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去氧紫草素对人大细胞肺癌NCI-H460细胞株的抑癌作用研究

去氧紫草素对人大细胞肺癌NCI-H460细胞株的抑癌作用研究

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作者：周珊珊阜阳师范大学

学位级别：硕士

为探究中药单体去氧紫草素对人大细胞肺癌NCI-H460的抑制作用,本研究开展了以下实验:(1)在细胞学实验中,将处于对数生长期的人大细胞肺癌NCI-H460细胞株随机分为空白对照组,DMSO组,阳性对照组(5-Fu,5氟尿嘧啶,80μM)以及去氧紫草素不同... 详细信息

为探究中药单体去氧紫草素对人大细胞肺癌NCI-H460的抑制作用,本研究开展了以下实验:(1)在细胞学实验中,将处于对数生长期的人大细胞肺癌NCI-H460细胞株随机分为空白对照组,DMSO组,阳性对照组(5-Fu,5氟尿嘧啶,80μM)以及去氧紫草素不同浓度组[四甲基噻唑蓝(MTT)实验、细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验和细胞凋亡检测实验:4,6,8,10μM;平板克隆集落形成实验:0.5,1,1.5μM],通过MTT实验和细胞平板克隆集落形成实验细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验以及一步法TUNEL细胞凋亡检测实验检测不同浓度的去氧紫草素对NCI-H460细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响;(2)在动物实验中本研究选取Balb/c雄性裸鼠,以皮下接种NCI-H460细胞的方式构建裸鼠皮下荷瘤模型,按照每组肿瘤体积平均值140 mm左右将成瘤裸鼠随机分为空白对照组、阳性对照组和去氧紫草素组,每组3只,分别灌胃给予0.5%CMC-Na(100μL)、5-Fu(25 mg/kg,100μL)、0.5%CMC-Na+去氧紫草素(5 mg/kg,100μL),灌胃周期为15 d,灌胃结束收取血清和肿瘤组织,通过H&E染色和免疫组化来探究去氧紫草素在动物体内对NCI-H460瘤体的抑制作用;(3)随后本研究通过网络药理学和细胞转录组学测序分析去氧紫草素对NCI-H460细胞作用的差异表达基因及潜在的信号通路,以此来初步探究去氧紫草素抑制人大细胞肺癌NCI-H460的作用机制。实验结果如下:(1)MTT实验结果显示,与空白对照组相比,随着去氧紫草素浓度的升高NCI-H460细胞的存活率逐渐降低,呈明显的剂量依赖性,并在8μM时达到最低;细胞平板克隆集落形成实验结果表明,随着去氧紫草素浓度的增大,细胞集落数目逐渐减少,1.5μM时集落形成数最少;(2)细胞划痕实验结果显示,与空白对照组相比,不同浓度的去氧紫草素对NCI-H460细胞的迁移能力均有明显的抑制效果,且在10μM时,细胞迁移率最低;(3)Transwell细胞侵袭实验结果显示,随着去氧紫草素浓度的升高,穿过上室到达下室的细胞数目越来越少,呈现明显的剂量依赖性,去氧紫草素浓度为10μM时侵袭细胞数目最少;(4)TUNEL细胞凋亡检测结果表明,去氧紫草素浓度越大,绿色荧光亮度越强,说明细胞凋亡现象越明显,呈明显的剂量依赖性,在4μM时已出现绿色荧光,在10μM时绿色荧光亮度最强,细胞凋亡现象最明显;(5)Balb/c裸鼠皮下接种NCI-H460细胞成瘤实验结果显示,去氧紫草素(5 mg/kg)组的肿瘤体积和RTV值与空白对照组相比均有减小,且去氧紫草素组的裸鼠体重变化趋势与空白对照组基本一致,均稳中有升,说明5 mg/kg的去氧紫草素在Balb/c裸鼠体内能够较好的抑制NCI-H460肿瘤的增殖且对裸鼠的正常生理生活影响较小;H&E染色结果显示,与CMC-Na组相比,去氧紫草素组肿瘤组织显示出明显的肿瘤细胞收缩、破碎、稀疏排列,肿瘤内出现空泡化及坏死。免疫组化结果显示,去氧紫草素组与CMC-Na组相比Ki-67表达量降低,说明经去氧紫草素处理后肿瘤的增殖能力下降,而E-Cad的表达量与CMC-Na组相比是升高的,说明经去氧紫草素处理后肿瘤细胞间的粘附性增加,因而肿瘤的迁移能力受到抑制;(6)网络药理学分析结果显示去氧紫草素可能通过BCL-2、CCNE 1、CCNE2、CDC 25 A等35个靶点作用于非小细胞肺癌并可能通过诱导细胞凋亡而对NCI-H460细胞产生抑癌作用;细胞转录组测序结果显示去氧紫草素可能主要通过影响脂质与动脉粥样硬化、类固醇激素生物合成、细胞凋亡以及PPAR信号通路来抑制人大细胞肺癌NCI-H460。综上,去氧紫草素在细胞学实验中对人大细胞肺癌细胞株NCI-H460的增殖、迁移和侵袭均有明显的抑制作用,且在4μM时已出现凋亡现象;在Balb/c裸鼠体内实验中,5 mg/kg的去氧紫草素能够较好地抑制NCI-H460肿瘤的增殖且对裸鼠正常的生理生活影响较小,H&E染色结果显示经去氧紫草素处理后肿瘤细胞出现破碎、空泡化,免疫组化结果显示经去氧紫草素处理后Ki-67的表达量降低,说明肿瘤细胞的增殖能力受到抑制,同时E-Cad的表达量升高,细胞间粘附性增加,因而肿瘤细胞的迁移能力被抑制;细胞转录组测序结果显示去氧紫草素作用于人大细胞肺癌NCI-H460的机制可能与脂质与动脉粥样硬化、类固醇激素生物合成、细胞凋亡以及PPAR信号通路等有关。本研究通过细胞学实验、动物实验、网络药理学分析以及细胞转录组测序进行了中药单体去氧紫草素对人大细胞肺癌NCI-H460细胞的抑制作用研究,以期为中药单体去氧紫草素治疗人大细胞肺癌NCI-H460提供新的实验参考数据

关键词：去氧紫草素 NCI-H460 抑癌作用研究细胞转录组测序

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