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聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法

中国组织工程研究 2022年第4期26卷 553-559页

作者：何云影李玲婕张舒淇李雨舟杨生季平重庆医科大学口腔医学院重庆市401147 重庆医科大学附属口腔医院重庆市401147 口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室重庆市401147 重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室重庆市401147

背景:细胞球三维培养模型在组织工程领域应用前景广泛,但使用商品化超低吸附培养板进行细胞球培养的实验成本较高,因此需探寻一种细胞球成形的替代策略,推动细胞球在相关研究领域的应用。目的:采用琼脂糖和聚丙烯酸模具,并利用层层自组... 详细信息

背景:细胞球三维培养模型在组织工程领域应用前景广泛,但使用商品化超低吸附培养板进行细胞球培养的实验成本较高,因此需探寻一种细胞球成形的替代策略,推动细胞球在相关研究领域的应用。目的:采用琼脂糖和聚丙烯酸模具,并利用层层自组装技术构建细胞球三维培养模型,部分模拟细胞体内生存的微环境。方法:体外培养小鼠前体成骨细胞,依次使用明胶与海藻酸钠对小鼠前体成骨细胞进行层层自组装处理(层层自组装-小鼠前体成骨细胞),同时分别制备明胶包裹与海藻酸钠包裹的小鼠前体成骨细胞。分别制备琼脂糖凝胶涂层培养板与琼脂糖凝胶微孔板,观察上述不同处理的细胞在两种培养板中的成球效果,采用Live/Dead染色法检测细胞球的活性,采用碱性磷酸酶染色法、RT-PCR实验检测细胞球的成骨能力。结果与结论:(1)光学显微镜下可见,在琼脂糖凝胶涂层孔板中,未经处理与经3种涂层处理的小鼠前体成骨细胞均未成球;在琼脂糖凝胶微孔板中,未经处理与层层自组装处理的小鼠前体成骨细胞形成了理想的细胞球,其中层层自组装-小鼠前体成骨细胞球的直径大于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P 细胞球内的细胞活性高于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P 细胞球的碱性磷酸酶活性高于未经处理小鼠前体成骨细胞球(P 细胞球(P 0.05);(4)结果表明,采用琼脂糖凝胶结合层层自组装技术成功建立了细胞球三维培养模型,此方法便捷、经济、高效且细胞活性良好,保留了细胞成骨分化能力,在骨组织工程和再生医学领域具有潜在应用价值。

关键词：细胞球三维培养琼脂糖小鼠前体成骨细胞层层自组装细胞活性骨组织工程

基于微阵列培养的药物肝毒性评价细胞球模型的建造与模药测评

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中国临床药理学杂志 2023年第4期39卷 558-562页

作者：陈佳敏姚香草苏华龙陈宗正魏文博许重远南方医科大学南方医院临床药学中心广东深圳518035 南方医科大学药学院国家药品监督管理局药物代谢研究与评价重点实验室&广东省新药筛选重点实验室广东广州510515 深圳大学第一附属医院广东深圳518035

目的通过微阵列培养,构建由人肝癌HepG2细胞和人永生化肝星状LX-2细胞组成的药物肝毒性评价细胞球模型,采用临床上常用有肝毒性药和保肝药对此模型进行功能性验证和测评。方法设置不同接种条件,在微阵列中构建由HepG2细胞和LX-2细胞... 详细信息

目的通过微阵列培养,构建由人肝癌HepG2细胞和人永生化肝星状LX-2细胞组成的药物肝毒性评价细胞球模型,采用临床上常用有肝毒性药和保肝药对此模型进行功能性验证和测评。方法设置不同接种条件,在微阵列中构建由HepG2细胞和LX-2细胞组成的细胞球,通过图像处理软件(Image J)评价细胞球的圆度、致密度和直径,筛选出细胞球的最佳接种条件。用细胞增殖检测试剂盒检测细胞球活性,用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测细胞球肝功能相关基因表达,用活死细胞双荧光染色及活性检测评价对乙酰氨基酚对细胞球的毒性作用,用谷草转氨酶(GOT)测试盒检测经甘草酸和硫普罗宁处理后的肝损伤细胞球上清液中GOT的含量。结果细胞球理想接种条件为每微孔500个细胞,细胞比例为HepG2-LX-2=2∶1,圆度为0.84±0.04,致密度为(9.64±0.05)×10^(-1),直径为(175±7)μm,细胞球存活率保持稳定。随培养时间延长,肝特异性标志物白蛋白(ALB)、载脂蛋白(APOB)、谷胱甘肽S转移酶A(GSTA1)mRNA表达升高。细胞球活性随对乙酰氨基酚浓度升高而下降,诱导肝损伤的浓度为20 mmol·L^(-1)。与对照组相比,1 mmol·L^(-1)甘草酸使GOT表达降低55%,10 mmol·L^(-1)硫普罗宁则降低了33%。结论建立药物肝毒性评价细胞球模型在长期培养中功能保持稳定,与传统模型相比,在评价肝毒性方面具有特定的优势,有助于保肝药物的筛选。

关键词：肝毒性肝损伤细胞球共培养

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3D培养细胞球快速石蜡切片方法建立及应用

中国比较医学杂志 2022年第8期32卷 57-61页

作者：冯珊珊金毅娄东晓魏孟超谢泳娇王汝仙李静广东东阳光药业有限公司广东东莞523871 深圳市药品检验研究院(深圳市医疗器械检测中心) 深圳518057

目的建立一种适合于三维(3D)细胞培养模型的、简便快速的石蜡切片技术及其染色方法,为更便捷、快速地制作3D细胞切片并观察培养模型形态、功能,开展应用研究提供病理技术平台。方法利用超低吸附培养板将HepG2细胞或/和LX-2细胞培养成3D... 详细信息

目的建立一种适合于三维(3D)细胞培养模型的、简便快速的石蜡切片技术及其染色方法,为更便捷、快速地制作3D细胞切片并观察培养模型形态、功能,开展应用研究提供病理技术平台。方法利用超低吸附培养板将HepG2细胞或/和LX-2细胞培养成3D细胞球,制作石蜡切片,并进行HE染色、免疫组化染色和免疫荧光染色检测细胞球组织形态和蛋白表达。结果建立了适用于3D细胞培养模型的快速石蜡切片方法,制作的切片细胞球结构完整、细胞界限清楚,抗原活性良好,进行HE染色、免疫组化染色和免疫荧光染色能准确检测3D细胞球的形态结构,蛋白表达和分布。结论该快速石蜡切片方法的建立,丰富了3D细胞培养模型研究手段,可促进其在基础研究,转化医学和药物研发中的应用。

关键词： 3D培养细胞球类器官石蜡切片

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体外培养的神经干细胞球的超微结构

解剖学报 2003年第6期34卷 615-619页

作者：郑志竑胡建石陈文列林玲钟秀容林建银福建医科大学分子医学研究中心福州350004 福建医科大学电镜室福州350004

目的　探讨体外培养的神经干细胞球的超微结构。　方法　采用常规透射电镜结合硝酸镧示踪染色、红染色和单宁酸染色等技术 ,观察体外培养的大鼠脑神经干细胞球的超微结构。　结果　神经球中细胞之间连接较为松散 ,不存在紧密连接结构 ... 详细信息

目的　探讨体外培养的神经干细胞球的超微结构。　方法　采用常规透射电镜结合硝酸镧示踪染色、红染色和单宁酸染色等技术 ,观察体外培养的大鼠脑神经干细胞球的超微结构。　结果　神经球中细胞之间连接较为松散 ,不存在紧密连接结构 ,神经干细胞增殖活跃 ,并可见神经球中有部分干细胞分化为具有突起和轴突样结构的细胞 ,甚至出现髓鞘样结构。　结论　揭示了体外培养的神经干细胞球的超微结构。

关键词：神经干细胞细胞球体外培养超微结构

间充质干细胞/脐静脉内皮细胞球成骨过程中隧道纳米管对线粒体调控β-catenin的影响研究

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间充质干细胞/脐静脉内皮细胞球成骨过程中隧道纳米管对线粒体调...

作者：何云影重庆医科大学

学位级别：硕士

研究背景:隧道纳米管（Tunneling nanotubes,TNTs）是一种管状细胞间结构,可将两个细胞物理连接起来共享细胞器、病毒、钙离子、蛋白等细胞质成分,从而进行细胞间直接通讯,最终改变相连细胞的命运。以往研究多关注于TNTs的传递作用以及... 详细信息

研究背景:隧道纳米管（Tunneling nanotubes,TNTs）是一种管状细胞间结构,可将两个细胞物理连接起来共享细胞器、病毒、钙离子、蛋白等细胞质成分,从而进行细胞间直接通讯,最终改变相连细胞的命运。以往研究多关注于TNTs的传递作用以及其在生理、病理过程中的意义,然而如何基于其作用对TNTs加以实际应用仍缺乏更深层次的研究。间充质干细胞（MSCs）作为骨组织工程领域中经典的种子细胞之一,在分化过程中需要充足的能量供给,而细胞的能量代谢则主要是通过线粒体来实现的。以往研究表明TNTs作为线粒体跨细胞转运的通道之一,可将外源性线粒体递送至MSCs胞内。内皮细胞（ECs）在增殖过程中,线粒体生物发生增加,线粒体的融合和分裂也更频繁,因此ECs胞内线粒体含量充足,可作为理想的外源性线粒体来源。综上所述,我们提出一种假设,即利用TNTs将内皮细胞中的线粒体转移至间充质干细胞中从而改善其细胞功能可能是一种潜在的刺激其成骨分化的方法。目的:1、利用MSC/EC细胞球共培养研究模型,构建球体内部MSC和EC之间的TNTs转运通道;2、验证基于异种细胞间的TNTs通道,可以实现自EC向MSC的线粒体转运;3、评价TNTs介导的线粒体转运对MSCs和ECs的细胞功能的影响,并初步探索其潜在的作用机制。方法:采用间充质干细胞/人脐静脉内皮细胞（MSC/HUVEC）细胞球作为研究模型,研究TNTs的应用和潜在作用机制。1、TNTs的表征:鬼笔环肽染色用于标记细胞间TNTs结构,激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy;LSCM）下进行细胞间结构三维重建;场发射扫描电镜（Field emission scanning electron microscopy;FE-SEM）直接观察细胞间的连接结构;CD31免疫荧光染色用于特异性标记脐静脉内皮细胞,鬼笔环肽染色标记TNTs,LSCM观察其在细胞间的准确定位;PKH26细胞膜染色标记MSC,重组GFP腺病毒感染标记HUVEC,三维重建技术进一步验证TNTs的精确定位。2、线粒体在MSC和HUVEC间的转运:使用线粒体定位的重组腺病毒感染其中一种细胞,重组GFP腺病毒标记另一种细胞,LSCM观察线粒体在HUVEC和MSC之间的运动轨迹,并进行方向验证;线粒体膜电位实验被用于检测线粒体转运对细胞状态的影响;MSC与摄取了生物小分子材料的HUVEC进行共培养,使用LSCM进行观察,拓展验证TNTs转运小分子材料的能力。3、验证TNTs对细胞功能的影响,及潜在的机制初步研究:实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测MSCs成骨相关基因I型胶原蛋白（COL-I）和Runt相关转录因子2（RUNX2）的表达情况;碱性磷酸酶（ALP）染色检测TNTs对细胞球成骨活性的影响;Matrigel血管生成实验检测HUVECs的血管生成能力;利用蛋白质免疫印迹法（Western Blot,WB）和免疫荧光染色技术进一步检测成骨相关的蛋白β-catenin和RUNX2蛋白总量和细胞内亚定位的改变。结果:1、本实验成功构建了MSC/HUVEC细胞球共培养模型,LSCM三维重建和FE-SEM结果证明了MSC和HUVEC间三维立体的TNTs网络的存在。2、LSCM荧光共定位结果表明线粒体在MSC和HUVEC间的转运是双向发生的,同时TNTs介导的线粒体转运对线粒体膜电位具有维持作用,当TNTs被阻断后细胞球线粒体膜电位显著下降（p＜0.05）;荧光共定位结果显示预先通过细胞摄取进入HUVECs胞内的外源性生物小分子材料部分出现在MSCs胞内,证明TNTs可作为小分子材料在细胞间直接递送的通道,当TNTs被阻断后MSCs和小分子材料的共定位明显减弱。3、Real-time PCR结果表明,当TNTs存在时MSCs中成骨相关基因COL-I和RUNX2明显上调（p＜0.05）;ALP染色结果也再次证明TNTs的存在能有效维持细胞的成骨活性;Matrigel血管生成实验结果表明TNTs的存在能维持HUVECs的增殖活性,并能促进其成血管效果;Western Blot结果表明,当TNTs的形成被阻断时共培养细胞球中β-catenin和RUNX2的蛋白总量显著下降（p＜0.05）;免疫荧光染色结果表明,当TNTs的形成被阻断时β-catenin和RUNX2在MSCs胞内的亚细胞定位也发生了显著改变。结论:本实验成功构建了MSC/HUVEC共培养细胞球及MSC和HUVEC之间的TNTs转运通道,为线粒体从HUVEC转移至MSC构建了一条“高速公路”,从而改善了MSC的成骨能力和HUVEC的成血管能力,并初步探索了TNTs介导的线粒体转运对细胞功能的影响有可能是通过β-cate

关键词： TNTs 线粒体细胞功能 β-catenin 细胞球

基于细胞球模型研究细胞在三维水凝胶中的集群迁移行为

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基于细胞球模型研究细胞在三维水凝胶中的集群迁移行为

作者：左新钢浙江大学

学位级别：硕士

细胞迁移作为生理学和病理学的重要过程同时也是细胞的基本功能之一,与血管形成、肿瘤转移、胚胎发育以及免疫应答等众多生理过程息息相关。考虑到细胞所处的体内环境是一个三维环境,并且细胞的迁移不仅受到环境的影响还会受到来自其他... 详细信息

细胞迁移作为生理学和病理学的重要过程同时也是细胞的基本功能之一,与血管形成、肿瘤转移、胚胎发育以及免疫应答等众多生理过程息息相关。考虑到细胞所处的体内环境是一个三维环境,并且细胞的迁移不仅受到环境的影响还会受到来自其他细胞的影响,因此对细胞迁移的研究十分重要。但是,3D细胞迁移的研究需要设计合适的模型,以尽可能地模拟细胞在体内的真实迁移过程,从而为设计能更好应用于组织工程的生物材料提供理论基础。本文构建了细胞球模型研究其在不同复合水凝胶中的迁移行为,并通过在水凝胶中制备孔道结构来简单模拟血管形成过程。首先制备了双键修饰的透明质酸(HA-MA)和凝血酶(Thrombin)交联的纤维蛋白原(Fg)复合而成的水凝胶。通过调节各组分的比例得到三种水凝胶:F50(HA-MA:Fg:Thrombin=50:75:75)、F100(HA-MA:Fg:Thrombin=100:50:50)和 F150(HA-MA:Fg:Thrombin=150:25:25)。再利用复合水凝胶对ECs、SMCs和ECs-SMCs三种细胞球进行封装并观察细胞球在不同水凝胶中迁移范围的大小。实验结果表明F10 0水凝胶中的细胞球具有较快的迁移速率,并且ECs-SMCs共培养细胞球在F100水凝胶中迁移速率最高、迁移距离最长。此外,通过Anti-CD44、游离RGD、Anti-N钙黏蛋白和GM6001等抑制剂的使用能使细胞在水凝胶中的迁移距离降低,说明细胞在水凝胶中的迁移受到了细胞-材料与细胞-细胞相互作用的影响。PCR的测试结果也表明F100水凝胶中的ECs-SMCs细胞球可以更好地抵抗细胞凋亡,并且与ECs或SMCs细胞球相比更能促进血管生成。因此可以通过这种研究细胞三维迁移的模型更好地模拟体内组织再生的真实情况。在此基础上,结合ECs-SMCs共培养细胞球和F100水凝胶进一步研究影响体外血管形成的因素。利用纯透明质酸水凝胶作为对照组。通过带微针的模具在两种水凝胶中形成孔道结构,分别得到:T-HA-MA和T-F100,同时为了水凝胶便于脱模保证孔道结构的完整性,采用明胶处理模具的微针表面形成一层明胶膜。研究结果表明纤维蛋白的存在使ECs-SMCs共培养细胞球在T-F100水凝胶上能进行更好地铺展,并且明胶作为脱模剂会粘附在水凝胶孔道内壁上从而增加细胞对孔壁的粘附性。利用这种模型研究影响体外血管化的因素并为制备能够更好进行血管化的生物材料提供借鉴意义。

关键词：三维细胞迁移细胞球水凝胶孔道结构血管化

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胰腺癌细胞球的培养及其生物学特性的研究

胰腺癌细胞球的培养及其生物学特性的研究

作者：宫伟强华中科技大学

学位级别：硕士

目的肿瘤干细胞理论的提出为认识肿瘤提供了新的思路,越来越多的肿瘤干细胞已经得到分离和鉴定;本文旨在应用无血清培养基分离胰腺癌细胞球,并检测其miR-590-3p的表达。方法运用无血清培养基克隆培养ASPC-1,PANC-1细胞,检测其自我更新... 详细信息

目的肿瘤干细胞理论的提出为认识肿瘤提供了新的思路,越来越多的肿瘤干细胞已经得到分离和鉴定;本文旨在应用无血清培养基分离胰腺癌细胞球,并检测其miR-590-3p的表达。方法运用无血清培养基克隆培养ASPC-1,PANC-1细胞,检测其自我更新及分化、细胞周期、侵袭实验、成瘤能力和表面标记物CD24/CD44表达等,验证其肿瘤干细胞特性。荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测miR-590-3p在胰腺癌细胞球中的表达。结果少量ASPC-1和PANC-1细胞在无血清培养基中能存活,呈克隆球样悬浮生长,并可以在体外连续传代,加入血清后细胞球帖壁分化。ASPC-1,PANC-1细胞球G0/G1期分别为(75.3±5.4) %,(80.1±4.7) %;ASPC-1和PANC-1细胞球的平均穿膜细胞数分别为147.3±18.6,113.2±12.9个,较细胞系具有较强的侵袭能力;ASPC-1和PANC-1细胞球移植形成肿瘤所需最少细胞数为5×105个,其成瘤能力是普通细胞系的100倍;ASPC-1,PANC-1细胞球CD24+CD44+比例分别为0.38%-0.43%,4.91%-5.21%,高于细胞系中的表达(P细胞球miR-590-3p表达分别是细胞系的4.67,4.52倍(P 细胞系中分离出具有干细胞特性的胰腺癌细胞球,其miR-590-3p表达上调,可能是胰腺癌干细胞特性维持的关键基因。

关键词：肿瘤干细胞 MicroRNAs 胰腺癌细胞球无血清培养基

在细胞球内BPV转化细胞抗凋亡的细胞间诱导研究

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临床与实验病理学杂志 1999年第5期15卷 435-437,I065页

作者：邓红张建民苏宁武忠弼 GBauer 南京铁道医学院病理学教研室南京210009 同济医科大学病理学研究室武汉430030 Freiburg大学病毒研究所 freiburg德国79104

目的：（１）建立“凋亡的细胞间诱导”的球体细胞培养实验系统，（２）在该系统中研究ＢＰＶ的致癌机制。方法：采用三维立体细胞培养技术，制作以转化细胞为核心，正常细胞为外壳的细胞球，模拟体内肿瘤细胞生长于正常细胞间的情... 详细信息

目的：（１）建立“凋亡的细胞间诱导”的球体细胞培养实验系统，（２）在该系统中研究ＢＰＶ的致癌机制。方法：采用三维立体细胞培养技术，制作以转化细胞为核心，正常细胞为外壳的细胞球，模拟体内肿瘤细胞生长于正常细胞间的情形，观察癌基因ｓｒｃ、化学致癌剂甲基胆蒽及ＢＰＶ转化细胞在细胞球中凋亡产生情况。结果：在球体细胞培养实验系统中，在ｓｒｃ转化细胞产生凋亡的条件下，甲基胆蒽转化细胞同样能产生凋亡，而ＢＰＶ转化细胞则抵抗了由周围正常细胞所致的凋亡。结论：（１）“凋亡的细胞间诱导”在球体细胞培养实验系统中，即在近似体内的条件下，不需要外源性ＴＧＦβ的参与同样可以产生，球体细胞培养实验系统是理想的研究近似体内条件下“凋亡的细胞间诱导”的模型，（２）由于ＢＰＶ转化细胞能抵抗“凋亡的细胞间诱导”，因此可以作为ＢＰＶ致癌机制一种解释，即ＢＰＶ不仅能诱导细胞转化，而且能保护已经转化的细胞不被“凋亡的细胞间诱导”所清除。

关键词：细胞球牛乳头状瘤病毒抗凋亡致癌细胞间诱导

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骨髓微环境造就的干细胞凝集态骨髓细胞球

解剖科学进展 2008年第3期14卷 341-344页

作者：潘锋柏树令中国医科大学人体解剖学教研室辽宁沈阳110001

细胞分化受到细胞自发信号和周围环境的调控。体内的细胞与细胞、细胞与细胞外基质形成了复杂的微环境,而微环境对于骨髓中的干细胞和前体细胞的存活、分化、增殖和迁移都起着重要的作用。成人的造血过程发生在骨髓腔中,造血细胞与其周... 详细信息

细胞分化受到细胞自发信号和周围环境的调控。体内的细胞与细胞、细胞与细胞外基质形成了复杂的微环境,而微环境对于骨髓中的干细胞和前体细胞的存活、分化、增殖和迁移都起着重要的作用。成人的造血过程发生在骨髓腔中,造血细胞与其周围环境始终呈动态变化过程。在骨髓腔中的稳态下,大部分造血细胞都是以一种凝集态的方式存在,这就是造血干细胞球,而这种凝集态的改变是以作为细胞微环境的细胞外基质的改变为前提,直到发生造血干细胞在骨髓腔中迁移并到血流中循环。同样,骨髓基质干细胞的凝集态也是以一种球状体的形式存在,只是在分布形式及动员条件与造血干细胞球有所不同,本文就干细胞在骨髓中的这种凝集态形式骨髓细胞球做一综述。

关键词：骨髓微环境细胞凝集细胞球造血干细胞骨髓基质干细胞胞外基质形成造血细胞周围环境