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细胞连接蛋白在肝星状细胞活化中的作用

细胞连接蛋白在肝星状细胞活化中的作用

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作者：刘爽大连医科大学

学位级别：硕士

[背景]肝硬化是进展性肝纤维化的终末期,如果不加以预防,可能发展为肝硬化,甚至肝癌和肝衰竭。在肝纤维化的进展过程中起着核心作用的是肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化。当前的研究主要集中在细胞因子促活化的作用上,已... 详细信息

[背景]肝硬化是进展性肝纤维化的终末期,如果不加以预防,可能发展为肝硬化,甚至肝癌和肝衰竭。在肝纤维化的进展过程中起着核心作用的是肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化。当前的研究主要集中在细胞因子促活化的作用上,已经阐明诸多因子的分子机制,但是对细胞因子活化途径的干预,对于抗纤维化的治疗效果无法达到预期。而细胞间接触和连接是活化后的HSC的重要表现,本课题组之前的研究也发现细胞接触与非接触共培养,HSC会表现出不同的活化状态,因此,肝硬化发病新的机制的探索将有助于肝纤维化的治疗取得突破。[目的]通过将静止的肝星状细胞与活化的肝星状细胞进行接触培养与非接触共培养进行对照,观察细胞间连接蛋白CX-43表达及阻断后对肝星状细胞活化的影响,从而揭示其对HSC活化的作用。[方法]1.通过蛋白酶,胶原酶,后分散液序贯灌注的方法灌注雄性S-D大鼠的肝脏,分散肝脏细胞并使之消化,再通过密度梯度离心,和细胞的贴壁时间的差异性,得到分离的肝星状细胞,并且量子点标记。将分离得到的大鼠的的原代HSC(静止表型),与HSC-T6细胞株(活化表型)依照一定的比值接种在提前用Matrigel胶包被的transwell体系内。分组:非阻滞剂组分为:A组(非接触共培养组):上室接种1.3×10个/ml,接种2ml的HSC-T6细胞,下室接种1.3×10个/ml,接种2ml的原代HSC。B组(接触共培养组):将原代HSC 1.3×10个/ml与HSC-T6细胞株1.3×10个/ml按照1:1混悬,上室和下室各接种2ml混悬液。C组(阴性对照度):上室和下室均加入1.3×10个/ml,接种2ml。阻滞剂组:记为Bi组,将原代HSC 1.3×10个/ml与HSC-T6细胞株1.3×10个/ml按照1:1混悬,上室和下室各接种2ml混悬液,并且加入CX-43阻滞剂gap26.2.观察指标:通过免疫荧光技术观察24h,48h各分组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在原代HSC中的表达量,反映细胞活化状况,并观察原代HSC中细胞连接蛋白-43(CX-43)的表达量,以此来验证CX-43与HSC活化是否具有一定的关系。[结果]非阻滞剂组α-SMA:A组:原代HSC 24h,48h均未活化,不表达α-SMA。B组:原代HSC 24h已经开始活化,48h明显活化,从24h的表达少量的α-SMA,到48h表达大量的α-SMA,从细胞形态学上观察,已经发生显著变化,如细胞体积增大,胞突延伸展开,伪足伸出。C组:原代HSC细胞24h和48h全都没有发生活化,不表达α-SMA。阻滞剂组:Bi组,原代HSC 24h尚未活化,不表达α-SMA。非阻滞剂组CX-43:A组:原代HSC 24h,48h均未活化,不表达CX-43,B组:原代HSC 24h已经开始活化,表达少量的CX-43,48h明显活化,细胞体积增大,胞突延伸展开,伸出伪足,表达大量的CX-43。C组:原代HSC 24h和48h均未活化,不表达CX-43。阻滞剂组:Bi组,原代HSC 24h尚未活化,不表达CX-43。[结论]1.通过与活化的HSC接触共培养后,静止的原代HSC活化速度加快,说明影响HSC活化的因素之一是细胞间连接。2.活化的HSC表达细胞连接蛋白CX-43,阻断CX-43可以抑制HSC活化进程,说明CX-43与原代HSC的活化有促进作用。

关键词：肝星状细胞细胞连接细胞连接蛋白-43 平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)

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