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副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素的细胞毒性研究

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畜牧兽医学报 2011年第12期42卷 1750-1755页

作者：陈西王湘如徐晓娟郭凤娟陈焕春蔡旭旺华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070

本研究旨在原核表达副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT),并作用于猪髋动脉内皮细胞(Pig iliac endothelial cells,PIEC),以研究其细胞毒性。根据本实验室完成的副猪嗜血杆菌SH 0165株(血清5型)全基因组序列... 详细信息

本研究旨在原核表达副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT),并作用于猪髋动脉内皮细胞(Pig iliac endothelial cells,PIEC),以研究其细胞毒性。根据本实验室完成的副猪嗜血杆菌SH 0165株(血清5型)全基因组序列,针对cdtA、cdtB和cdtC基因序列设计引物,扩增的基因片段大小分别约为681、834和531bp。将靶基因克隆到原核表达载体pET28a中,再转化到*** BL21(DE3),IPTG诱导表达3h,SDS-PAGE和Western blot检测证实表达产物以包涵体形式存在,大小分别约36、34和28ku。通过体外重构毒素与PIEC细胞作用3h,继续培养72h观察细胞形态学变化。结果表明,CdtABC全毒素致PIEC细胞膨胀、空泡形成、细胞凋亡等,而其他试验组变化不显著。结果提示,CDT毒素可能在细菌感染与致病中发挥着重要作用。

关键词：副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素毒素细胞毒性

副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素各亚基处理PK-15细胞的基因表达谱分析

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中国预防兽医学报 2015年第5期37卷 371-374页

作者：牛惠李艳玲周泷李大鹏张艳禾李刚谢芳王春来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150001

为研究副猪嗜血杆菌(***)细胞致死膨胀毒素(CDT)各亚基(Cdt A、Cdt B和Cdt C)的相关生物学功能,本研究采用基因芯片技术对以CDT各亚基处理的PK-15细胞基因表达谱进行检测和分析。通过比较各亚基处理细胞与空白对照细胞基因表达谱的检测... 详细信息

为研究副猪嗜血杆菌(***)细胞致死膨胀毒素(CDT)各亚基(Cdt A、Cdt B和Cdt C)的相关生物学功能,本研究采用基因芯片技术对以CDT各亚基处理的PK-15细胞基因表达谱进行检测和分析。通过比较各亚基处理细胞与空白对照细胞基因表达谱的检测结果显示,Cdt A、Cdt B和Cdt C作用PK-15细胞后,处理细胞中分别有91个基因、126个基因及135个基因出现差异表达变化。根据芯片结果选取变化较显著的基因进行荧光定量RT-PCR验证,结果与基因芯片检测结果基本一致。基因注释(GO)分析表明,这些蛋白分别参与免疫系统调节、生物调控、代谢过程和定位等过程。本研究结果为进一步研究CDT的致病作用机制奠定了基础。

关键词：副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素表达谱基因芯片

副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素细胞毒性机制研究

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副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素细胞毒性机制研究

作者：牛惠中国农业科学院

学位级别：硕士

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,***)是引起副猪嗜血杆菌病的病原,该病主要表现为多发性浆膜炎、关节炎及脑膜炎。细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT)是***的重要毒力因子,由CdtA、CdtB和CdtC 3个亚基组成。为研究... 详细信息

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,***)是引起副猪嗜血杆菌病的病原,该病主要表现为多发性浆膜炎、关节炎及脑膜炎。细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT)是***的重要毒力因子,由CdtA、CdtB和CdtC 3个亚基组成。为研究副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素(HpCDT)对宿主细胞的毒性作用,本研究以猪肺泡巨噬细胞(PAM)和PK-15细胞为模型,运用流式细胞术、激光共聚焦、免疫印迹、荧光定量PCR等方法进行毒素与细胞的互作研究。通过Predsi、Signal-Blast和Signal-3L软件预测CdtA,CdtB和CdtC的信号肽,结果显示其信号肽分别为N端1-19aa、1-21aa和1-19aa。去掉信号肽后成功地以可溶形式表达了3种重组蛋白。纯化的CdtB在体外能够剪切环状或线性DNA,表明其具有DNase活性;在体内纯化的CdtB能够诱导PK-15细胞产生γ-H2A.X,说明其具有DNase活性,并引起了DNA双链断裂。经流式细胞仪分析重组蛋白处理的细胞周期和凋亡情况,结果表明单独的CdtB能够引起PAM和PK-15细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡,而在CdtA或/和CdtC的帮助下能够更显著地增强这种作用。进一步研究结果表明CDT全毒素能够引起最显著的细胞膨胀、细胞周期阻滞和细胞凋亡。Pifithrin-α和CDT共同处理PK-15细胞能够明显地抑制其细胞凋亡,说明CDT诱导的凋亡是p53依赖的。通过基因表达谱芯片分析各亚基的细胞毒性,显示各亚基作用于细胞均有大量的基因表达发生变化。总之,本研究成功地以可溶形式纯化了去掉信号肽的HpCDT的3个亚基,CdtB在体内体外均具有DNase活性,单独的CdtB能够引起细胞周期阻滞和凋亡,CdtA和CdtC能够增强其细胞毒性,3个亚基共同作用能够发挥最大毒性,CDT介导的凋亡是p53依赖的。

关键词：副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素细胞周期细胞凋亡 p53

副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素的致病性研究及cdt基因缺失突变株的筛选

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副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素的致病性研究及cdt基因缺失突变株...

作者：陈西华中农业大学

学位级别：硕士

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, H. parasuis)属于革兰氏阴性菌,是猪革拉瑟氏病(Glasser's disease)的病原体。其主要导致猪纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。然而,该病的致病机制仍不清楚。细胞致死膨胀毒素(Cytolethal dis... 详细信息

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, H. parasuis)属于革兰氏阴性菌,是猪革拉瑟氏病(Glasser's disease)的病原体。其主要导致猪纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。然而,该病的致病机制仍不清楚。细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin, CDT)是20世纪80年代末期发现的细菌毒素之一,该毒素由CdtA、CdtB和CdtC3个亚基组成,引起真核细胞DNA双链断裂,导致细胞周期的不可逆性阻滞或者靶细胞凋亡。H. parasuis SH0165株基因组含有编码CDT的cdtABC基因簇,具有同其它菌CDT相似的功能,但还没有其体内功能的研究。鉴于该毒素的特殊功能,而H. parasuis危害严重且没有毒力因子得到直接的鉴定。因此,很有必要对该基因对动物的致病性进行研究。本研究以H. parasuis SH0165菌株cdtABC基因簇为研究对象,体外重构CDT,通过细胞毒性试验、模型动物和本动物试验及构建cdt基因缺失突变株分析该毒素在H. parasuis感染与致病中的作用。主要研究内容如下：***的原核表达及活性检测：根据NCBI公布的H. parasuis SH0165株全基因组序列,设计特异性引物扩增cdt基因,克隆到原核表达载体pET28a,并转化E. coli BL21(DE3),成功表达CDT。将CDT与猪髋动脉内皮细胞(PIEC)共孵育后,导致细胞膨胀甚至死亡。体外研究结果表明原核表达CDT具有生物活性。***致豚鼠组织损伤：为了研究CDT在体内的功能,我们将该毒素按5mg的剂量腹腔注射豚鼠,并在注射后1d、2d、3d、4d和5d剖杀豚鼠,观察病理变化,同时取病变明显的肝脏和脾脏制备组织切片。结果显示在注射后3d剖杀豚鼠,肝脏和脾脏肉眼可见纤维素性渗出。组织切片结果显示注射后3d肝脏和脾脏细胞膨胀,被膜水肿,被膜附着物脱落,实质细胞凋亡,组织溶解。***致CD猪死亡和组织损伤：为了研究CDT对本动物的致病性,我们按10mg和20mg的剂量腹腔注射CD猪,同时取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑制备组织切片。结果发现20mg CDT致猪死亡,剖检呈现典型的革拉瑟氏病的病理变化：心包积液,大量的胸水和腹水,肺脏纤维素性渗出并与胸壁粘连,肝脏纤维素性渗出并与腹壁粘连等;而10mg CDT不致猪死亡,剖检发现仅在腹腔有少量的纤维素性渗出。组织切片结果显示20mg CDT致动物各脏器细胞变性肿胀,被膜增宽,随着细胞凋亡被膜脱落及组织形成空洞等,而10mg致病作用相对较弱。体内试验结果表明CDT是H. parasuis的毒力因子之一。***基因缺失突变株的筛选：根据NCBI公布的H. parasuis SH0165株基因组序列,设计特异性引物扩增cdt基因上下游同源臂,利用Overlapping PCR成功将上下游同源臂连接。将同源臂经双酶切后克隆到温度敏感质粒pSHK4TS,并电转到H. parasuis SH0165株。经过一轮筛选,获得cdt基因的单交换菌株,筛选了大约5000个CFU仍没有得到cdt基因缺失突变株。目前该工作仍在进行。本研究从体内和体外两方面证实了CDT是H. parasuis引起猪多发性浆膜炎的主要毒力因子之一,这为阐明该菌的致病机制奠定了基础。目前,cdt基因的敲除工作仍在进行,该工作的完善将有助于进一步阐述CDT在细菌致病机制中的作用。

关键词：副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素细胞实验动物试验基因敲除

副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素与宿主细胞互作蛋白的筛选与鉴定

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副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素与宿主细胞互作蛋白的筛选与鉴定

作者：李晓月黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,***)是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)嗜血菌属的革兰氏阴性菌,早期定植在猪的上呼吸道,当宿主遭受环境迫害或免疫力下降时,它会扩散到肺部并导致肺炎,甚至进入血液循环并侵入多个组织,引起全身性格... 详细信息

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,***)是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)嗜血菌属的革兰氏阴性菌,早期定植在猪的上呼吸道,当宿主遭受环境迫害或免疫力下降时,它会扩散到肺部并导致肺炎,甚至进入血液循环并侵入多个组织,引起全身性格拉瑟氏病(Glsser’s Disease),多为纤维性多发性浆膜炎,关节炎和脑膜炎等症状,疾病的爆发对全球养殖者造成了一定影响。细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT)是***的重要毒力因子,由亚基CdtA、CdtB、CdtC组成。为了解副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素(HpCDT)与宿主细胞相互作用机制,本研究以PK-15细胞为模型,应用酵母双杂交的方法筛选宿主细胞相互作用蛋白。(1)构建酵母双杂交cDNA文库:提取PK-15细胞的总RNA,运用SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA,再将纯化后的ds cDNA与pGADT7-Rec共转化至Y187酵母感受态细胞,在SD/-Leu营养缺陷培养平板上筛选培养,收集PK-15细胞的酵母cDNA文库。经检测,文库滴度达到了7.5×10～7 CFU/mL,插入的双链cDNA片段范围为300～2000 bp,片段平均大小为500 bp。基本符合构建文库的要求,可用于与HpCDT不同亚基蛋白相互作用的蛋白筛选。(2)构建诱饵质粒:以PCR方法扩增cdtA,cdtB,cdtC基因片段,定向克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,利用PEG/LiAc法将空载体pGBKT7及重组载体转化至Y2H Gold酵母感受态细胞,用筛选培养基检测其毒性和自激活活性。双酶切及测序验证正确,成功构建pGBKT7-CdtA,pGBKT7-CdtB,pGBKT7-CdtC诱饵载体;转化产物涂布于SD/-Trp中,空载体pGBKT7及重组载体上酵母数量,大小无明显差异,证明重组载体对其无毒性;转化产物涂布于SD/-Trp,SD/-Trp/X-α-gal平板上,有菌落生长,涂于SD/-Trp/X-α-gal/AbA,无菌落生长,证明重组载体对酵母菌种无自激活活性。成功构建酵母双杂交载体pGBKT7-cdtA,pGBKT7-cdtB及pGBKT7-cdtC,证明其无毒性和自激活活性,为进一步筛选与PK-15细胞文库相互作用蛋白奠定基础。(3)Mating方法筛库及点对点验证:肾上皮细胞(PK-15)cDNA文库构建好的诱饵载体pGBKT7-cdtA,pGBKT7-cdtB,pGBKT7-cdtC进行酵母双杂交筛选,并将杂交液部分涂布到SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp营养缺陷型平板上,观察菌落的生长状态;剩余的杂交液全部涂布到SD/-Leu/-Trp/X-α-gal/AbA营养缺陷型平板上,筛选相互作用的阳性菌落,筛选到的阳性菌落克隆到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal/AbA营养缺陷型平板上进行再筛选,重复在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal/AbA营养缺陷型平板上筛选一次,对筛选到的阳性菌落提取质粒,并进行扩大培养,送测序及BLAST分析,最终初步筛选到5种与CdtA相互作用的蛋白,经过回复性验证,分别为线粒体核糖体蛋白S26(MRPS26)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、DNA甲基化结合蛋白3(MBD3)、屏蔽自整合因子1(BANF1)、核糖体蛋白L32(RPL32)。

关键词：副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素酵母双杂交互作蛋白的筛选

伴放线放线杆菌产生的细胞致死膨胀毒素及其与牙周病的关系

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国外医学（口腔医学分册） 2005年第6期32卷 458-460页

作者：孟姝吴亚菲杨禾四川大学华西口腔医院牙周科四川成都610041

伴放线放线杆菌能产生一种热不稳定蛋白——细胞致死膨胀毒素。该毒素主要由三个相邻的基因编码,分别为cdtA,cdtB,cdtC,对应的蛋白产物分别是CDTA,CDTB,CDTC,它们构成三聚体的全毒素。它能引起细胞体积膨胀,使细胞停滞在G2/M周期而不能... 详细信息

伴放线放线杆菌能产生一种热不稳定蛋白——细胞致死膨胀毒素。该毒素主要由三个相邻的基因编码,分别为cdtA,cdtB,cdtC,对应的蛋白产物分别是CDTA,CDTB,CDTC,它们构成三聚体的全毒素。它能引起细胞体积膨胀,使细胞停滞在G2/M周期而不能进入分裂期,通过线粒体途径导致淋巴细胞凋亡,诱导细胞因子的合成和分泌。由于该毒素具有多种细胞毒性,在牙周炎的发生发展中可能具有重要的致病作用。

关键词：细胞致死膨胀毒素伴放线放线杆菌牙周炎

细胞致死性扩张毒素和外膜蛋白的结构功能和致病机制

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国际口腔医学杂志 2016年第5期43卷 565-568页

作者：孙菲张建刚肖水清滨州医学院口腔学院正畸教研室滨州256603 济南市口腔医院正畸科济南250001

伴放线放线杆菌是青少年牙周病的主要致病菌,与侵袭性牙周炎密切相关。伴放线放线杆菌细胞致死性扩张毒素(CDT)和外膜蛋白(OMP)等毒力因子使其更易定植到宿主体内,破坏宿主的免疫调节,从而进一步引起牙周组织破坏和加速牙周病的进展。... 详细信息

伴放线放线杆菌是青少年牙周病的主要致病菌,与侵袭性牙周炎密切相关。伴放线放线杆菌细胞致死性扩张毒素(CDT)和外膜蛋白(OMP)等毒力因子使其更易定植到宿主体内,破坏宿主的免疫调节,从而进一步引起牙周组织破坏和加速牙周病的进展。本文主要就CDT和OMP毒力因子目前的结构功能及致病机制作一综述,以期对其深入研究有所帮助。

关键词：伴放线放线杆菌细胞致死膨胀毒素外膜蛋白

临床分离胥伐成格隆沙门菌的抗菌药物敏感性和毒力基因研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2016年第8期36卷 582-587页

作者：刘晓霞夏琳林张成龙郇娟师伟吴晓妹张利娟韩双羽杨杰赵展王玉宝天津医科大学第二医院感染性疾病研究所 300211

目的：研究临床分离胥伐成格隆沙门菌的抗菌药物敏感性和毒力基因特征,为防治感染和了解其流行趋势提供依据。方法收集2014年5月至10月我院肠道门诊急性腹泻患者的临床资料,采集患者粪便标本进行沙门菌分离培养、生化鉴定、血清型分型,... 详细信息

目的：研究临床分离胥伐成格隆沙门菌的抗菌药物敏感性和毒力基因特征,为防治感染和了解其流行趋势提供依据。方法收集2014年5月至10月我院肠道门诊急性腹泻患者的临床资料,采集患者粪便标本进行沙门菌分离培养、生化鉴定、血清型分型,对鉴定得到的胥伐成格隆沙门菌进行抗菌药物敏感性检测、脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型和多位点序列分型（MLST）,PCR扩增沙门菌毒力岛SPI1-5代表性基因和调节基因、毒力质粒基因和细胞致死膨胀毒素（ CDT ）基因,对cdtB、pltA和pltB的扩增产物进行序列分析。结果共检测到108株非重复非伤寒沙门菌,其中16株（14.8%）为胥伐成格隆沙门菌。16株胥伐成格隆沙门菌对氟喹诺酮、氨苄西林、头孢曲松、复方新诺明等11种常用抗菌药物敏感率为100%,PFGE分型结果为A克隆14株、B克隆1株和C克隆1株, A克隆中有8例患者有明确的共同饮食来源,提示为感染暴发；16株胥伐成格隆沙门菌MLST分型均为ST241型,SPI1-5代表性基因invA、sitC、hilA、sseL、sifA、mgtC、siiE、sopB和调节基因phoP以及CDT基因cdtB、pltA和pltB均阳性,毒力质粒基因pefA、prot6E、spvB均为阴性；本研究中的胥伐成格隆沙门菌CDT基因与伤寒沙门菌相应基因的DNA和氨基酸序列相似均大于97%。结论本研究分离到多克隆ST241型胥伐成格隆沙门菌临床株,虽对常用抗菌药物尚保持敏感,但携带SPI1-5毒力基因和伤寒毒素CDT基因,应关注胥伐成格隆沙门菌临床感染在我国的变化趋势和危害,开展持续监测和研究。

关键词：胥伐成格隆沙门菌脉冲场凝胶电泳多位点序列分型抗菌药物敏感性沙门菌毒力岛细胞致死膨胀毒素

空肠弯曲杆菌CDT诱导上皮细胞焦亡的作用机制研究

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空肠弯曲杆菌CDT诱导上皮细胞焦亡的作用机制研究

作者：顾嘉运华中农业大学

学位级别：硕士

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）是世界上引起细菌性食源性胃肠炎的主要病原菌之一,每年可至少造成9,600万例肠道感染。细胞致死膨胀毒素（Cythlethal distending toxin,CDT）是空肠弯曲杆菌分泌的一种外毒素,同时也是重要的毒力... 详细信息

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）是世界上引起细菌性食源性胃肠炎的主要病原菌之一,每年可至少造成9,600万例肠道感染。细胞致死膨胀毒素（Cythlethal distending toxin,CDT）是空肠弯曲杆菌分泌的一种外毒素,同时也是重要的毒力因子,但具体致病机理尚不清楚。本研究以人肠上皮细胞HCT116和FHC作为研究对象,通过构建空肠弯曲杆菌CDT缺失株和表达CDT重组蛋白,利用流式细胞术、CCK-8、彗星实验、Western blot、免疫荧光和CRISPR/Cas9等方法在细胞水平上探究空肠弯曲杆菌CDT对肠上皮细胞的致病性及其具体机制,为揭示空肠弯曲杆菌的致病机理提供理论依据。研究结果主要有以下三个方面:1、空肠弯曲杆菌CDT具有细胞毒性作用免疫荧光结果显示,CDT全毒素以及野生株菌体蛋白作用HCT116和FHC细胞后,可观察到DNA双链断裂标志物γH2AX,而CDT单个亚基以及缺失株菌体蛋白没有该效应,确定CDT能引起细胞DNA损伤。彗星实验结果也显示CDT全毒素以及野生株菌体蛋白作用后能观察到细胞核有明显的拖尾,表明发生了DNA损伤。CCK-8结果也发现CDT全毒素以及野生株菌体蛋白均能显著降低细胞活力,表明CDT对HCT116和FHC细胞具有毒性作用。2、空肠弯曲杆菌CDT诱导上皮细胞焦亡检测细胞焦亡相关特征指标（细胞形态学变化、GSDMD切割、GSDME切割、培养上清LDH释放量和凋亡/焦亡细胞比例）发现,CDT作用可使细胞出现明显的气泡样结构（焦亡的典型特征）,培养上清LDH释放量升高,凋亡/焦亡细胞比例升高,表明CDT可明显诱导HCT116和FHC细胞发生焦亡,且呈剂量和时间依赖性;另一方面,通过GSDME敲除和GSDMD干扰发现GSDME敲除后CDT诱导的焦亡明显受到抑制,而GSDMD干扰后则无明显变化,说明CDT诱导的细胞焦亡是GSDME依赖型,并不依赖于GSDMD。3、CDT通过ROS/caspase-9/caspase-3/GSDME通路诱导细胞焦亡无论是使用Z-DEVD-FMK化学抑制caspase-3活性,还是使用si RNA敲低caspase-3的表达,GSDME的切割以及CDT致焦亡的特征均被明显抑制,说明caspase-3在切割GSDME诱导焦亡过程中发挥了作用。而且CDT刺激后检测到了caspase-9而非caspase-8的活化,敲低caspase-9能明显抑制GSDME切割及caspase-3活化。另外,在作用过程中,CDT能明显提高细胞内ROS水平升高,清除细胞内ROS能明显抑制CDT诱导的细胞焦亡以及caspase-9/3的活化。表明了CDT通过ROS/caspase-9/caspase-3/GSDME通路诱导细胞焦亡。综上所述,我们的研究首次发现了CDT能引起上皮细胞焦亡并探究出发挥作用的具体信号通路。这不仅加深了我们对空肠弯曲杆菌致病机理的了解,也充实了我们对CDT致病机制的认识。

关键词：空肠弯曲杆菌细胞致死膨胀毒素细胞焦亡 GSDME 细胞死亡