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基于细胞生物固相法探讨玉屏风散抗肿瘤的物质基础

基于细胞生物固相法探讨玉屏风散抗肿瘤的物质基础

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作者：丁慧南京中医药大学

学位级别：硕士

目的:建立肝癌细胞(Hepa1-6小鼠肝癌细胞)和免疫细胞(RAW264.7巨噬细胞和C57小鼠脾细胞)的固相细胞色谱方法,解析玉屏风散中具有直接杀伤肝癌细胞和通过免疫促进发挥抗肝癌的效应物质;并应用体外相对应细胞增殖实验验证所得准活性成分... 详细信息

目的:建立肝癌细胞(Hepa1-6小鼠肝癌细胞)和免疫细胞(RAW264.7巨噬细胞和C57小鼠脾细胞)的固相细胞色谱方法,解析玉屏风散中具有直接杀伤肝癌细胞和通过免疫促进发挥抗肝癌的效应物质;并应用体外相对应细胞增殖实验验证所得准活性成分的药理活性,从细胞的层面来研究玉屏风散中起到抗肝癌作用的物质基础,为进一步阐明玉屏风散抗肝癌的作用机制和拓展应用于抗肿瘤奠定基础。方法:采用HypersilODS分析柱,水-乙腈为流动相梯度洗脱,检测波长220nm,柱温30 ℃,进样量5μL,流速为1 mL/min,建立玉屏风散水煎液的HPLC指纹图谱及质控标准,作为玉屏风水煎液与Hepa1-6小鼠肝癌细胞、RAW264.7巨噬细胞、脾细胞结合成分分析的基础。建立Hepa1-6小鼠肝癌细胞、RAW264.7巨噬细胞,C57小鼠脾细胞固相细胞色谱方法:采用过滤灭菌法处理玉屏风散水煎液,并将药液与细胞孵育1h,D-hank's(pH7.2)缓冲液洗脱4次去除未结合药液成分,加解离液使细胞失活后释放与细胞特异性结合的成分,再将细胞裂解,释放进入细胞内的准活性成分。应用HPLC/MS对解离液和裂解液中的准活性成分进行分析。最后采用MTT法检测准活性成分对三种细胞增殖的影响。结果:建立了玉屏风散水煎液HPLC指纹图谱及质控标准,得到10批玉屏风散水煎液的对照指纹图谱和共有峰15个,其中5号色谱峰为升麻素苷、6号色谱峰为毛蕊异黄酮苷、7号色谱峰为升麻素、8号色谱峰为5-O-甲基维斯阿米醇苷、10号色谱峰为补骨脂素、11号色谱峰为毛蕊异黄酮、12号色谱峰为亥茅酚苷、13号色谱峰为芒柄花黄素、15号色谱峰为苍术酮,在各自范围内线性关系良好(r>0.9997),平均加样回收率97.91%～99.81%,RSD 0.58%～1.27%;含量测定结果显示,可将升麻素苷、毛蕊异黄酮苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、补骨脂素、毛蕊异黄酮、亥茅酚苷、芒柄花黄素、苍术酮分别的平均含量356.03 μg/mL、378.05 μg/mL、216.32μg/mL、458.96 μg/mL、82.06 μg/mL、116.34 μg/mL、165.18 μg/mL、91.14 μg/mL、51.40 μg/mL作为玉屏风散水煎液的质控标准。应用Hepa1-6小鼠肝癌细胞固相色谱法,筛选得到11个准活性成分,其中与细胞膜结合的成分有补骨脂素、芒柄花黄素、芒柄花黄素苷、亥茅酚苷,进入细胞内的有7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷、苯内氨酸、苍术内酯、芒柄花黄素、芒柄花黄素苷、黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、毛蕊异黄酮、补骨脂素、苍术酮。应用RAW264.7巨噬细胞固相色谱法,筛选得到11个准活性成分,其中与细胞膜结合的成分有升麻素苷、苍术酮、槲皮素、白术内酯Ⅲ、补骨脂素,进入细胞内的有腺苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、4'-O-葡萄糖基-5-O-甲基齿阿米醇、黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、苍术酮、升麻素苷。应用C57小鼠脾细胞固相色谱法,筛选得到10个准活性成分,其中与细胞膜结合的成分有升麻素苷、腺苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮,进入细胞内的成分有槲皮素、腺苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、异黄芪苷Ⅰ、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、芒柄花黄素、芒柄花黄素苷。药理学验证实验结果显示:补骨脂素、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素和亥茅酚苷可直接抑制Hepa1-6小鼠肝癌细胞的增殖,由这4个成分组成的混合物可明显抑制Hepa1-6小鼠肝癌细胞的增殖;毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷、腺苷、升麻素苷以及补骨脂素均可促进RAW264.7巨噬细胞的增殖;芒柄花黄素及腺苷可明显促进C57小鼠脾细胞增殖。结论:1)建立的玉屏风散水煎液HPLC指纹图谱方法,简便、重复性好;对毛蕊异黄酮、5-0-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷等9个成分建立的质控标准,经方法学考察表明,稳定可靠,可应用于玉屏风散水煎液的质控。2)建立Hepa1-6小鼠肝癌细胞、RAW264.7巨噬细胞、C57小鼠脾细胞生物固相法,筛选出玉屏风散水煎液中特异性结合和进入三种细胞的准活性成分分别有11个、11个、10个,并对准活性成分进行药理实验验证,初步确定了玉屏风散水煎液中毛蕊异黄酮、补骨脂素、芒柄花黄素和亥茅酚苷可直接抑制Hepa1-6小鼠肝癌细胞的增殖;毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、升麻素苷、补骨脂素、黄芪甲苷、及腺苷可促进RAW264.7巨噬细胞的增殖;芒柄花黄素及腺苷可促进C57小鼠脾细胞增殖。

关键词：细胞生物固相法玉屏风散水煎液指纹图谱含量测定 Hepa1-6 RAW264.7 脾细胞

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