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小鼠耳蜗血管纹边缘细胞的原代培养体系的建立

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小鼠耳蜗血管纹边缘细胞的原代培养体系的建立

作者：韩芳华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分新生小鼠耳蜗血管纹边缘细胞的分离及原代培养目的:建立稳定的新生小鼠耳蜗血管纹(Stria Vascularis,SV)边缘细胞(Marginal Cells,MCs)的体外培养体系,为研究边缘细胞的形态和功能提供良好的条件和模型。方法:采用机械分离方... 详细信息

第一部分新生小鼠耳蜗血管纹边缘细胞的分离及原代培养目的:建立稳定的新生小鼠耳蜗血管纹(Stria Vascularis,SV)边缘细胞(Marginal Cells,MCs)的体外培养体系,为研究边缘细胞的形态和功能提供良好的条件和模型。方法:采用机械分离方法分离出新生小鼠的血管纹,将其接种于3.5cm培养皿中贴壁生长,加入含有10%胎牛血清、氢化可的松、表皮生长因子、三碘甲状腺原氨酸、胰岛素、转铁蛋白等促进生长成分的完全培养基,于37℃、5%CO2 /95%空气的恒温培养箱内培养,观察细胞生长状况,每周换液二次。制作扫描电镜标本观察细胞的超微结构。结果:光镜下,接种24小时可见约80%移植块周围少量多角形细胞爬出。48小时,可见多角形细胞明显增多,细胞成片状离心性生长;梭形细胞在移植块另一侧散在生长。72小时后,更多的多角形细胞相互融合,形成紧密排列的单层极性上皮层,呈典型的“铺路石”样外观,梭形细胞在多角形细胞周围呈放射状生长。5天后,来源于多个移植块的多角形细胞团块融合,并出现“dome”现象。梭形细胞数量显著增加,并抑制多角形细胞层的增大。部分多角形细胞体积变大,呈“泡沫样”外观。20天左右,移植块逐渐变黑进而裂解消失。经过反复传代,细胞最长生长4周左右。电镜下见多角形细胞为一个或二个卵圆形核,有丰富的细胞器并有分泌小泡,可见微绒毛等上皮细胞特征。结论:采用组织块培养方法,成功建立了小鼠血管纹边缘细胞的体外培养模型,为进一步研究内淋巴的形成机制提供了良好的条件。第二部分改良小鼠耳蜗血管纹边缘细胞的原代培养及鉴定目的:在改良取材方法的基础上建立更稳定、可靠的小鼠耳蜗血管纹边缘细胞的原代培养体系,为进一步利用边缘细胞进行生理学、免疫学、病理生理学、生物化学等方面的研究奠定基础。方法:用机械分离和化学消化结合的方法制成细胞悬液,将其接种于3.5cm培养皿中贴壁生长,加入含有10%胎牛血清、氢化可的松、表皮生长因子、三碘甲状腺原氨酸、胰岛素、转铁蛋白等促进生长成分的完全培养基,于37℃、5%CO2 /95%空气的恒温培养箱内培养,每日观察细胞生长状况,每周换液二次。用免疫细胞化学技术鉴定细胞的中间丝类型。用免疫荧光细胞化学技术鉴定细胞膜上的离子通道。结果:光镜下,培养24小时至4天培养皿内细胞贴壁,未见明显增长。第5天,多角形细胞开始增多。第7天,在成片的梭形细胞区域内,多角形细胞呈单层极性排列,形成细胞岛,呈典型的“铺路石”样外观。第10天,可见“dome”形成。第14天后,2种细胞混杂生长,部分多角形细胞胞体增大,胞浆内空泡增多,呈“泡沫样”外观。细胞最长生长21天。免疫细胞化学染色显示多角形细胞共表达细胞角蛋白18和波形蛋白;梭形细胞仅表达波形蛋白。免疫荧光细胞化学技术进行胞膜上KCNQ1、NKCC1通道染色为阴性。结论:采用改良边缘细胞培养方法,成功建立了小鼠血管纹边缘细胞的体外培养模型,经过免疫细胞化学鉴定证实,这一培养体系是稳定、可靠的。

关键词：血管纹边缘细胞小鼠原代培养细胞角蛋白18 波形蛋白

模拟肝脏组织微环境对人脐带间充质干细胞向肝细胞样细胞分化的影响

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模拟肝脏组织微环境对人脐带间充质干细胞向肝细胞样细胞分化的影...

作者：马欣河北医科大学

学位级别：硕士

目的：体外条件下，采用组织块培养法分离培养人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）。利用大鼠肝组织匀浆上清液（liver tissue homogenate supernatant, LHS）模拟肝脏组织微环境对人脐带间充... 详细信息

目的：体外条件下，采用组织块培养法分离培养人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs）。利用大鼠肝组织匀浆上清液（liver tissue homogenate supernatant, LHS）模拟肝脏组织微环境对人脐带间充质干细胞进行诱导培养，从细胞形态、肝细胞标志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、细胞角蛋白18（cytokeratin-18，CK-18）以及肝脏功能蛋白色氨酸2,3-加双氧酶（tryptophan2,3-dioxygenase，TPH2）表达等方面考察人脐带间充质干细胞在肝脏组织微环境中向肝细胞定向分化的能力，以期为临床应用干细胞治疗终末期肝病提供理论依据和实验基础。方法：1hUCMSCs的分离培养、表型及分化潜能鉴定无菌条件下收集足月产胎儿的脐带并储存于0.9%的无菌生理盐水中。在超净工作台内用PBS洗去脐带中残余血液并剪为3-4cm的小段。沿纵轴剖开脐带，暴露并剔除脐动脉和脐静脉，分离脐带基质即华尔通胶（wharton’s jelly），将其剪为0.5-1.0mm的组织块。采用组织块培养法，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基10mL;置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2的培养箱中培养。待细胞长至80-90%汇合后吸弃组织块，细胞进行传代培养。取处于对数生长期的第3代贴壁细胞制成单细胞悬液，采用流式细胞术检测hUCMSCs的间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）标志物的表达。取处于对数生长期的第3代贴壁细胞，消化收集，离心重悬，以2×10～4个/孔的密度接种于24孔板;分别采用成骨、成脂诱导培养基进行培养，14天后分别采用Von Kossa染色法检测钙化基质沉淀和油红O染色法检测脂滴。2LHS诱导hUCMSCs向肝细胞样细胞分化Sprague–Dawley（SD）大鼠，2%戊巴比妥钠按3mL/kg腹腔注射麻醉，固定四肢，消毒皮肤。打开腹腔，分离下腔静脉和肝门静脉，结扎肝门静脉远端。从肝门静脉近端进针并固定，用4℃预冷的生理盐水自肝门静脉进行肝脏灌流，待肝脏体积增大、肝叶变白时开放下腔静脉以利于灌流液排出，共灌流约30min。灌流结束后取出肝组织置于冰上，剔除被膜及韧带。称取湿重，按150mg/mL加入DMEM/F12培养基;冰浴条件下进行肝组织匀浆。4℃，15000g离心30min，取上清液，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-70℃冰箱储存备用。取处于对数生长期的第3代贴壁细胞，以1×105个/皿的细胞密度接种于直径为35mm塑料培养皿中，待细胞长至约80%汇合，吸弃培养基，加入诱导培养基（肝组织匀浆上清液）进行诱导培养。实验分组为6组：阴性对照组、阳性对照组、标准对照组，LHS诱导hUCMSCs3天，5天，7天组;选取单纯LHS作为阴性对照组，QSG-7701人肝细胞株作为阳性对照组，常规培养的hUCMSCs作为标准对照组。倒置显微镜下观察并记录各组细胞形态。提取上述各组细胞总RNA，采用RT-PCR方法检测肝细胞标志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、细胞角蛋白18（cytokeratin-18，CK-18）及肝脏功能蛋白色氨酸2,3-加双氧酶（tryptophan2,3-dioxygenase，TPH2）的mRNA表达情况。取处于对数生长期的第3代贴壁细胞，以5×105个/瓶的细胞密度接种于25cm2塑料培养瓶中，细胞培养及实验分组同上。提取上述各组细胞总蛋白，BCA法测定各组样品的蛋白浓度。采用Westen blot方法检测肝细胞标志物AFP、CK-18及肝脏功能蛋白TPH2的表达情况。3数据处理与统计分析上述实验均重复三次，统计结果以mean±SD表示;应用SPSS13.0统计软件，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）继以Dunnett t test对数据进行统计分析。统计结果以P＜0.05视为差异具有统计学意义。结果：1hUCMSCs的分离培养、表型及分化潜能鉴定倒置显微镜下观察，人脐带基质采用组织块培养法培养10-14天，可见组织块边缘有长梭形的成纤维样细胞长出;继续培养7-10天细胞长至80%-90%汇合，呈漩涡状或放射状排列。流式细胞术检测结果显示：hUCMSCs高表达CD29、CD44、CD105、CD73、CD90等MSCs表面标志分子，不表达造血细胞标志物CD34、CD45及内皮细胞特征性表面标志分子CD31;也不表达人类白细胞抗原HLA-DR

关键词：人脐带间充质干细胞诱导分化肝组织匀浆上清液肝样细胞甲胎蛋白细胞角蛋白18 色氨酸2,3-加双氧酶

血清组织多肽特异抗原水平与肺癌生物学行为的关系

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中华结核和呼吸杂志 2002年第5期25卷 262-264页

作者：陈名声于文彬卢宝弼代艳丽刘建新第四军医大学西京医院免疫室西安710032 第四军医大学西京医院呼吸科西安710032 宝鸡市解放军第三医院

目的　探讨血清组织多肽特异抗原 (TPS)水平与肺癌生物学行为的关系及其对肺癌的诊断价值。方法　采用酶联免疫吸附分析法 (ELISA)测定 69例肺癌患者及 2 0例作为对照的肺结核及肺炎患者血清TPS水平。结果　肺癌患者血清TPS水平 (2 73±... 详细信息

目的　探讨血清组织多肽特异抗原 (TPS)水平与肺癌生物学行为的关系及其对肺癌的诊断价值。方法　采用酶联免疫吸附分析法 (ELISA)测定 69例肺癌患者及 2 0例作为对照的肺结核及肺炎患者血清TPS水平。结果　肺癌患者血清TPS水平 (2 73± 1 72 )U/L明显高于对照组患者[(1 1 5± 97)U/L ,P 细胞肺癌组患者TPS水平 (346± 1 63)U/L显著高于非小细胞肺癌组患者 [(2 4 8± 1 65)U/L ,P 蛋白(CYFRA 2 1 1 ) (P >0 0 5)无明显相关。结论　血清TPS含量与肺癌临床分期、组织分型及转移密切相关。

关键词：血清组织多肽特异抗原肺癌生物学行为细胞角蛋白18

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原发性肝脏滑膜肉瘤2例临床病理学特征

中华病理学杂志 2022年第5期51卷 447-449页

作者：郑美玲黄海建陈志忠陈新陈小岩漳州市第二医院病理科漳州363100 福建医科大学省立临床医学院福建省立医院病理科福州350001

目的:探讨原发性肝脏滑膜肉瘤(primary synovial sarcoma of the liver,PSSL)的临床病理学特征。方法:收集2例PSSL,对其进行HE、免疫组织化学染色,并行荧光原位杂交(FISH)检测SS18(SYT)、EWSR1基因分离情况。结果:2例患者为男性,肿物大... 详细信息

目的:探讨原发性肝脏滑膜肉瘤(primary synovial sarcoma of the liver,PSSL)的临床病理学特征。方法:收集2例PSSL,对其进行HE、免疫组织化学染色,并行荧光原位杂交(FISH)检测SS18(SYT)、EWSR1基因分离情况。结果:2例患者为男性,肿物大小为11.6 cm×10.5 cm×8.5 cm及8 cm×8 cm×6 cm;切面灰白、灰褐色,质软及质脆,镜下大部分瘤细胞呈梭形、上皮样及小圆细胞样;肿瘤侵犯肝脏及膈肌组织。免疫组织化学瘤细胞呈波形蛋白、TLE1、Fli1、CD56、H3K27Me3及INI1阳性,低相对分子质量细胞角蛋白及细胞角蛋白18腺样成分阳性;FISH检测到SS18(SYT)基因分离信号。结论:PSSL极为罕见,诊断依赖于病理形态学、免疫表型及SS18(SYT)基因检测,临床及病理学上需要与肝脏其他梭形细胞肿瘤及肝细胞癌等鉴别。

关键词：滑膜肉瘤临床病理学特征瘤细胞细胞角蛋白18 小圆细胞 CD56 基因分离病理形态学

外周血循环肿瘤细胞在晚期肺癌患者的预测及预后价值研究

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癌症进展 2010年第5期8卷 484-490页

作者：周小昀李龙芸郝淮杰王树兰郭子健王孟昭张力钟巍冉然张晓彤徐丽艳林平中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院呼吸内科北京100730 北京莱尔生物医药科技有限公司北京100005 北京胸科医院北京101149

目的应用免疫磁珠阴性富集技术结合荧光细胞化学染色方法,检测肺癌患者外周静脉血中循环肿瘤细胞(CTC)的敏感性及特异性;分析肺癌患者CTC水平与临床疗效的相关性。方法 2007年7月～2008年4月在北京协和医院呼吸内科肺癌中心诊断的144例... 详细信息

目的应用免疫磁珠阴性富集技术结合荧光细胞化学染色方法,检测肺癌患者外周静脉血中循环肿瘤细胞(CTC)的敏感性及特异性;分析肺癌患者CTC水平与临床疗效的相关性。方法 2007年7月～2008年4月在北京协和医院呼吸内科肺癌中心诊断的144例肺癌患者作为研究对象,并设健康对照组35例、良性肺疾病组28例。采集上述各组静脉血标本,应用免疫磁珠阴性富集分离及免疫荧光细胞化学染色方法检测静脉血中CK18^+/CD45^-/CTC计数,凡≥1判定为阳性。随访上述52例入院化疗患者治疗后CTC,与其临床疗效、生存进行相关性分析。结果健康和良性肺疾病组CTC检测阳性分别为2例(5.71%)及1例(3.57%),肺癌组未接受抗肿瘤治疗前CTC的阳性率64.5%(93/144)。其中Ⅲ_A、Ⅲ_B及Ⅳ期分别为32.0%、56.8%及78.0%。腺癌、鳞癌、小细胞癌CTC阳性率分别为66.7%、70%及62%。52例肺癌患者进行每周期化疗后CTC检测,疗前CTC阳性率69.2%(36/52),3个周期化疗后下降至6.5%(3/46),显示CTC与疗效相关。结论本检测方法简便,敏感性为93.1%,特异性为72.8%;CTC阳性率与疾病分期、吸烟、疗效及转移相关,CTC水平越高可能提示预后不良。

关键词：肺癌循环肿瘤细胞免疫磁珠细胞角蛋白18 白细胞相关抗原

肝匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞分化为肝样细胞

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中国组织工程研究 2013年第45期17卷 7877-7884页

作者：马欣薛改刘建芳李建立侯艳宁河北医科大学研究生学院河北省石家庄市050017 解放军白求恩国际和平医院药剂科河北省石家庄市050082 河北省人民医院麻醉科河北省石家庄市050051

背景:前期实验证明大鼠肝组织匀浆上清液能诱导人脐带间充质干细胞发生形态学变化,但诱导后细胞是否具有肝细胞的表型和功能特征尚不清楚。目的:以人脐带间充质干细胞为研究对象,对肝组织匀浆上清液定向诱导分化后细胞是否具有肝细胞的... 详细信息

背景:前期实验证明大鼠肝组织匀浆上清液能诱导人脐带间充质干细胞发生形态学变化,但诱导后细胞是否具有肝细胞的表型和功能特征尚不清楚。目的:以人脐带间充质干细胞为研究对象,对肝组织匀浆上清液定向诱导分化后细胞是否具有肝细胞的表型和功能特性进行初步验证。方法:选取第3代人脐带间充质干细胞,采用肝组织匀浆上清液作为诱导培养基,进行如下分组:单纯肝组织匀浆上清液作为阴性对照组,QSG-7701人肝细胞株作为阳性对照组,基础培养的人脐带间充质干细胞作为标准对照组;肝组织匀浆上清液处理3,5,7 d诱导组;在蛋白水平和转录水平对肝细胞特异性标志物甲胎蛋白、角蛋白18和色氨酸2,3-加双氧酶进行检测。结果与结论:经肝组织匀浆上清液诱导后,细胞形态发生了显著变化,随诱导时间延长梭形干细胞逐渐减少,细胞呈三角形,多角形或不规则形。肝组织匀浆上清液诱导干细胞3,5,7 d后肝细胞标志物甲胎蛋白、人细胞角蛋白18和色氨酸2,3-加双氧酶在蛋白和mRNA水平均显著高于标准对照组(P细胞能够分化为具有肝细胞特异性标记的肝样细胞,并具有部分肝细胞功能。

关键词：干细胞脐带脐血干细胞人脐带间充质干细胞诱导分化肝组织匀浆上清液肝样细胞甲胎蛋白人细胞角蛋白细胞角蛋白18 其他基金干细胞图片文章

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组织多肽特异性抗原在胃肠道肿瘤中的应用

世界华人消化杂志 2005年第16期13卷 2010-2012页

作者：卢绪菁王建华常州市肿瘤医院放疗科江苏省常州市213001

组织多肽特异性抗原(TPS)是细胞角蛋白18片段上的M3抗原决定簇,恶性上皮肿瘤患者存在细胞角蛋白18的过度表达并被释放到血清中,TPS可作为肿瘤细胞增殖活性的特异性标志物,反映上皮性肿瘤细胞在体内增殖和分裂的活性情况.研究表明血清TP... 详细信息

组织多肽特异性抗原(TPS)是细胞角蛋白18片段上的M3抗原决定簇,恶性上皮肿瘤患者存在细胞角蛋白18的过度表达并被释放到血清中,TPS可作为肿瘤细胞增殖活性的特异性标志物,反映上皮性肿瘤细胞在体内增殖和分裂的活性情况.研究表明血清TPS测定在恶性肿瘤的早期诊断、预测复发和转移、评价预后等方面有独特价值.已广泛应用于肺癌、乳腺癌、卵巢癌及宫颈癌等上皮性恶性肿瘤,本文就TPS在胃肠道肿瘤中的应用研究进展作一综述.

关键词：组织多肽特异性抗原胃肠道肿瘤上皮性恶性肿瘤肿瘤细胞增殖活性细胞角蛋白18 特异性标志物抗原决定簇 TPS 过度表达

aFGF、HGF体外诱导小鼠ESC向肝细胞定向分化及标志物研究

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胃肠病学和肝病学杂志 2014年第11期23卷 1305-1308页

作者：应佳丽王雪玲范丽娇张少艳台州学院医学院护理系浙江台州318000

目的观察酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor,a FGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)体外定向诱导分化作用及诱导后肝细胞标志物的表达水平。方法体外培... 详细信息

目的观察酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor,a FGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)体外定向诱导分化作用及诱导后肝细胞标志物的表达水平。方法体外培养小鼠ESC使其发育成拟胚体,然后加入a FGF、HGF诱导ESC定向分化成肝细胞。收集培养上清液,RIA法测定甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、白蛋白(albumin,ALB)浓度。PCR和免疫印迹法检测ALB、细胞角蛋白8(CK8)以及细胞角蛋白18(CK18)在细胞内mRNA和蛋白表达水平。结果 ESC培养5 d后发育成为拟胚体,加入不同浓度a FGF继续培养,5 d后AFP浓度降低,ALB浓度升高,与对照组相比有显著性差异。细胞内ALB、CK8及CK18表达水平明显升高。一次诱导后加入HGF,继续诱导5 d,上清液中AFP浓度降低,ALB浓度升高,具有浓度依赖性。ALB、CK8及CK18在细胞内表达升高。结论体外培养小鼠ESC,加入a FGF、HGF后可诱导其向肝细胞定向分化。肝细胞标志物AFP水平明显降低,ALB、CK8以及CK18表达水平明显升高。

关键词：酸性成纤维细胞生长因子肝细胞生长因子胚胎干细胞甲胎蛋白白蛋白细胞角蛋白8 细胞角蛋白18

非酒精性脂肪性肝病大鼠血清细胞因子CK 18-M30及FGF 21的表达及意义

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广东医学 2018年第13期39卷 1947-1950页

作者：陈诗慧毛荣军宋少英刘继洪余寿益陈增伟潘智斌佛山市中医院治未病中心广东佛山528000 佛山市中医院病理科广东佛山528000

目的检测非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠血清细胞角蛋白18 M30片段(CK 18-M30)及成纤维细胞生长因子21(FGF 21)的水平,探讨其与NAFLD的相关性。方法成年雄性SD大鼠18只,随机分为对照组(8只)和模型组(10只)。分别用基础饲料喂养和高脂饲... 详细信息

目的检测非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠血清细胞角蛋白18 M30片段(CK 18-M30)及成纤维细胞生长因子21(FGF 21)的水平,探讨其与NAFLD的相关性。方法成年雄性SD大鼠18只,随机分为对照组(8只)和模型组(10只)。分别用基础饲料喂养和高脂饲料喂养,第8周时取大鼠血液检测血清肝功能、血脂等生化指标及细胞因子CK 18-M30和FGF 21,肝脏组织采用HE染色观察脂肪变性情况并计算NAFLD活动度(NAS)积分。结果与对照组比较,模型组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、CK 18-M30及FGF 21水平均显著升高(P18-M30与总胆固醇及NAS积分呈正相关(分别为r=11.27,P细胞因子CK 18-M30水平明显升高且与肝脏NAS积分呈正相关,提示细胞因子CK 18-M30对于诊断NAFLD具有一定的价值。

关键词：非酒精性脂肪性肝病细胞角蛋白18 M30 成纤维细胞生长因子21 无创性