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红掌细菌性叶疫病病原菌遗传变异分析及LAMP检测技术研究

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红掌细菌性叶疫病病原菌遗传变异分析及LAMP检测技术研究

作者：高月荣海南大学

学位级别：硕士

红掌细菌性叶疫病是由地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种(Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae, Xad)引起的一种毁灭性病害,是红掌生产中最主要的限制因子。该病在我国是一种输入性植物病害,且传播快、途径多、寄主广,目前仍然... 详细信息

红掌细菌性叶疫病是由地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种(Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae, Xad)引起的一种毁灭性病害,是红掌生产中最主要的限制因子。该病在我国是一种输入性植物病害,且传播快、途径多、寄主广,目前仍然缺乏有效的防治措施。为了探明我国红掌细菌性叶疫病病原菌种群结构和遗传变异特征,本研究从国内多个主要的红掌生产区,广泛采集疑似病害样本,分离出163个候选菌株,经过进一步的形态特征、致病力和分子标记等鉴定,获得93个Xad菌株。采用筛选出的13个扩增稳定、多态性好的RAPD分子标记,对Xad菌株进行基因分型,扩增结果显示：总条带数为131,平均条带数10,多态性条带数131,多态性比例100%。遗传多样性聚类分析(NTsys-pc2.02 Clustering软件,SAS软件),遗传相似性系数范围在0.58-0.98之间,综合几种聚类方法从倒数第四步聚类处将所有菌株划分为5组(I～V),分别包括1、2、1、53、36个菌株。挑选7个不同组群代表性菌株(GYR149, GYR156, GYR201, GYR206, GYR209-1, GYR209-2, GYR216)分别接种红掌’DAKOTA’和’Acropolis’鉴定,表现出致病力差异。这些结果说明：细菌性叶疫病在我国多个红掌产区分布,且存在广泛的遗传变异,种群遗传相似性系数与地理来源、寄主品种无显著相关,国内Xad群体来自多重输入事件,并可能随种苗流通进一步传播和变异。种植健康种苗是红掌安全生产的前提,因此,种苗带菌检测是病害防治的关键环节,而常规植物病理学、生物化学及以PCR为基础的分子检测鉴定方法,在检测周期、成本、准确性、技术难度等方面存在不足,限制了在实际生产中的应用。本文采用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术,开发出一种实用性强的新型Xad检测方法。首先采用多位点序列分型(Multi-locus sequence type, MLST)技术,筛选出 ABC转运蛋白基因作为候选靶标,再用PrimerExplorer V4软件设计LAMP特异性引物,并优化出反应体系,全部反应可在63℃条件下,30-50 min内完成。在Xanthomonas属内扩增中,Xad-LAMP表现出X. axonopodis pv. dieffenbachiae的特异性;对93个不同种群Xad检测,阳性率为100%;且扩增敏感性可达10-6 ng Xad基因组DNA,超出常规PCR Ⅰ个数量级,达单细胞水平。其次,为了直观分析扩增结果,建立了SYBR Geen Ⅰ和钙黄绿素/Mn2+为指示剂的荧光检测体系,以及LFD试纸条检测方法。另外,通过对红掌组织样品处理方法进行优化,开发出直接等温扩增检测技术。本研究提供了一种简便可靠、经济快速、实用性强的红掌细菌性叶疫病分子检测技术,对该病害的捡疫、防治具有积极意义。

关键词：红掌细菌性叶疫病环介导等温扩增遗传变异

喷施铜剂防治咖啡细菌性叶疫病和浆果病的效果

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世界热带农业信息 1988年第1期 28-32页

作者： G. M. Kairu 黎乙东

在肯尼亚的大田试验中,采用4种铜剂配方(氢氧化铜、氧化亚铜、王铜和波尔多液)有效地防治咖啡细菌性叶疫病和浆果病,并且明显地增加去壳咖啡的产量。在这两种病害严重发生的情况下,氢氧化铜的效果最佳。在有机质含量低的轻质土上喷施铜... 详细信息

在肯尼亚的大田试验中,采用4种铜剂配方(氢氧化铜、氧化亚铜、王铜和波尔多液)有效地防治咖啡细菌性叶疫病和浆果病,并且明显地增加去壳咖啡的产量。在这两种病害严重发生的情况下,氢氧化铜的效果最佳。在有机质含量低的轻质土上喷施铜剂后发生植物毒性症状,但在重质土壤上却没有出现这种情况。喷施铜剂一年,其残效致使咖啡树下一年的感病性增高,连续喷施两年对防治这两种病害和产量有明显的效果。但过度使用铜剂会出现长期的植物毒性问题。

关键词：细菌性叶疫病果病浆果咖啡树喷施喷雾施肥

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红掌细菌性叶疫病防治药剂筛选试验

热带农业科技 2004年第2期27卷 4-6页

作者：蒋桂芝赵丽芳云南省热带作物科学研究所云南景洪666100

报告7种杀菌剂在西双版纳防治红掌细菌性叶疫病的田间防治效果,其中土霉素100倍液防效最好,达71.1%;加入增效剂能提高土霉素的防治效果;速补、新植霉素防效较低;混合1#虽然防效较好但有药害;杀菌王、链霉素、氟哌酸基本无效。

关键词：红掌细菌性叶疫病土霉素农药西双版纳

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西双版纳红掌细菌性叶疫病病原菌初步研究

热带农业科技 2003年第3期26卷 10-12页

作者：蒋桂芝郭春雷云南省热带作物科学研究所云南景洪666100 云南大学微生物研究所云南昆明650091

经鉴定,云南西双版纳的红掌细菌性叶疫病病原菌为Burkholderia caryophylli、Burkholderiasolanacearum、Pseudomonas sp.、Xanthomonas sp.等4个种。这4种菌的混合侵染力极强,目前在栽培管理上还缺乏有效的防治措施。

关键词：西双版纳红掌细菌性叶疫病病原菌症状分离鉴定

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红掌细菌性叶疫病田间防治试验

热带农业科技 2005年第3期28卷 10-13,34页

作者：蒋桂芝云南省热带作物科学研究所云南景洪666100

经一年的田间试验,在西双版纳网棚无土栽培条件下,采用在网棚下增置防雨塑料棚和多种农药组合的6种处理,对幼苗期和产花期细菌性叶疫病表现出有不同程度的防效,但防效较低(10.6%-61.1%), 不能有效抑制病害累计死亡率的快速增长和全部死... 详细信息

经一年的田间试验,在西双版纳网棚无土栽培条件下,采用在网棚下增置防雨塑料棚和多种农药组合的6种处理,对幼苗期和产花期细菌性叶疫病表现出有不同程度的防效,但防效较低(10.6%-61.1%), 不能有效抑制病害累计死亡率的快速增长和全部死亡;经研究提出了在现有的栽培条件下,实施“无菌”栽培策略,调整栽培技术思路的建议。

关键词：红掌细菌性叶疫病防治无土栽培西双版纳

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红掌细菌性叶疫病田间防治试验

红掌细菌性叶疫病田间防治试验

红掌细菌性疫病响应表达谱分析及抗性相关WRKYs基因鉴定

2005中国植病学会、中国菌物学会北海联合年会

作者：蒋桂芝杨雄飞云南省热带作物科学研究所

经一年的田间试验,在西双版纳网棚、无土栽培条件下,采用在网棚下增置防雨塑料棚和多种农药组合的6种处理,对幼苗期和产花期细菌性叶疫病表现出有不同程度的防效,但防效较低(10．6％-61．1％), 不能有效抑制病害累计死亡率的快速增长和... 详细信息

经一年的田间试验,在西双版纳网棚、无土栽培条件下,采用在网棚下增置防雨塑料棚和多种农药组合的6种处理,对幼苗期和产花期细菌性叶疫病表现出有不同程度的防效,但防效较低(10．6％-61．1％), 不能有效抑制病害累计死亡率的快速增长和全部死亡;经研究提出了在现有的栽培条件下,实施“无菌”栽培策略,调整栽培技术思路的建议。

关键词：红掌无土栽培细菌性叶疫病防治西双版纳

来源： cnki会议评论

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红掌细菌性疫病响应表达谱分析及抗性相关WRKYs基因鉴定

作者：洪阳海南大学

学位级别：硕士

细菌性叶疫病(病原菌Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae, Xad)是红掌(Anthurium andraeanum Linden)生产中最主要的病害。WRKYs是植物中特有的一类转录因子家族,在植物应答多种胁迫方面具有重要的作用。研究红掌疫病响应基因... 详细信息

细菌性叶疫病(病原菌Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae, Xad)是红掌(Anthurium andraeanum Linden)生产中最主要的病害。WRKYs是植物中特有的一类转录因子家族,在植物应答多种胁迫方面具有重要的作用。研究红掌疫病响应基因表达谱,挖掘鉴定抗病相关WRKYs基因,有助于揭示红掌-病菌互作的分子病理学机制,服务于抗病分子改良。本研究首先对红掌抗疫病品种'Acropolis'的混合组织进行转录组测序注释,作为参考序列。对人工接种的叶片和系统侵染材料进行RNA-Seq表达谱分析。根据相关基因的表达动态变化,探讨红掌疫病抗性应答的信号途径及重要元件PTI和ETI在其中的发生发展规律;以及SA. ABA、JA、ET和GA等激素信号途径在抗性形成中的作用;进一步挖掘鉴定了部分Xad诱导表达的WKRY基因。主要研究结果如下：1、构建红掌'Acropolis'混合组织cDNA文库,测序组装共获得77707条Unigene。对接种Xad的叶片和叶柄进行数字表达谱分析,差异表达基因的GO分类,表明显示大量免疫和抗逆相关基因富集表达。在两种组织中,PTI相关的FLS2、 FRK1、NDR1等元件被迅速诱导,并能持续较长时间(>12dpi)的高水平表达;同样,病原效应子激发的ETI途径元件RPS2、RAR1、HSP90、WRKYs等上调表达。PTI和ETI两种免疫反应可能存在时间和空间上的交叉重叠,协同作用红掌病害的扩展。2、综合分析了红掌疫病侵染后,植物病害胁迫抗性相关的SA、JA、 ET、 ABA、 GA等激素信号相关基因表达变化。其中,JA的合成积累、结合受体、下游响应等基因显著上调,显示JA介导的防御途径可能在红掌抗疫病中起重要作用;相反,SA途径的重要基因表达大多表达下调或变化不明显,由于植物内源JA和SA多存在拮抗作用,SA途径可能不参与抗性形成反应;另外,通过分析信号调控基因和途径交叉基因的表达变化推测ET可能促进系统抗性的形成,而ABA则负调叶片和系统抗病性,具体仍需进一步的实验证实。3、研究选择对6个常用候选基因包括延伸因子1a(EF1a)、甘油醛三磷酸脱氢酶(GADPH)、泛素7(UBQ7)、组蛋白H3(His3)、α微管蛋白(TUB)、和β-肌动蛋白(ACTB),进行PCR扩增效率筛选,以及红掌抗、感品种叶片和系统侵染进程中的表达稳定性分析。通过软件综合评价显示：不同候选基因的表达稳定性存在差异,其中UBQ7和His3在不同品种、组织、时期表达均稳定,适合作为红掌叶疫病相关基因定量分析的内参基因。4、根据转录组注释信息,初步鉴定红掌WRKY基因28个,包括20个Unigene和8个Contig,其中12个覆盖全长ORF序列,16个未知EST序列,根据表达谱注释结果挖掘并确定10个疫病响应的候选WRKY基因。5、采用qRT-PCR方法,以His3作为内参,分析WRKY基因在Xad诱导下感('Dakoda')、抗('Acropolis')品种不同组织中的表达水平。结果表明：Xad胁迫下,U3019、U19502、U12707和CL6222.1基因在红掌抗病材料'Acropolis'中叶柄中转录水平会迅速(1d)上调,U13633在'Acropolis'中叶片和叶柄中表达均显著上调,而在'Dakoda'中下调表达或无明显变化,预测这些基因与红掌应答Xad有着密切关系。另外,通过激素处理分析,明确各候选WRKY基因的激素诱导表达规律,初步推测各基因可能的防御信号途径。6、通过RACE技术,克隆出4个响应Xad胁迫的候选WRKY基因的全长cDNA。开放阅读框分别为703bp、1056bp、1266bp和942bp;分别编码234、351、421和313个氨基酸,并进行了cDNA和DNA扩增验证。结果为初步认识红掌响应疫病胁迫分子病理机制及深入研究奠定了基础。

关键词：红掌细菌性叶疫病 WRKY转录因子生物信息学分析内参基因筛选 RACE克隆