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细胞色素酶p450 4Z1催化月桂酸区域选择性的理论研究

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细胞色素酶P450 4Z1催化月桂酸区域选择性的理论研究

作者：张超天津医科大学

学位级别：硕士

目的:细胞色素酶p450(Cytochrome p450,CYp)作为一种非常重要的催化剂在人体代谢过程中占据极为重要的地位,它能够参与包括羟基化反应在内的多种代谢过程,是药物药代动力学和反应变异性的主要来源。人类中的CYp酶依据序列的相似性分类... 详细信息

目的:细胞色素酶p450(Cytochrome p450,CYp)作为一种非常重要的催化剂在人体代谢过程中占据极为重要的地位,它能够参与包括羟基化反应在内的多种代谢过程,是药物药代动力学和反应变异性的主要来源。人类中的CYp酶依据序列的相似性分类。细胞色素酶p450 4(Cytochrome p450,CYp 4)家族是人类第二大CYp家族,除CYp 4F8、CYp 4F12、CYp 4X1和CYp 4Z1外,大多数CYp 4酶都是ω-羟化酶。CYp 4Z1是CYp4家族的一个新成员,是目前研究甚少的“孤儿”细胞色素酶之一,它的过表达会促进乳腺癌的发生,并且与某些癌症的治疗及预后不良有关,是癌症治疗的潜在药物靶标。月桂酸在各种癌症的治疗和术后康复的调节中起着重要作用。据报道,月桂酸的链内羟基化由细胞色素CYp 4Z1催化,但其催化机理尚不清楚。本文通过理论计算探究CYp4Z1催化月桂酸的区域选择性特征,为研究其他CYp 4酶家族的催化机理提供理论指导。方法:首先使用量化计算方法确定月桂酸末端七个潜在催化位点的夺氢能垒,确定反应物与过渡态的结构,通过添加色散校正计算确定弱相互作用的影响。使用同源建模构建确定人类CYp 4Z1的三维模型并对其进行优化,使用Saves程序对优化后的模型进行打分以确定是否适合接下的计算。确定建模的最优模型后进行分子对接,以确定月桂酸与野生型CYp 4Z1的最佳结合构象。通过设置F313A突变体的存在探究突变对分子对接结果的影响并确定月桂酸与突变型CYp 4Z1的最佳结合构象。随后对比二者产生相互作用关键氨基酸。对比二者的最佳结合构象。设置含有F313A突变体系的四个经典分子动力学模拟体系,通过长达400 ns的模拟探究CYp 4Z1催化月桂酸的动态过程。使用增强采样模拟研究芳香族氨基酸在稳定底物过程中的作用,寻找CYp 4Z1催化月桂酸的最佳通路。最后使用ONIOM计算方法比较不同位点CYp 4Z1-月桂酸复合物结构的自由能。结果和结论:基于血红素和月桂酸模型的量化计算表明,潜在的羟基化位点的夺氢能垒范围为56.2至85.1 k J/mol,其中ω-4位点的能垒最低。分子对接的结果表明活性位点附近的Ser383,Ser113,Arg487通过与月桂酸形成氢键维持月桂酸在活性位点的稳定性。分子动力学模拟结果表明,血红素平面与π-π相互作用形成的共同相互作用促使ω-4位点更靠近活性氧,这与实验观察结果是一致的。当参与形成π-π相互作用的phe313突变为Ala313后,对催化选择性的影响消失。结合自由能分析表明,CYp 4Z1活性位点周围的芳香族氨基酸和极性氨基酸对催化选择性起着重要作用。基于野生型和突变型体系的二级结构分析和主成分分析的结果显示催化过程中活性位点附近的phe313的存在会促使远离活性位点的结构发生改变以适应催化体系能量的变化。通道分析表明芳香族氨基酸的门控作用。增强采样模拟探究phe313和Trp120如何影响复合物体系的能量,确定CYp 4Z1催化月桂酸ω-4位点的可行性通路。ONIOM计算方法计算确定催化ω-4位点的复合物体系自由能要小于催化ω位点体系的自由能。

关键词：细胞色素酶p450 分子动力学模拟增强采样模拟 QM/MM

细胞色素酶p450 1A2表型分析及其应用价值

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实用医学杂志 2008年第5期24卷 871-872页

作者：刘哲王祥瑞上海交通大学附属仁济医院麻醉科 200001

在人的肝脏中，细胞色素酶p4501A2（CYplA2）占整个细胞色素酶p450的15％。不仅许多药物如茶碱、氯氮平、奥美拉唑、咖啡因、非那西丁，内生性底物（如褪黑激素和雌二醇）和环境中有害物质的代谢等主要是通过CYplA2，

关键词：细胞色素酶p450 p4501A2 表型分析价值奥美拉唑非那西丁有害物质褪黑激素

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重组细胞色素酶p450 3A4表达和鉴定

药物生物技术 2012年第5期19卷 381-385页

作者：柳艾姣石磊方方赵树进南方医科大学广东广州510515 广州军区广州总医院广东广州510010

细胞色素酶p450是代谢内源性物质和外源性物质的重要的酶,在药物治疗和药物开发领域以及了解潜在的毒性物质和致癌性物质的代谢机制起决定性作用。旨在构建细胞色素酶p450 3A4的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化得到CYp3A4蛋白。用逆转... 详细信息

细胞色素酶p450是代谢内源性物质和外源性物质的重要的酶,在药物治疗和药物开发领域以及了解潜在的毒性物质和致癌性物质的代谢机制起决定性作用。旨在构建细胞色素酶p450 3A4的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化得到CYp3A4蛋白。用逆转录-聚合酶链反应方法从人肝脏总RNA中得到CYp3A4的cDNA,然后直接插入pMD20-T Vector中,将测序正确的N-末端和C-末端进行修饰。然后利用双酶切插入到表达载体pET-28a-c(+)Vectors,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达。并通过定点突变的方法获得CYp3A4亚型p467S(CYp3A4*19)。采用SpSS13.0设计4因素2水平正交实验,对α-ALA(0.5 mmol/L和1 mmol/L)、IpTG(0.5 mmol/L和1 mmol/L)、卡那霉素(50μg/mL和100μg/mL)添加浓度及菌的接种密度(接种1%和接种2%)进行优化。并用SpSS13.0对结果进行分析,选择出比较好的组合进行下一步的大规模的诱导表达。经定点突变的方法成功获得了CYp3A4*19亚型。经IpTG诱导获得CYp3A4蛋白,并通过Western blot验证。用BCA蛋白浓度定量分析试剂盒测定的膜蛋白浓度在65μg/mL左右,α-ALA、抗生素(卡那霉素)、T7启动子诱导剂IpTG及接种密度高低两水平中对膜蛋白的表达水平的影响没有统计学意义。

关键词：重组细胞色素酶细胞色素酶p450 3A4 表达纯化 N-末端修饰 C-末端修饰

单氨基酸替换引起的细胞色素酶p450功能改变的研究

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单氨基酸替换引起的细胞色素酶P450功能改变的研究

作者：王雨方上海交通大学

学位级别：硕士

细胞色素酶p450(CYp)超家族是一类含有血红素且成员众多,作用广泛的重要代谢酶。在人体内,细胞色素酶p450更是扮演着重要的角色,其功能包括许多内源性物质的合成以及外源性物质的代谢等。由于细胞色素酶p450可以代谢大约90%临床使用的药... 详细信息

细胞色素酶p450(CYp)超家族是一类含有血红素且成员众多,作用广泛的重要代谢酶。在人体内,细胞色素酶p450更是扮演着重要的角色,其功能包括许多内源性物质的合成以及外源性物质的代谢等。由于细胞色素酶p450可以代谢大约90%临床使用的药物,所以细胞色素酶p450基因的多态性是不同个体之间对药物的反应和代谢不同的重要影响因素。因此,预测人体内中由非同义单核苷酸多态性所引起的单氨基酸替换对人类细胞色素酶p450功能改变对于人们认识不同个体对药物有不同反应的原因起着重要的作用,同时该预测也能为针对不同个体的个性化药物开发提供帮助。在本研究中,我们将使用支持向量机与遗传算法相结合的方法构建一个预测模型。该模型能够同时基于酶和底物的物理化学性质和结构性质预测由非同义单核苷酸多态性引起的九种在人体中目前已知pDB结构的主要细胞色素酶p450的功能改变,这九种人体内的重要细胞色素酶p450包括CYp1A2、CYp2A6、CYp2A13、CYp2B6、CYp2C8、CYp2C9、CYp2D6、CYp2E1和CYp3A4。此外,我们基于氨基酸索引发展出一种方法来计算两种蛋白质描述符。与氨基酸索引相比,我们发展出的这种蛋白质描述符可以更全面地体现出单氨基酸替换对酶的影响。经过多轮的特征筛选,五种蛋白质描述符和八种底物小分子描述符被选择用于最终模型的构建。交叉验证结果显示本文的最终模型可以达到88.1%的预测准确率,93.1%的预测敏感性以及72.7%的预测特异性,与以往的功能改变预测模型相比本模型在考虑了结构信息和底物小分子性质的同时具有相对较高的预测准确率。综上所述,我们构建的最终模型可以协助非同义单核苷酸多态性对酶功能影响的分析,在深入实验之前,我们可以获得一个未知单氨基酸替换是否会引起酶功能改变的初步信息。

关键词：单氨基酸替换细胞色素酶p450 支持向量机遗传算法蛋白质功能改变

以混合探针药的方法评价白藜芦醇对人体细胞色素酶p450活性的影响

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中国临床药理学与治疗学 2020年第4期25卷 426-432页

作者：吴俏玉袁洪陆瑶中南大学湘雅三医院心内科湖南长沙410013 中南大学湘雅三医院临床药理中心湖南长沙410013

目的:采用混合探针法研究白藜芦醇对人细胞色素酶p450五种亚型CYp1A2、CYp2D6、CYp2C9、CYp3A4和CYp2C19的影响。方法:采用随机对照研究,将26名男性健康受试者随机分为安慰剂组和白藜芦醇组,分别予以口服安慰剂/白藜芦醇每次1 g,每日一... 详细信息

目的:采用混合探针法研究白藜芦醇对人细胞色素酶p450五种亚型CYp1A2、CYp2D6、CYp2C9、CYp3A4和CYp2C19的影响。方法:采用随机对照研究,将26名男性健康受试者随机分为安慰剂组和白藜芦醇组,分别予以口服安慰剂/白藜芦醇每次1 g,每日一次,连续服药14 d,再口服咖啡因、氯沙坦、奥美拉唑、右美沙芬和咪达唑仑五种探针药物,采集不同时间的血样,检测咪达唑仑、咖啡因、奥美拉唑三种探针药物的血药浓度。并收集0~8 h尿液,记录尿量,检测氯沙坦及右美沙芬的代谢速率。比较两组之间的药代动力学差异。结果:与对照组相比,白藜芦醇组CYp1A2的探针药物咖啡因AUC0-12、AUC0-∞、Cmax分别增加32.10%(ppp=0.004),同时T1/2也显著增加(p=0.002);CYp2C19的探针药物奥美拉唑和CYp3A4的探针药物咪达唑仑的药代动力学参数AUC0-12、AUC0-∞、T1/2和Cmax均未见显著改变(p>0.05);CYp2C9探针药物右美沙芬与其代谢产物去甲右美沙芬比率(DTM/DT)的比率增加了79.91%(p=0.003);CYp2D6探针药物氯沙坦与其代谢产物E-3174的比率(losartan/E-3174)增加了531.34%(pp1A2、CYp2D6和CYp2C9的酶活性,而对CYp3A4和CYp2C19的酶活性无显著影响。

关键词：白藜芦醇细胞色素酶p450 药代动力学 “Cocktail”探针药物法药物相互作用

艾司西酞普兰抗抑郁疗效与细胞色素酶p450 2C19基因及5-羟色胺转运体基因多态性关联性分析

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临床精神医学杂志 2018年第5期28卷 312-315页

作者：赵蓓李国海章皎洁李一云孙雪镇江市精神卫生中心江苏212000

目的:探索艾司西酞普兰抗抑郁疗效与细胞色素酶p450 2C19基因(CYp2C19)及5-羟色胺转运体基因(5-HTTLpR)多态性关联性。方法:给予51例抑郁症患者艾司西酞普兰10～20 mg/d单药治疗4周;以治疗前后汉密尔顿抑郁量表24项(HAMD-24)减分率> 50... 详细信息

目的:探索艾司西酞普兰抗抑郁疗效与细胞色素酶p450 2C19基因(CYp2C19)及5-羟色胺转运体基因(5-HTTLpR)多态性关联性。方法:给予51例抑郁症患者艾司西酞普兰10～20 mg/d单药治疗4周;以治疗前后汉密尔顿抑郁量表24项(HAMD-24)减分率> 50%为有效。应用聚合酶链反应技术检测CYp2C19基因、5-羟色胺转运体基因(5-HTTLpR)多态性,并分析其与艾司西酞普兰有效性的关系。结果:CYp2C19及5-HTTLpR各基因型间艾司西酞普兰治疗的有效率比较差异无统计学意义(χ2=0. 166,p=1. 000;χ2=2. 000,p=0. 217); CYp2C19各基因型患者的不良反应发生率比较差异有统计学意义(χ2=16. 115,p p=0. 009)和病程(B=-0. 170,p=0. 011)相关。结论:CYp2C19、5-HTT基因多态性不影响艾司西酞普兰抗抑郁的疗效。

关键词：抑郁症艾司西酞普兰细胞色素酶p450 2C19 5-羟色胺转运体基因多态性

1α，25-二羟维生素DB3B对HepG2细胞中细胞色素p450酶同工酶3A4的诱导作用

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中华肝脏病杂志 2008年第3期16卷 220-223页

作者：李爽缪晓辉南京医科大学第一附属医院感染病科 210029 第二军医大学长征医院感染科上海

目的观察1α，25-二羟维生素DB3B[1α，25（OH）***3B1对HepG2细胞中细胞色素p450酶同工酶3A4（CYp3A4）的诱导特点，为药物代谢研究建立简便高效的细胞模型提供依据。方法选取3个浓度的1α，25（OH）B2BDB3B（0．10、0．25、0．35μmol... 详细信息

目的观察1α，25-二羟维生素DB3B[1α，25（OH）***3B1对HepG2细胞中细胞色素p450酶同工酶3A4（CYp3A4）的诱导特点，为药物代谢研究建立简便高效的细胞模型提供依据。方法选取3个浓度的1α，25（OH）B2BDB3B（0．10、0．25、0．35μmol／L）加入HepG2细胞中，分别在培养24、48、72、96h时，以四甲基偶氮唑盐法观察细胞活性，RT-pCR法检测CYp3A4mRNA的表达，Western blot检测CYp3A4蛋白的表达。结果3个浓度的1α，25-（OH）B2BDB3B对HepG2细胞无毒性作用。未经1α，25（0H）B2BDB3s诱导的HepG2细胞CYp3A4mRNA的表达很低，3个浓度的1α，25（OH）B2sDB粥在诱导的第24小时未见到CYp3A4mRNA表达增高；在48h，3个处理组的CYp3A4mRNA表达量分别是对照组的120％、134％、200％；72h达174％、254％、420％；96h为258％、450％、370％。未经诱导的HepG2细胞CYp3A4蛋白的表达很低，在3个浓度下，诱导后的第24小时未见到CYp3A4蛋白表达的增高；在48h，0．10umol／L组未观察到诱导表达增加，0．25μmol／L组和0．35μmol／L组诱导倍数分别为1．2和2．2；72h各浓度处理组诱导倍数分别达1．8、3．4和6．5；96h分别为4．1、6．1、7．2。结论 1α，25-（OH）B2B DB3B可以较好的诱导HepG2细胞中CYp3A4在转录水平和蛋白质表达水平的表达，可应用于CYp3A4酶被抑制导致的药源性肝损害或其他毒性和不良反应的研究。

关键词：药物毒性细胞色素酶p450 1α,25二羟维生素DB3 HepG2细胞

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人类细胞色素酶p4502J2的研究进展

中国药理学通报 2004年第12期20卷 1321-1324页

作者：罗晨辉周宏灏中南大学临床药理研究所湖南长沙410078

多年来 ,对细胞色素酶p4 5 0的研究主要集中在其代谢外源性药物和毒物的方面。然而它在内源性物质 ,如类固醇、胆固醇、激素、脂肪酸和维生素等的代谢转化中也起了很重要的作用。CYp2J就是这样一种主要代谢内源性物质花生四烯酸的细胞... 详细信息

多年来 ,对细胞色素酶p4 5 0的研究主要集中在其代谢外源性药物和毒物的方面。然而它在内源性物质 ,如类固醇、胆固醇、激素、脂肪酸和维生素等的代谢转化中也起了很重要的作用。CYp2J就是这样一种主要代谢内源性物质花生四烯酸的细胞色素酶p4 5 0超家族。人体内的CYp2J2在不久前被发现 ,它与疾病的相关性正引起研究者广泛的兴趣。本文就人类CYp2J2的组织分布、生理作用、编码基因及其基因突变等方面的研究进展作一简要综述。

关键词：细胞色素酶p450 CYp2J2 EETs

细胞色素酶p4501A1(CYp1A1)与免疫性疾病关系的研究进展

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感染．炎症．修复 2017年第2期18卷 120-124页

作者：周晓英田李星黄祺梁华平第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042 西南医科大学基础医学院四川泸州646000

细胞色素酶p450是一组含铁血红素超家族,因还原型p450与一氧化碳具有特殊的亲和力,二者的复合物在分光光度计的450nm处有特异吸收峰而得名.p450有三大家族：CYp1、CYp2、CYp3,是内源性、外源性物质转化酶系的主要成员.CYp1的亚家族CYp1A... 详细信息

细胞色素酶p450是一组含铁血红素超家族,因还原型p450与一氧化碳具有特殊的亲和力,二者的复合物在分光光度计的450nm处有特异吸收峰而得名.p450有三大家族：CYp1、CYp2、CYp3,是内源性、外源性物质转化酶系的主要成员.CYp1的亚家族CYp1A1能够代谢和活化多种环境致癌和致突变物质,多年来一直是生物医药和毒理学的研宄热点.CYp1A1可催化代谢多环芳烃类（pAHs）、

关键词：细胞色素酶p450 免疫性疾病 CYp1A1 分光光度计致突变物质多环芳烃类一氧化碳环境致癌