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不同电融合条件对小鼠卵丘细胞核移植重组胚融合和早期发育的影响

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第一军医大学学报 2005年第2期25卷 156-159,164页

作者：江培洲沈新明乔贵林黄华姚开泰南方医科大学肿瘤研究所上海东方肝胆外科医院上海200438

目的研究不同电融合条件对来源于小鼠卵丘细胞核移植重组胚的融合和早期发育的影响,寻找最佳电融合参数.方法将直径10～12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体.在不同电融合条件下诱导两... 详细信息

目的研究不同电融合条件对来源于小鼠卵丘细胞核移植重组胚的融合和早期发育的影响,寻找最佳电融合参数.方法将直径10～12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体.在不同电融合条件下诱导两者间的融合,并对重组胚激活以及随后发育的早期阶段包括2细胞、4～8细胞和桑椹胚进行观察和计数.结果电融合时电场强度或脉冲时间在一定范围内允许波动,变动范围分别是电场强度1 000～2000kV/cm和脉冲时程40～160 ms.低于容许范围的电融合参数会降低供体核-卵母细胞复合体的融合率,而高于容许范围的参数会导致供体核-卵母细胞复合体溶解乃至死亡.如果电融合参数在容许范围内,供体核-卵母细胞复合体的融合率无统计学差异,并且融合后重组胚的激活,以及发育至2细胞、4～8细胞和桑椹胚阶段的比率也无统计学差异.此外,脉冲重复次数以1～2次为佳.结论优化的电融合参数是决定供体核-卵母细胞复合体融合与重组胚激活的关键因素.

关键词：细胞核/移植电融合卵母细胞胚胎

近交系小鼠体细胞核移植囊胚的微卫星DNA鉴定

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基础医学与临床 2009年第9期29卷 924-928页

作者：覃敏何敏宣强莫林键吴华莫曾南广西医科大学第一附属医院泌尿外科广西医科大学泌尿科学研究所广西南宁530021 广西医科大学医学科学实验中心广西南宁530021

目的利用微卫星DNA技术进行体细胞核移植囊胚的鉴定。方法根据Mouse Genome Database设计小鼠微卫星DNA多态聚合酶链反应引物,提取近交系小鼠体细胞核移植囊胚、供体BALB/c小鼠、受体C57BL/6小鼠及昆明小鼠的基因组DNA,使用巢式聚合酶... 详细信息

目的利用微卫星DNA技术进行体细胞核移植囊胚的鉴定。方法根据Mouse Genome Database设计小鼠微卫星DNA多态聚合酶链反应引物,提取近交系小鼠体细胞核移植囊胚、供体BALB/c小鼠、受体C57BL/6小鼠及昆明小鼠的基因组DNA,使用巢式聚合酶链反应扩增4个微卫星位点DNA片段,即D3Mit28、D11Mit258、D12Mit136及D14Mit50。对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果巢式聚合酶链反应可扩增微量基因组DNA,通过微卫星DNA序列的扩增,证明核移植囊胚的微卫星DNA与供体细胞完全相同,而与受体细胞或者对照细胞无亲缘关系。结论体细胞核移植囊胚基因组来源于供体BALB/c小鼠。

关键词：细胞核/移植疾病模型动物微卫星DNA 鉴定

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

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第一军医大学学报 2005年第6期25卷 613-618页

作者：沈新明乔贵林江培洲李欣黄华姚开泰南方医科大学肿瘤研究所上海市东方肝胆外科医院上海200438

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育.方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25 mm左右的小口,首先将第一极体挑出,再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞,去除包含有MⅡ期... 详细信息

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育.方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25 mm左右的小口,首先将第一极体挑出,再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞,去除包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的最少量细胞质.随后,将直径为10～12 mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体.用电融合的方法诱导复合体融合,并对重组胚激活.体外培养72 h,对重组胚发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数.结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15 s;Hoechst 33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核:去核成功率为95.5%,注核成功率为76.7%,供体核-卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2%和62.2%;重组胚体外培养72 h内发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期的比率分别为57.5%、39.1%和27.6%;用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物,扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段,表明重组胚来源于供体卵丘细胞.结论应用改进的核移植方法,不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核,去核成功率高,而且操作简便,去核迅速,对卵母细胞损伤小,是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法.

关键词：细胞核/移植电融合卵母细胞重组胚

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治疗性克隆在组织工程方面的研究现状

中国临床康复 2004年第14期8卷 2708-2710页

作者：刘东华刘慧雯单智焱哈尔滨医科大学组织学与胚胎学教研室黑龙江省哈尔滨市150086

临床上许多疾病由于细胞老化或受到病损,而引起正常的生理功能发生障碍或丧失,严重威胁着人类的生命和健康,如帕金森综合征、糖尿病、皮肤烧伤等。目前治疗这些疾病的方法主要采用细胞、组织和器官移植,然而,供体来源不足和免疫排斥反... 详细信息

临床上许多疾病由于细胞老化或受到病损,而引起正常的生理功能发生障碍或丧失,严重威胁着人类的生命和健康,如帕金森综合征、糖尿病、皮肤烧伤等。目前治疗这些疾病的方法主要采用细胞、组织和器官移植,然而,供体来源不足和免疫排斥反应一直成为器官移植方面的有待解决的两个根本性问题。治疗性克隆是生物学界在20世纪90年代末取得的两个重大突破-体细胞克隆技术及干细胞培养技术结合后产生的医学奇迹。它的目的就是产生个性化的,在基因组成上与患者相同的胚胎干细胞(embryonicstemcell,ES),然后诱导ES分化为特定类型的可供移植的细胞或组织,来修复患者已丧失功能的组织或器官,达到完全治愈。常用的方法是:①利用体细胞核移植技术获得重构胚。②分离培养胚胎干细胞。③定向诱导分化胚胎干细胞,获得特定类型细胞。④目的细胞的分离纯化。⑤利用组织工程学的方法,把目的细胞构建成组织和器官。着重介绍治疗性克隆研究现状及最新使用方法,并对面临的问题作了概括性讨论。

关键词：生物医学工程克隆,生物干细胞细胞核/移植