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新生小鼠Sca-1+心脏干细胞分离、培养、鉴定及生理特性的研究

新生小鼠Sca-1+心脏干细胞分离、培养、鉴定及生理特性的研究

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作者：韦静广西医科大学

学位级别：硕士

研究背景:目前临床上治疗缺血性心脏病的常规方法包括:药物改善临床症状、内科介入或外科冠脉搭桥手术改善心肌的血液供应。近几年,人们开始探索干细胞移植修复受损心肌的可能性和治疗方法,尤其是心脏原位干细胞。已有研究证实,Sca-1心... 详细信息

研究背景:目前临床上治疗缺血性心脏病的常规方法包括:药物改善临床症状、内科介入或外科冠脉搭桥手术改善心肌的血液供应。近几年,人们开始探索干细胞移植修复受损心肌的可能性和治疗方法,尤其是心脏原位干细胞。已有研究证实,Sca-1心脏干细胞是心脏中数量最多的干细胞类型。无论是在体外还是动物体内,它都能够被诱导分化成为自主跳动的心肌细胞,而其他类型的心脏干细胞(例如c-kit心脏干细胞)经诱导后则更较偏向于分化成为血管内皮细胞。由此可见,Sca-1心脏干细胞在心脏干细胞类型中最接近于心肌源性。虽然目前已经能够从动物或人类的心脏组织中成功分离获取Sca-1心脏干细胞,通过细胞移植的动物实验可以观察到Sca-1心脏干细胞对心肌修复的促进作用和对心脏功能的改善作用。但是,Sca-1心脏干细胞的获取和培养方法目前尚未成熟,人们对于Sca-1心脏干细胞生理特性的了解也还远远不足以将其应用到临床治疗上。研究目的:1.分离获取新生小鼠Sca-1心脏干细胞,对细胞进行鉴定、体外培养和扩增。2.对小鼠Sca-1心脏干细胞表面标志物及心肌特异性标记物进行研究。研究方法:1.将出生7天以内的新生昆明小鼠的心脏剪碎成组织块,用0.25%胰蛋白酶+0.1%Ⅱ型胶原酶反复消化。经组织块法培养10-14天后,结合细胞免疫磁珠法对Sca-1心脏干细胞进行阳性分选。分选后的细胞使用CGM条件培养液进行培养。分选前及经分选纯化后通过流式细胞术的方法分别测定细胞中Sca-1心脏干细胞的含量。2.对分选后的细胞通过流式细胞术的方法测定CD31、CD34及c-kit等干细胞相关的表面抗原的表达情况。3.对分选后的细胞通过细胞免疫荧光染色的方法进行表面抗原Sca-1和心肌特异性标记物Nkx-2.5和GATA-4表达的测定。研究结果:1.分选前Sca-1心脏干细胞的含量较低,仅占全部细胞比例的5.44%,经细胞磁珠分选后传至第三代的细胞其Sca-1心脏干细胞的含量占全部细胞比例的86.73%。显微镜下可见分选后的第一代Sca-1心脏干细胞生长缓慢,大约10天左右融合可达80%,细胞形态不一,细胞形态以梭形及三角形为主,聚集生长。传代后的细胞可在CGM条件培养液中快速增殖,大约6-7天后可再次进行细胞传代。2.通过流式细胞术对细胞表面标志物CD31、CD34及c-kit进行检测,结果显示:细胞不表达CD31和CD34,低表达c-kit(表达率为4.78%)。3.通过细胞免疫荧光染色的方法对传代后的细胞进行检测,结果显示:免疫荧光显微镜下可见几乎所有细胞都表达FITC-Sca-1的绿色荧光,几乎所有细胞都同时表达PE-Nkx-2.5的红色荧光和FITC-GATA-4的绿色荧光。研究结论:1.采用组织块培养结合细胞免疫磁珠分选的方法,能够从新生昆明小鼠的心脏中获取数量可观的、高纯度的Sca-1心脏干细胞。使用CGM条件培养液对分选后的Sca-1心脏干细胞进行培养,细胞可稳定传代并保持干细胞特性。第一代细胞生长速度较慢,传代后的细胞可快速增殖。2.小鼠Sca-1心脏干细胞不表达干细胞表面抗原CD31和CD34,能够排除血管内皮干细胞和造血干/祖细胞来源的可能性。细胞低表达干细胞表面抗原c-kit,其与c-kit心脏干细胞可以通过不同的细胞表面标志物从同一个体的心脏组织中分别分选获取。3.Sca-1心脏干细胞同时表达心肌特异性标记物Nkx-2.5和GATA-4,为心肌源性的心脏干细胞,具有向心肌细胞分化的潜能。

关键词：缺血性心脏病心脏干细胞干细胞抗原1 细胞磁珠分选流式细胞术细胞免疫荧光染色

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