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作者：李天祥山东大学

学位级别：硕士

尼古丁(Nicotine)是烟草植物中一种有毒的N-杂环类化合物。烟草制品加工过程中产生的废弃物中含有大量的尼古丁,富集的尼古丁会对人体和环境造成严重伤害。相比于物理化学方法,尼古丁降解微生物能够以尼古丁作为唯一碳源和氮源生长繁殖... 详细信息

尼古丁(Nicotine)是烟草植物中一种有毒的N-杂环类化合物。烟草制品加工过程中产生的废弃物中含有大量的尼古丁,富集的尼古丁会对人体和环境造成严重伤害。相比于物理化学方法,尼古丁降解微生物能够以尼古丁作为唯一碳源和氮源生长繁殖,可实现绿色环保地降解尼古丁,应用前景广阔。本研究室前期从烟草叶片上筛选出一株米曲霉(Aspergillus oryzae 1 12822),该菌降解尼古丁的第一步反应是将尼古丁转化为脱甲基尼古丁,发现了其尼古丁 N-脱甲基酶(Nicotine N-demethylase,NND)为诱导表达型,从部分纯化NND的肽指纹谱和尼古丁诱导的转录组分析中锁定了 10种细胞色素p450单加氧酶(Cytochrome p450 monooxygenase,CYp)为候选 NND(Ao.CYps)。本论文针对A.oryzae 112822的6种NND候选基因cyp613D1(cyp2)、cyp548D3(cyp5)、cyp55A5v2(cyp8)、cyp5113A1(cyp9)、cyp620H1 和 cyp620H2及该菌基因组中仅有的细胞色素p450还原酶(Cytochrome p450 reductase,CpR)基因进行研究,主要结果为:1.候选Ao.CYps和Ao.CpR基因的异源表达及活性测定构建了大肠杆菌表达系统,对去除N端膜锚定域(N-terminal membrane anchoring domain deletion,Nd)的候选基因 Nd-cyp620H1、Nd-cyp620H2 和 Nd-Ao.cpr 进行表达,SDS-pAGE 检测发现 Nd-CYp620H1 和 Nd-CYp620H2 均以包涵体形式存在,而Nd-Ao.CpR可溶性表达于胞质中,其电子传递活性为每μg重组Ao.CpR每分钟可还原1.75 nM马心细胞色素C。同时,构建了毕赤酵母表达系统,对 cyp620H1、cyp620H2 和 Nd-Ao.cpr进行表达,Western-blot 证明了 3 种蛋白在毕赤酵母胞内表达,Nd-Ao.CpR具有电子传递活性,但未检测到CYp620H1和CYp620H2的CO结合特性和尼古丁 N-脱甲基活性,也未检测到CYp620H1已报道的ECOD(乙氧基香豆素O-去乙氧基酶)活性。进一步,在毕赤酵母中构建了蛋白质融合表达体系,研究了 6种候选Ao.CYps分别与Nd-Ao.CpR融合蛋白的表达和活性,表达于胞质的6种融合蛋白均具有电子传递活性,但未检测到CYp相关的活性。2.候选Ao.CYps基因在A.oryzae 112822菌株中的过表达以吡啶硫胺素抗性基因(pyridine thiamine resistance,ptrA)为筛选标记构建了表达质粒pBARGpE1-ptrA-Ao.cyps,经原生质体转化,成功在A.oryzae 1 12822中构建了 6种候选Ao.CYps基因的过表达菌株。qpCR检测显示6种过表达菌株的cyp2、cyp5、cyp8、cyp9、cyp620H1 和 cyp620H2 的转录水平分别为原始菌株的4.8倍、3.3倍、17.6倍、15.2倍、5.4倍和11.5倍;尼古丁降解活性结果说明CYp620H2过表达菌株具有更高的尼古丁降解效率,以24 h尼古丁降解量计算,其尼古丁降解效率比原始菌株提高了 400%。3.候选Ao.CYps基因在A.oryzae1 12822菌株中的敲除基于 CRISpR-Cas9 技术,构建了敲除质粒 pBARGpE1-sgRNA(Δcyps)-Cas9和ptrA为敲入基因的同源修复模板(Homogeneous directed repair template,HDRT)HDRT-ptr A,经原生质体转化,成功在A.oryzae1 12822中构建了 5种以ptrA替换候选 Ao.cyps 的敲除菌株。Δcyp2、Δcyp5、Δcyp8、Δcyp9 和 Δcyp620H2 敲除菌株同原始菌株的尼古丁降解活性测定结果表明:Δcyp620H2敲除菌株尼古丁降解活性几近消失,以48 h尼古丁降解量计算,其尼古丁降解效率比原始菌株降低了 91.3%。本论文在Ao.CYps和Ao.CpR基因的异源表达研究中发现,去除N端膜锚定域不会影响Ao.CpR的功能,其在原核和真核体系中均具有电子传递活性,而Ao.CYps在大肠杆菌和毕赤酵母表达系统中均检测不到活性,其异源表达及催化体系仍需进一步研究;Ao.CYps基因过表达菌株和敲除菌株同原始菌株间的尼古丁降解活性的差异证实了 CYp620H2在米曲霉112822菌株的尼古丁降解中具有重要作用,为真菌尼古丁降解酶的发掘和分子机制的阐释提供了重要的参考。

关键词：尼古丁代谢米曲霉细胞色素p450单加氧酶细胞色素p450还原酶 CRISpR-Cas9

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褐飞虱细胞色素p450单加氧酶基因CYp4CE1的克隆及表达谱

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昆虫学报 2010年第3期53卷 257-268页

作者：杨之帆刘晓黎张艳艳湖北大学生命科学学院武汉430062

为了解p450基因在褐飞虱Nilaparvata lugens适应水稻品种过程中的重要作用,利用反转录聚合酶链式反应(RT-pCR),快速扩增cDNA末端(RACE)和长距离聚合酶链式反应(LD-pCR)技术,克隆了褐飞虱4龄若虫的CYp4家族的一个p450单加氧酶基因,被命名... 详细信息

为了解p450基因在褐飞虱Nilaparvata lugens适应水稻品种过程中的重要作用,利用反转录聚合酶链式反应(RT-pCR),快速扩增cDNA末端(RACE)和长距离聚合酶链式反应(LD-pCR)技术,克隆了褐飞虱4龄若虫的CYp4家族的一个p450单加氧酶基因,被命名为CYp4CE1。该基因的全长cDNA序列(2160bp)含有一个1626bp的开放阅读框(ORF),编码541个氨基酸残基的蛋白质。通过GenBank数据库中的blastx搜索引擎进行同源性分析,结果表明CYp4CE1编码的蛋白与岸蟹Carcinus maenas的CYp4C39(GenBank登录号:JC8026)的相似性最高,两者的氨基酸序列同源性达43%;其次与热带蟑螂Blaberus discoidalis的CYp4C1(AAA27819)及黑腹果蝇Drosophilamelanogaster的CYp4C3(Np_524598)的相似性也较高,氨基酸序列同源性分别达42%。氨基酸序列比对表明该蛋白含有CYp4家族成员的所有保守特征序列,如螺旋K(E-R-p),氧结合结构域即螺旋I(AG-T),血红素结合区(pF-G--C-G-F)以及CYp4成员的特有特征序列(EVDTFMFEGHDTT)等。使用Northern杂交检测CYp4CE1随时间的表达变化,结果表明:与饲养于感虫水稻台中1号(Taichung Native1,TN1)上的若虫相比,在取食中度抗性水稻Minghui63(MH63)秧苗12,24,48,72h的各时间段的褐飞虱体内,该基因有2.1倍的过量表达且表达水平保持稳定。进一步通过Northern杂交检测该基因的组织表达特异性,结果显示:该基因在取食TN1秧苗的若虫脂肪体中表达量最高,在肠道组织及体壁中的表达水平较低;褐飞虱取食MH63秧苗24h后,该基因在体壁及脂肪体中的表达量略有上升(各约1.2倍),而在肠道组织中的表达量则大幅升高(约12倍)。肠道整体原位杂交表明,CYp4CE1在取食TN1秧苗的若虫的肠道组织及马氏管中均有本底水平的表达;若虫取食MH63秧苗后,该基因在上述肠道各区段表达水平明显增强。结果提示,在褐飞虱与水稻互作过程中CYp4CE1的重要功能之一可能是参与水稻有毒次生物质的代谢。

关键词：褐飞虱解毒酶细胞色素p450单加氧酶基因克隆表达谱水稻品种抗虫性

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基于细胞色素p450单加氧酶介导的4-甲酚氧化降解途径的天麻素生物合成

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湖南师范大学自然科学学报 2018年第4期41卷 33-40页

作者：钟贝芬杜磊李众张伟张兴旺李菁黄淑兰胡翔李盛英刘琨湖南师范大学生命科学学院省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室中国长沙410081 山东省合成生物学省级重点实验室中国科学院青岛生物能源与过程研究所中国青岛266101 湖南云恒生物科技有限公司中国长沙410005

为实现天麻素的微生物异源生产,将谷氨酸棒状杆菌中4-甲酚降解相关基因cre HIJEFD和药用植物红景天来源的尿苷二磷酸糖基转移酶基因ugt分别克隆至载体pRSFDuet-1和p ACYCDuet-1,转化大肠杆菌后获得重组菌株S1.在S1中诱导关键酶表达后,... 详细信息

为实现天麻素的微生物异源生产,将谷氨酸棒状杆菌中4-甲酚降解相关基因cre HIJEFD和药用植物红景天来源的尿苷二磷酸糖基转移酶基因ugt分别克隆至载体pRSFDuet-1和p ACYCDuet-1,转化大肠杆菌后获得重组菌株S1.在S1中诱导关键酶表达后,外源添加4-甲酚,生物转化后对产物进行定性和定量分析.最终以5mmol/L 4-甲酚为底物,重组菌株S1在30℃诱导培养48 h后转化产物中有天麻素生成,产量达到1.5 mmol/L,摩尔转化率为30.3%.本研究实现了从4-甲酚到天麻素的生物转化,可为芳烃化合物降解与天然药物分子生物合成相偶联提供新的思路,并且具有一定的产业化应用前景.

关键词： 4-甲酚天麻素芳烃生物降解生物合成细胞色素p450单加氧酶

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Rhodococcus sp.R04细胞色素p450单加氧酶多态性及CYp125的功能研究

Rhodococcus sp.R04细胞色素P450单加氧酶多态性及CYP125的功能研...

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作者：薛瑞山西大学

学位级别：硕士

细胞色素p450单加氧酶(Cytochrome p450,CYp),是一类催化单加氧反应酶的超家族,它广泛地存在于从低等的微生物到高等的哺乳动物等各种生命体中。CYp具有代谢众多生命体内源和外源性物质的功能。这类酶能表现出特殊的光谱性质,其还原态... 详细信息

细胞色素p450单加氧酶(Cytochrome p450,CYp),是一类催化单加氧反应酶的超家族,它广泛地存在于从低等的微生物到高等的哺乳动物等各种生命体中。CYp具有代谢众多生命体内源和外源性物质的功能。这类酶能表现出特殊的光谱性质,其还原态与CO结合后,能在450nm处产生特征吸收峰,这也是p450得名的缘由。Rhodococcus sp. R04基因组测序发现,Rhodococcus sp. R04中含有至少15种细胞色素p450单加氧酶,它们分别从属于13个家族,并由Cytochrome p450命名委员会予以命名,它们分别是CYp102C3、CYp116B4、CYp123A6、CYp125A18、CYp125B2、 CYp136C4、 CYp136C5p、CYp150A16、CYp152F1、CYp153A32、CYp185B1、 CYp186C1、CYp255A3、CYp255A4和CYp51B1.通过序列比对发现这15种细胞色素p450单加氧酶的总相似性仅有14.64%,但其比对结果显示所有的p450酶都具有保守的螺旋K区"EXXR"与血红素结合区"FGXGXXXCXG".系统发育分析表明,CYp125A18、CYp125B2与Rhodococcus sp.RHA1和Mycobacterium tuberculosis中的CYp为同一族群,而该族群被证实能催化cholest-4-en-3-one的27位碳原子并能进入细胞质中催化胆固醇侧链的碳原子,另外CYp125家族与pseudomonas sp的p450terp有相同的起源,此酶具有α-松油醇羟化酶活性。基因注释表明,Rhodococcus sp. R04中有两种CYp125,分别是CYp125B2和CYp125A18.我们对这两种CYp125进行了克隆、表达纯化以及相关性质的研究。结果表明,氧化态CYp125B2和CYp125A18在417.5和422nm出现特征吸收峰,还原态CYp125B2和CYp125A18与CO结合后,与氧化态的差示光谱显示它们在450和458nm会产生差示峰,这与一般的细胞色素p450单加氧酶的典型特征相同。同时运用光学滴定法测定克霉唑,硝酸益康唑,甲硝唑,酮康唑,4-苯基咪唑和4-甲基-2-苯基咪唑六种不同的唑类药物与CYp125B2和CYp125A18的相互作用,并计算Kd值,分析这几种唑类药物分别与CYp125B2和CYp125A18的结合程度,实验结果表明CYp125B2与六种唑类药物的结合程度依次是4-苯基咪唑>硝酸益康唑>克霉唑>酮康唑>4-甲基-2-苯基咪唑>甲硝唑,而CYp125A18是酮康哗>硝酸益康唑>克霉唑>4-甲基-2-苯基咪唑>甲硝唑>4-苯基咪唑。目前,我们已经发现Rhodococcus sp. R04能够在以胆固醇为唯一碳源的培养基上生长,并且能将胆固醇转化,但所生成物质的结构尚不明确。另外,据报道CYp125在降解胆固醇,类固醇等脂肪族化合物中起关键作用。我们推测Rhodococcus sp. R04中的CYp125B2和CYp125A18两种CYp125参与了Rhodococcus sp. R04降解胆固醇的途径,但它们在这一过程中的具体作用还是未知的,尚需进一步的实验证明。

关键词： Rhodococcus sp.R04 细胞色素p450单加氧酶 CYp125 胆固醇

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米曲霉112822尼古丁降解相关细胞色素P450单加氧酶和N-甲基烟酰胺...

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作者：魏蓉芙山东大学

学位级别：硕士

尼古丁又称烟碱,是茄科烟草中最主要的生物碱。在人体中,尼古丁代谢产生的N-亚硝胺类物质易诱发多种疾病,同时通过刺激烟碱乙酰胆碱受体促使中枢神经系统释放大量神经递质,具有致癌性与致瘾性;在自然界中,香烟、含烟碱农药及杀虫剂等工... 详细信息

尼古丁又称烟碱,是茄科烟草中最主要的生物碱。在人体中,尼古丁代谢产生的N-亚硝胺类物质易诱发多种疾病,同时通过刺激烟碱乙酰胆碱受体促使中枢神经系统释放大量神经递质,具有致癌性与致瘾性;在自然界中,香烟、含烟碱农药及杀虫剂等工厂肆意排放有毒残渣,其中尼古丁等杂环生物碱因难以降解而发生富集,严重污染环境且破坏生态平衡。因此,为实现尼古丁及其代谢产物的完全降解,研发高效无害的尼古丁降解新方法兼具生态效益和社会效益。尼古丁降解微生物能够以尼古丁为唯一碳源和氮源生长,在长期自然进化中形成了不同代谢机制,通过生物降解直接降低尼古丁含量。其中,细菌尼古丁代谢途径研究较为透彻,可分为以嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)为代表的吡啶途径、以恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)为代表的卩吡咯途径和以苍白杆菌(Ochrobactrum rhizosphaerae)为代表衍生于吡啶途径与吡咯途径的Vpp途径;而真菌尼古丁代谢研究颇少,仅从石膏样小孢子菌(Microsporumgypseum)、刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)、丝核隔膜真菌(pelliculariia filamentosa)和米曲霉(Aspergilusoryzae)中提出去甲基途径,并且仅报道了第一步尼古丁发生N-去甲基化生成去甲基尼古丁的反应,尼古丁完整代谢途径中关键酶基因及其催化机制尚不完全清楚。2010年本实验室基于分离自烟叶表面的尼古丁降解菌株A.oryzae 112822其尼古丁中间代谢产物的确定研究,开创性地提出一条相对完整的全新真菌去甲基降烟碱途径:尼古丁首先被N-去甲基化为去甲基尼古丁;吡咯环脱氢后自发开环,脱去一分子乙酸生成N-甲基烟酰胺(N-Methylnicotinamide,NMN);NMN吡啶环α位被羟化为2-羟基-N-甲基烟酰胺(2-Hydroxy-N-methylnicotinamide,2HNMN);经逐级水解生成2,3-二羟基吡啶(2,3-Dihydroxypyridine,2,3DHp)和琥珀酸后进入TCA循环。目前,该途径相关酶及其基因的研究尚未见报道。细胞色素 p450 单加氧酶(Cytochrome p450 monooxygenase,CYp)超家族广泛参与各界生物体内的异源毒素代谢,且烟叶细胞内的CYp82E4与人肝脏细胞中的CYp2A6、CYp2B6等均介导尼古丁的N-去甲基化,因此推测尼古丁在A.oryzae 1 12822体内的N-去甲基化同样由CYp介导。前期通过有无尼古丁诱导培养条件下的A.oryzae 112822休止细胞降解尼古丁实验,证明其尼古丁N-去甲基酶(Nicotine N-demethylase,NND)为尼古丁诱导型表达;结合肽指纹图谱分析与转录组分析,从米曲霉p450数据库中共筛选出10个NND候选基因,分别为cyp577a4、cyp613d1、cyp584e5、cyp53a13、cyp548d3、cyp55a5v2、cyp5113a1、cyp531c3、cyp620h1 和 cyp620h2。本论文针对A.oryzae 112822第一步尼古丁降解生成去甲基尼古丁的反应,对催化关键酶即NND候选基因cyp55a5v2、cyp620h1与cyp620h2以及细胞色素p450 还原酶(Cytochrome p450 reductase,CpR)基因 Ao.cpr进行序列分析,基因大小分别为1227 bp、1578 bp、1587 bp和2088 bp,含有20、23、20和26个氨基酸组成的预测N-信号肽以及3、0、2和3个预测N-糖基化位点。根据A.oryzae RIB40注释基因组(GenBank:GCA00184455.3)设计引物并在起始密码子ATG前插入Kozak序列(GCCACC)以提高转录和翻译效率,以A.oryzae 112822基因组为模板,pCR扩增获得去除预测信号肽的4个基因cyp55a5v2(1167 bp)、cyp620h1nt(1509 bp)、yp620h2nt(1527 bp)和 Ao.cpr(2010 bp)后,构建重组质粒 pYES2-cyp55a5v2、pYES2-cyp6201nt 和 pYES2-cyp620h2nt在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303中进行胞内可溶性表达,梯度离心所获微粒体沉淀 SDS-pAGE 后的 Western-blotting 检测到重组 CYp55A5v2、CYp620H1nt和CYp620H2nt的分子量分别为～45 kDa、～58 kDa和～59 kDa,分别与其理论分子量 44.3 kDa、57.8 kDa 和 58.5 kDa一致;同时构建重组质粒 ppICzαA-Ao.cpr在毕赤酵母(pichia pas

关键词：真菌尼古丁代谢米曲霉112822 细胞色素p450单加氧酶 CRISpR/Cas9 N-甲基烟酰胺羟化酶钼喋呤羟化酶

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醚类物质降解过程中的加氧酶研究进展

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环境污染与防治 2008年第4期30卷 63-66,85页

作者：李艺潇钟卫鸿陈建孟浙江工业大学生物与环境工程学院浙江杭州310032

甲基叔丁基醚(MTBE)和乙基叔丁基醚(ETBE)在水中积累,不易降解,同时MTBE具有一定的潜在致癌性。有关微生物对MTBE和ETBE等醚类物质的降解途径和机制的研究目前受到国内外研究者的广泛关注,而加氧酶的研究是其关键领域。已发现的对醚类... 详细信息

甲基叔丁基醚(MTBE)和乙基叔丁基醚(ETBE)在水中积累,不易降解,同时MTBE具有一定的潜在致癌性。有关微生物对MTBE和ETBE等醚类物质的降解途径和机制的研究目前受到国内外研究者的广泛关注,而加氧酶的研究是其关键领域。已发现的对醚类物质降解有重要作用的酶类主要有细胞色素p450单加氧酶和烷烃单加氧酶。其中细胞色素p450单加氧酶主要由eth基因或cam基因编码,而烷烃单加氧酶主要由alk基因编码。结合MTBE和ETBE的代谢途径,并就醚类物质降解和代谢过程中起关键作用的加氧酶的研究进展作了综述。

关键词：加氧酶细胞色素p450单加氧酶烷烃单加氧酶

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基于转录组测序解析草地贪夜蛾对溴氰虫酰胺的解毒代谢分子机制

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植物保护学报 2023年第3期50卷 800-811页

作者：杨媛雪王爱玉张芸张开军薛超刘怀赵鸣张建华山东省农业科学院经济作物研究所济南250100 西南大学植物保护学院重庆400715

为阐明草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda对溴氰虫酰胺的解毒代谢分子机制,通过LC50的溴氰虫酰胺诱导草地贪夜蛾3龄幼虫后,利用酶活测定和转录组测序鉴定解毒代谢相关基因,并采用实时荧光定量pCR技术对细胞色素p450单加氧酶(cytochrome p... 详细信息

为阐明草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda对溴氰虫酰胺的解毒代谢分子机制,通过LC50的溴氰虫酰胺诱导草地贪夜蛾3龄幼虫后,利用酶活测定和转录组测序鉴定解毒代谢相关基因,并采用实时荧光定量pCR技术对细胞色素p450单加氧酶(cytochrome p450 monooxygenase,p450)基因进行验证分析。结果表明,经LC50的溴氰虫酰胺处理后,草地贪夜蛾3龄幼虫体内3种解毒代谢酶活性较对照均有所升高,但仅p450活性较对照显著升高,而谷胱甘肽S-转移酶和羧酸酯酶与对照无显著差异。经LC50的溴氰虫酰胺处理后草地贪夜蛾3龄幼虫转录组中共筛选到1408个差异表达基因,其中上调表达的基因有935个,下调表达的基因有473个。药物代谢-细胞色素p450通路、药物代谢-其他酶通路及细胞色素p450对异生物质的代谢通路中有超过20个基因存在差异表达。在草地贪夜蛾转录组中筛选鉴定到121个p450基因,其中,属于CYp2、CYp3、CYp4以及Mito家簇的基因分别有9、45、58和9个,而经LC50的溴氰虫酰胺诱导后有8个p450基因上调表达,实时荧光定量pCR验证结果显示其中有6个p450基因CYp321A8、CYp6B2、CYp6B7、CYp6B5、CYp4C1及CYp4D1表达量显著上调,这些都属于与害虫抗药性相关的CYp3和CYp4家簇基因。表明p450基因CYp321A8、CYp6B2、CYp6B7、CYp6B5、CYp4C1及CYp4D1可能在草地贪夜蛾对溴氰虫酰胺的解毒代谢中发挥着重要作用。

关键词：草地贪夜蛾溴氰虫酰胺转录组解毒代谢细胞色素p450单加氧酶

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岗梅三萜氧化修饰相关CYp的功能研究

岗梅三萜氧化修饰相关CYP的功能研究

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作者：李乐广州中医药大学

学位级别：硕士

目的:岗梅(Ilex asprella)是冬青科冬青属植物,其根可入药,为我国南方地区民间常用药材。岗梅含有丰富的熊果烷型五环三萜类活性成分,具有良好的药物开发前景,因此研究岗梅五环三萜的生物合成机制,获得合成三萜所需的生物元件,将为通过... 详细信息

目的:岗梅(Ilex asprella)是冬青科冬青属植物,其根可入药,为我国南方地区民间常用药材。岗梅含有丰富的熊果烷型五环三萜类活性成分,具有良好的药物开发前景,因此研究岗梅五环三萜的生物合成机制,获得合成三萜所需的生物元件,将为通过代谢工程获得这类成分奠定重要基础。岗梅近缘植物毛冬青(Ilexpubescens)也含有类似的成分。课题组前期完成了岗梅及毛冬青的转录组测序,筛选并鉴定了多个与五环三萜生物合成下游途径相关的基因,如与三萜母核形成相关的氧化鲨烯环化酶(Oxidosqualene cyclases,OSCs)IaAS1 和 IaAS2,氧化羧化母核 C-28 位甲基的细胞色素 p450 单加氧酶(Cytochrome p450 monooxygenases,CYps)IaAO1、IaAO2、IpAO1和 IpAO2,以及细胞色素 p450 还原酶(Cytochrome p450 reductases,CpRs)IaCpR,并构建了可以合成2,3-环氧角鲨烯、熊果烷α-amyrin和齐墩果烷β-amyrin的酿酒酵母工程菌。本研究的目的是借助转录组学技术,进一步发掘岗梅、毛冬青中与五环三萜母核其它位点氧化修饰相关的CYp基因,利用酿酒酵母真核表达体系和气质联用色谱技术,对其进行功能研究。方法:1.候选CYps基因的筛选与克隆在转录组数据中检索出注释为“cytochrome p450”且FpKM值大于50的Unigene或Contig,结合功能预测和系统进化树结果,对筛选得到的候选基因序列设计引物,分别以植物cDNA为模板,pCR扩增得到目的基因片段,构建重组质粒。2.目的基因的异源真核表达和功能分析构建目的基因的真核表达载体,转化至合适的酿酒酵母工程菌中,诱导表达,利用Western blot分析重组蛋白是否表达,并用GC-MS检测重组酵母的代谢产物,鉴定基因功能。3.目的基因表达与亚细胞定位按照根、茎、叶3个部位对岗梅植株进行取材,提取RNA后定量反转录成cDNA,通过荧光定量pCR分析基因的表达模式。同时,构建含有EGFp荧光标签的植物表达载体,将目的基因转化至拟南芥原生质体中,观测目的基因的亚细胞定位。4.酿酒酵母中构建三萜生物合成途径利用CRISpR/Cas9基因编辑技术,将岗梅IaAO1、IaCpR基因以及本研究中获得的CYp基因整合至酿酒酵母中,构建稳定遗传的酵母菌株,对酵母菌株代谢产物进行GC-MS检测分析。结果:1.从岗梅转录组中筛选得到10个可能与三萜母核氧化修饰相关的CYp基因,完成了其中2个基因IaAO4和IaAO5的功能研究。IaAO4编码的蛋白可以催化五环三萜C-23 位甲基的连续氧化,将 ursolic acid 氧化生成 23-hydroxyl-ursolic acid、23-carboxyl-ursolic acid,将 oleanolic acid 氧化生成 hederagenin 和 gypsogenic acid;而IaAO5编码的蛋白则可以将β-amyrin氧化为α-Boswellic acid。另外,IaAO4和IaAO5分别经CYp命名委员会命名为CYp714E88和CYp93A220。2.与IaAO5相比,IaAO4在岗梅根、茎、叶3个部位的表达水平较高,并在根中的表达量最高。亚细胞定位结果显示2个蛋白均为膜蛋白。3.利用基因编辑技术,成功将IaCpR、密码子优化后的C-23位氧化酶基因IaAO4和C-28位氧化酶基因IaAO1引入酿酒酵母工程菌WAT11tfAX,得到酵母工程菌WAT11L。培养后,发现WAT11L代谢产生的微量化合物经GC-MS初步鉴定结构类似 hederagenin 和 23-hydroxyl-ursolic acid。4.通过同源序列比对,从毛冬青转录组数据中筛选出6个CYp基因,岗梅及毛冬青特有单一 CYp基因中具有完整开放阅读框的基因分别为1个和2个。结合当前报道的具有三萜氧化功能的CYp基因,构建系统进化树。对其中IpAO3进行功能鉴定,发现其编码的蛋白可以将α-amyrin氧化为ursolic acid,具有C-28氧化修饰功能。IpAO3经CYp命名委员会命名为CYp716A360。结论:本论文成功克隆并鉴定了 3个与五环三萜生物合成相关的CYp基因。其中,IaAO4是当前报道的第2个既参与齐墩果烷型三萜氧化也参与熊果烷型氧化的CYp,可同时以ursolic acid和oleanolic acid为底物完成C-23位甲基的连续氧化;IaAO5是首次鉴定出可以以β-amyrin为底物,发生C-24位羧化反应的CYp氧化酶;而IpAO3则是毛冬青中鉴定出的第3个C-28位CYp氧化酶,其可以α-amyrin为底物,氧化C-28位生成ursolic acid。并且,本论

关键词：岗梅三萜细胞色素p450单加氧酶 CRISpR技术毛冬青

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苹果蠹蛾和梨小食心虫p450对南果梨和苹果梨中槲皮素的分子响应

苹果蠹蛾和梨小食心虫P450对南果梨和苹果梨中槲皮素的分子响应

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作者：张世攀沈阳农业大学

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苹果蠹蛾Cydia pomonella是我国重大农业入侵害虫。前期研究表明,入侵过程中,苹果蠹蛾与同属鳞翅目卷蛾科的土著种梨小食心虫Grapholita molesta发生种间竞争。然而,关于二者种间竞争机制的认识十分有限。寄主植物的理化性质,以及不同... 详细信息

苹果蠹蛾Cydia pomonella是我国重大农业入侵害虫。前期研究表明,入侵过程中,苹果蠹蛾与同属鳞翅目卷蛾科的土著种梨小食心虫Grapholita molesta发生种间竞争。然而,关于二者种间竞争机制的认识十分有限。寄主植物的理化性质,以及不同物种对寄主植物中植物次生物质的耐受性差异,均可能会影响植食性昆虫的种间竞争。植食性昆虫-植物长期进化过程中,昆虫解毒代谢系统在应对植物次生代谢物质过程中,发挥着十分重要的作用。作为Ⅰ阶段解毒酶,细胞色素p450单加氧酶(p450)直接参与植物次生代谢物质代谢过程,但p450介导的苹果蠹蛾和梨小食心虫对植物次生物质代谢能力差异是否是两种食心虫种间竞争的分子毒理学机制尚不清楚。本研究通过两种食心虫主要寄主(南果梨、苹果梨)果实硬度、果实内主要的植物次生物质含量进行比较分析。以槲皮素为例,探讨次生代谢物质对两种食心虫生长发育以及Clan 3p450基因表达水平的影响;利用RNAi技术,沉默关键p450基因,分析两种食心虫对槲皮素的适应性变化,从分子毒理学水平为揭示苹果蠹蛾与梨小食心虫种间竞争机制提供新视角。主要研究结果如下:1.苹果蠹蛾和梨小食心虫主要寄主果实硬度调查对苹果梨和南果梨的果实硬度检测和两种食心虫的蛀果率调查。结果显示,随着果实发育逐渐成熟,两种果实硬度逐渐降低;两种食心虫的蛀果率与果实硬度均呈现负相关性,即果实硬度下降蛀果率上升;苹果蠹蛾对果实的危害程度高于梨小食心虫。2.寄主果实植物次生代谢物质含量测定及对两种食心虫生长发育的影响利用高效液相色谱(HpLC),对南果梨和苹果梨不同发育时期,以及两种食心虫危害前后,植物次生代谢物质含量变化进行检测。结果表明,果实生长发育期内,两种果实中绿原酸、表儿茶素、儿茶素、芦丁、没食子酸和异槲皮素含量呈现下降趋势;槲皮素含量先上升后下降;两种食心虫危害后,南果梨和苹果梨中除儿茶素含量无明显变化,绿原酸、表儿茶素、没食子酸、异槲皮素、芦丁和槲皮素含量升高;槲皮素含量仅在苹果蠹蛾危害后显著升高,而不受梨小食心虫危害影响。两种食心虫初孵幼虫饲喂含有不同浓度(0μg/g、10μg/g、100μg/g、1000μg/g、500μg/g)槲皮素的人工饲料,构建种群生命表。结果显示,与取食未添加槲皮素的饲料(对照)相比,取食含有槲皮素的人工饲料苹果蠹蛾世代周期(T)缩短,梨小食心虫世代周期延长;除1000μg/g槲皮素试验组外,其他浓度处理组的苹果蠹蛾产卵量均受到抑制。而取食不同浓度槲皮素的梨小食心虫单雌产卵量均显著增加;除10μg/g处理组,其余处理组的苹果蠹蛾种群内禀增长率(r)、周限增长率(λ)和净增值率(R)均低于对照组;低浓度(10μg/g和100μg/g)槲皮素处理梨小食心虫种群内禀增长率(r)、周限增长率(λ)和净增值率(R)提高,高浓度(5000μg/g)槲皮素处理则抑制种群发展。3.苹果蠹蛾和梨小食心虫p450基因对植物次生代谢物质的分子响应两种食心虫幼虫取食含有槲皮素的人工饲料,比较两种食心虫p450 Clan 3基因表达模式的差异。结果显示:经槲皮素诱导后,苹果蠹蛾(20/31个)和梨小食心虫(22/30个)p450基因的表达水平上调;取食接近果实中真实浓度(74.79μg/g)的槲皮素饲料(100μg/g)后,苹果蠹蛾中CYp6AW1、CYp6K1b、CYp9E2a和CYp345A22基因的表达水平上调4倍以上,而梨小食心虫中CYp6B74、gm＿13876和gm＿16205基因表达量上调3倍以上,CYp6A17基因表达水平上调2.9倍以上;时空表达模式分析结果显示,上述两种食心虫p450基因均在幼虫期和中肠中高表达。4.苹果蠹蛾和梨小食心虫与槲皮素代谢相关p450基因功能分析注射dsRNA后,苹果蠹蛾4龄幼虫CYp6AW1基因表达量12小时内显著下调,CYp6K1b表达量在24小时内显著下调;梨小食心虫4龄幼虫CYp6B74和gm＿13876基因在12小时内表达量水平下调。与注射ds GFp的两种食心虫相比,注射dsRNA后两种食心虫对槲皮素的适应性下降,表现为两种食心虫的体重增加量、相对生长率、食物利用率、相对取食量和食物转化率均显著降低。

关键词：苹果蠹蛾梨小食心虫种间竞争细胞色素p450单加氧酶槲皮素 RNAi

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人类甾类激素加工酶CYp7B1的纯化制备与互作网络

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科学通报 2021年第22期66卷 2878-2886页

作者：简立艳张庆陈阳曹禹上海交通大学医学院附属第九人民医院上海精准医学研究院上海200125 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心/生物化学与细胞生物学研究所上海200031

细胞色素p450单加氧酶CYp7B1是位于内质网上的跨膜蛋白,其重要功能是催化胆固醇骨架7位的羟化反应,产生多种重要甾类分子,包括7α羟基-脱氢表雄酮和7α羟基孕烯醇酮等.CYp7B1基因突变造成的功能异常可引起多种疾病,如遗传性痉挛性截瘫... 详细信息

细胞色素p450单加氧酶CYp7B1是位于内质网上的跨膜蛋白,其重要功能是催化胆固醇骨架7位的羟化反应,产生多种重要甾类分子,包括7α羟基-脱氢表雄酮和7α羟基孕烯醇酮等.CYp7B1基因突变造成的功能异常可引起多种疾病,如遗传性痉挛性截瘫和先天性胆汁酸合成障碍等.为了解人类CYp7B1蛋白的结构与功能,我们对其进行了重组表达与纯化,发现其在去垢剂DDM、DM、NM、OM中均能稳定存在并结合有氧化还原辅因子铁卟啉.利用纯化CYp7B1进行的亲和介质拉取-质谱分析发现,CYp7B1可以与另一种还原酶CYpOR发生相互作用,随后的体外互作分析证实了这一发现.在此基础上,通过重组共表达体系和体外组装方式的筛选实现了CYp7B1-CYpOR蛋白质复合物的纯化制备.本研究成功地进行了跨膜单加氧酶CYp7B1的纯化,并且发现内质网可能存在一个涉及CYp7B1和其他氧化还原酶的催化复合物,还进一步实现了CYp7B1-CYpOR复合物的纯化制备.

关键词：细胞色素p450单加氧酶内质网膜蛋白甾类合成氧化还原酶复合物

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