋白的辅助因子参与生物体内多种重要的生理生化过程。缺铁会影响生长、代谢以及致病菌的毒力等,而铁过量会引发芬顿反应,对细胞造成氧化性损伤。铁蛋白能够利用O2或H2O2将二价铁氧化为三价铁存储在内腔中,细胞缺铁时,可以将存储的三价铁还原并释放,在维持细胞铁平衡方面有重要作用。铁蛋白还被认为是良好的纳米材料。铁蛋白为24/12个亚基聚合而成的中空球体,在体外具有良好的化学和热稳定性,可以通过改变环境条件控制其组装与去组装,并且能耐受对其外表面、内腔和亚基互作界面的修饰与改造等,在生物医药、化学和生物纳米技术等方面有巨大的应用潜力和价值。细菌中一般含有经典铁蛋白(Ftn)、细菌铁蛋白(Bfr)和饥饿细胞来源的DNA结合蛋白(Dps)三种铁蛋白,Ftn和Bfr为24聚体,Dps为12聚体。多数细菌中同时具有Ftn和Bfr或者2种Bfr,而根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中仅有1个Bfr(AtBfr)和1个Dps(AtDps)。而且与其他细菌中的Bfr不同,AtBfr在其N端多出8个氨基酸,其可能的影响或作用还不明确。在根癌农杆菌中,Bfr是主要的铁存储蛋白。铁蛋白的功能与结构关系紧密,研究根癌农杆菌铁蛋白的自组装为铁蛋白的应用提供了理论基础,对铁蛋白的功能和机制研究也有重要意义。本课题构建了根癌农杆菌铁蛋白的基因缺失株和回补株,鉴定了bfr基因的正确阅读框。纯化了多种根癌农杆菌重组铁蛋白,优化了铁蛋白的体外缓冲体系,研究了 AtBfr关键氨基酸对其组装与功能的影响,并探究了二价金属离子与血红素对其组装的影响。主要结果如下:(1)构建了根癌农杆菌铁蛋白的基因缺失株与回补株,利用三价铁特异性染色实验确定了根癌农杆菌bfr开放阅读框起始阅读密码子为AUG,编码169个氨基酸而非161个氨基酸。(2)利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)观察了不同缓冲液、pH以及盐浓度处理后的铁蛋白自组装情况以优化根癌农杆菌铁蛋白在体外的缓冲体系,发现AtDps能够在体外形成稳定的12聚体结构,而AtBfr处于24聚体与低聚体的混合态。其中AtBfr在含有50 mM NaCl的20 mM HEPES(pH8.2)缓冲液中具有最优的聚合状态。(3)利用差式荧光扫描和Native PAGE观察了分别带有N端和C端His标签的AtBfr重组蛋白在体外的聚合状态及结构稳定性。结果表明带有N端6× His标签的AtBfr仅能形成低聚体,而带有N端长His标签和C端6× His标签的AtBfr能形成24聚体,且热稳定性相似,但带有C端6× His标签AtBfr蛋白中24聚体的比例更高。(4)针对Bfr蛋白二聚体互作和24聚体互作的界面分别构建了 AtBfrM60L和AtBfrE74R两个点突变蛋白,利用圆二色光谱、透射电镜、差示荧光扫描法和Native PAGE研究了突变蛋白的结构与组装。结果表明这两个位点的氨基酸突变不影响Bfr的二级结构,但对其热稳定性和纳米笼的组装有显著影响。AtBfrM60L热稳定性降低,24聚体比例降低,并且形成的蛋白笼粒径更小;而AtBfrE74R的热稳定性略微上升,24聚体比例提高,形成的蛋白笼与野生型AtBfr相似,但整体粒径分布更加集中。(5)检测了不同二价金属离子对AtBfr的影响。通过差式荧光扫描观察了不同二价金属离子对AtBfr热稳定性的影响,结果显示Fe2+、Mg2+和Mn2+对WT-Bfr没有显著影响,但提高了AtBfrM60L和AtBfrE74R的热稳定性,而Zn2+处理后,所有重组AtBfr蛋白溶解温度(Tm)都有明显变化,表现为降低了 Bfr蛋白单体结构的稳定性。(6)测定了野生型AtBfr和AtBfrM60L的血红素含量,并通过血红素重构的方法研究了血红素结合对AtBfr蛋白的聚合影响。发现60号氨基酸的突变导致AtBfr不能结合血红素,而野生型AtBfr中血红素结合量增加有利于蛋白体外的24聚体组装。

关键词：根癌农杆菌细菌铁蛋白自组装蛋白改造

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Zn^（2＋）对细菌铁蛋白形成的影响

植物学通报 1994年第3期11卷 34-36,39页

作者：靳红帆刘样林李久蒂中国科学院植物研究所首都师范大学生物系

用酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）检测了Ｚｎ￣（２＋）对细菌铁蛋白（ｂａｃｔｅｒｉｏｆｅｒｒｉｔｉｎ（Ｂ．Ｆ．））合成的影响。Ｚｎ￣（２＋）抑制Ｂ．Ｆ合成，而在高Ｚｎ￣（２＋）培养液中生长的菌体其Ｂ．Ｆ分子中Ｚｎ￣（２＋）含... 详细信息

用酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）检测了Ｚｎ￣（２＋）对细菌铁蛋白（ｂａｃｔｅｒｉｏｆｅｒｒｉｔｉｎ（Ｂ．Ｆ．））合成的影响。Ｚｎ￣（２＋）抑制Ｂ．Ｆ合成，而在高Ｚｎ￣（２＋）培养液中生长的菌体其Ｂ．Ｆ分子中Ｚｎ￣（２＋）含量比低Ｚｎ￣（２＋）条件下的高二倍。Ｂ．Ｆ分子中的Ｚｎ￣（２＋）能转运出来激活碱性磷酸酶的活性。

关键词：细菌铁蛋白棕色固氮菌锌离子

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细菌铁蛋白氧化还原特性及电极活性的研究

生物物理学报 1999年第1期15卷 158-165页

作者：黄河清林庆梅陈翔陈中许良树张凤章厦门大学生物学系

棕色固氮菌细菌铁蛋白能直接快速地从金属铂电极上得到电子或提供电子给铂电极。经－６００ｍＶ（相对于ＮＨＥ）还原电位处理后，还原态细菌铁蛋白在可见光谱区中（３８０－５８０ｎｍ）所呈现的整体吸收光谱强度明显高于氧化态细菌铁... 详细信息

棕色固氮菌细菌铁蛋白能直接快速地从金属铂电极上得到电子或提供电子给铂电极。经－６００ｍＶ（相对于ＮＨＥ）还原电位处理后，还原态细菌铁蛋白在可见光谱区中（３８０－５８０ｎｍ）所呈现的整体吸收光谱强度明显高于氧化态细菌铁蛋白的吸收光谱强度。经氯化钴处理后的细菌铁蛋白表现出较弱的电极活性及释放铁的速率明显下降。此外，细菌铁蛋白在体外模拟棕色固氮菌整体细胞内的微量氧环境体系中仍有氢还原现象，因而推测细菌铁蛋白在该菌体内也能进行吸氢反应。

关键词：棕色固氮菌氧化还原细菌铁蛋白电极活性

PEG和盐对棕色固氮菌细菌铁蛋白和钼铁蛋白晶体生长的影响

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Acta Botanica Sinica 1998年第9期40卷 880-882页

作者：黄巨富汪道涌汪志平骆爱玲顾淑荣李佳格中国科学院植物研究所

棕色固氮菌（ＯＰ）体内的固氮酶钼铁（ＭｏＦｅ）蛋白和细菌铁蛋白均为重要的生物功能蛋白。前者为生物固氮的关键酶［１］，后者则可为生物代谢贮存丰富而又可溶的铁原子［２］。因而都得到了广泛而深入的研究。Ｋｉｍ［３］报道了Ｍ... 详细信息

棕色固氮菌（ＯＰ）体内的固氮酶钼铁（ＭｏＦｅ）蛋白和细菌铁蛋白均为重要的生物功能蛋白。前者为生物固氮的关键酶［１］，后者则可为生物代谢贮存丰富而又可溶的铁原子［２］。因而都得到了广泛而深入的研究。Ｋｉｍ［３］报道了ＭｏＦｅ蛋白衍射结果。赵宝光等［２］...

关键词：结晶细菌铁蛋白钼铁蛋白棕色固氮菌

黄鳝肠道假单胞杆菌铁蛋白基因的克隆及融合表达

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浙江农业学报 2018年第11期30卷 1819-1824页

作者：臧彧伟王全禾杨龙李伟长江大学生命科学学院湖北荆州434025

细菌铁蛋白(bacterioferritin,Bfr)在细菌铁代谢过程中具重要作用。为分析黄鳝肠道假单胞杆菌铁蛋白基因Bfr的功能,以该菌基因组DNA为模板,PCR扩增Bfr基因后将其克隆到pGEX-4T-1表达载体中。序列测定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG... 详细信息

细菌铁蛋白(bacterioferritin,Bfr)在细菌铁代谢过程中具重要作用。为分析黄鳝肠道假单胞杆菌铁蛋白基因Bfr的功能,以该菌基因组DNA为模板,PCR扩增Bfr基因后将其克隆到pGEX-4T-1表达载体中。序列测定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导、GST-resin纯化柱分离纯化获得Bfr蛋白。用SDS-PAGE电泳及Western blot检测融合蛋白;用比色法检测融合蛋白的铁离子螯合能力,用液体培养法分析重组蛋白对假单胞杆菌生长的影响。实验结果表明:成功获得黄鳝肠道假单胞杆菌Bfr基因,并实现了Bfr基因的融合表达;带有融合标签的GST-Bfr蛋白与Fe^(3+)和Fe^(2+)均不能结合,而Bfr蛋白则可以结合Fe^(3+)但不能结合Fe^(2+);在外源添加Fe^(3+)情况下,重组Bfr蛋白可促进假单胞杆菌的营养生长。该研究为进一步深入了解假单胞杆菌铁蛋白基因的功能提供了参考资料。

关键词：假单胞杆菌细菌铁蛋白蛋白纯化铁螯合

N端延长对大肠杆菌铁蛋白结构稳定性及其自组装的影响

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南京林业大学学报（自然科学版） 2017年第1期41卷 35-41页

作者：张瑜刘中车王丽君李迅王飞南京林业大学化学工程学院江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室江苏南京210037

【目的】研究延长的N端肽链对铁蛋白结构稳定性及蛋白自组装的影响,为在N端融合生物分子构建功能性纳米材料奠定基础。【方法】在大肠杆菌铁蛋白N端添加6个组氨酸残基,所得重组蛋白采用体积排阻色谱、非变性凝胶电泳和圆二色谱等手段与... 详细信息

【目的】研究延长的N端肽链对铁蛋白结构稳定性及蛋白自组装的影响,为在N端融合生物分子构建功能性纳米材料奠定基础。【方法】在大肠杆菌铁蛋白N端添加6个组氨酸残基,所得重组蛋白采用体积排阻色谱、非变性凝胶电泳和圆二色谱等手段与野生型铁蛋白的聚合态、二级结构及热力学稳定性进行对比分析。【结果】体积排阻色谱表明野生型铁蛋白在溶液中以24聚体和二聚体混合物形式存在,但突变蛋白仅以二聚体的形式存在;非变性凝胶电泳实验结果与体积排阻色谱结果吻合,即突变蛋白仅显示1条带,且与野生型铁蛋白的2聚体迁移位置基本相同;圆二色谱结果表明突变蛋白的二级结构与野生型类似,呈典型的α-螺旋结构,突变蛋白的Tm值比野生型降低了1.1℃。【结论】在大肠杆菌铁蛋白亚基的N端增加6个组氨酸残基所得突变蛋白的二级结构没有发生明显变化,但却无法形成24聚体壳状结构,在溶液中仅以二聚体的形式存在,且热力学稳定性有所降低。N端的延长可能导致铁蛋白单体构型发生改变,因而无法进一步组装成壳状结构。

关键词：细菌铁蛋白纳米壳蛋白质自组装热力学稳定性