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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2014年第1期35卷 16-21页

作者：颜玉文魏中琦鞠婧婧陈琴刘小阳沈志平申丽葛晓群扬州大学医学院江苏扬州225001 泰州医药高新技术产业园区管委会江苏泰州225300

以500μmol·L-1甲基苯基吡啶离子(MPP+)制备帕金森病(PD)细胞模型,MTT法测定细胞存活率,比色法测定LDh释放量;AO/EB染色法、透射电镜法观察细胞凋亡形态;流式细胞仪分析细胞凋亡比率并测定ROS含量,探讨青皮内生菌(Phomopsis sp.)固体... 详细信息

以500μmol·L-1甲基苯基吡啶离子(MPP+)制备帕金森病(PD)细胞模型,MTT法测定细胞存活率,比色法测定LDh释放量;AO/EB染色法、透射电镜法观察细胞凋亡形态;流式细胞仪分析细胞凋亡比率并测定ROS含量,探讨青皮内生菌(Phomopsis sp.)固体发酵产物细胞松弛素h(Cyh)对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用。结果表明:①Cyh与MPP+同时加药(0.05~0.20μmol·L-1)、先加药(0.002 5~0.010 0μmol·L-1)和后加药(0.01~0.20μmol·L-1)均能使PC12细胞存活率显著增加,LDh释放率显著下降;②流式细胞仪测定表明Cyh能够降低MPP+诱导的PC12细胞凋亡率(P细胞形态的改善;③Cyh能显著抑制MPP+升高ROS含量的作用(Ph能抑制MPP+诱导的PC12细胞损伤和凋亡,这可能与其减少细胞内ROS含量有关。

关键词：细胞松弛素h PC12 细胞凋亡甲基苯基吡啶离子活性氧帕金森病

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Cytochalasin h对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及其机制研究

Cytochalasin H对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及其机制研究

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作者：颜玉文扬州大学

学位级别：硕士

内生真菌(Endophytic fungi)是指其在生活史的某一段时期生活在植物组织内,对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。青梅属(Vatica genus)植物富含白藜芦醇(Resveratrol)化合物,有报道称它能阻止氧化应激引起的PC12细胞凋亡。基于内共... 详细信息

内生真菌(Endophytic fungi)是指其在生活史的某一段时期生活在植物组织内,对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。青梅属(Vatica genus)植物富含白藜芦醇(Resveratrol)化合物,有报道称它能阻止氧化应激引起的PC12细胞凋亡。基于内共生理论,青梅属植物青皮内生菌极有可能产生与白藜芦醇相同或相似的活性成分。我们对青皮内生菌(Phomopsi sp.)固体发酵产生的化合物进行初步筛选,结果发现细胞松弛素h(Cytochalasin h, Cyth)对损伤的PC12细胞可能有潜在的保护作用。目前尚未发现对Cyth该方面活性的研究报道,因此对其作用以及作用机制研究是非常必要和有意义的。帕金森病(P arkinson's disease, PD)是一种神经系统退行性疾病,其发病原因与黑质多巴胺(Dopamine, DA)能神经元渐进性缺失有关,而凋亡是其神经元丢失的主要形式。该病的主要发病机制之一为氧化应激。Cyth与上述白藜芦醇均来源于青梅属植物,它是否也能产生与后者相似的抗氧化应激作用从而对PD产生有益的影响呢?为此,本实验应用甲基苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)制备PD体外细胞模型,观察了Cyth对其损伤和凋亡的影响,并对其作用机制进行了初步研究。主要结果如下：1. Cytochalasin h对MPP+诱导的PC12细胞损伤的影响方法：MTT法检测PC12细胞存活率,比色法测定LDh释放率。分组及加药：(1)对照组：0.01%DMSO溶剂;(2)模型组：500μmol/LMPP+;(3)阳性药组：100μmol/L司来吉兰;(4)受试药物组：不同浓度Cyth。受试药和阳性药采用3种加药方法：①预处理：先向PC12细胞中加入药物培养4h后再加入Mpp+;②后干预：Mpp+作用4h后再加药;③同时干预：药物与MPP+同时加入。各组Mpp+作用时间均持续48h。结果：(1) Cyth化合物细胞毒性：与对照组比较,0.00125～2μmol/L Cyth组细胞存活率均无显著性降低。在0.05,0.1,0.2μmol/L时,Cyth反使PC12细胞存活率增加,分别为118.22%±4.29%,119.00%+7,33%,118.48%±6.85%,与对照组相比,均具有显著性差异(Ph化合物不仅没有细胞毒性,反而能够促进神经细胞增殖。(2)Cyth化合物预处理对MPP+诱导的PC12细胞存活率和LDh的影响：Cyth预处理在0.001～0.01μmol/L范围内细胞存活率呈浓度依赖性上升(r=0.939、Ph浓度为0.01μmol/L时存活率达到103.7%±0.3%(Ph (0.0025～0.01μmol/L)预处理LDh释放率呈浓度依赖性下降(r=-0.946、Ph化合物后干预对MPP+诱导的PC12细胞存活率和LDh的影响：Cyth后干预在0.01～0.15μmol/L范围内细胞存活率呈浓度依赖性上升(r=0.890、Ph浓度为0.15μmol/L时存活率达到104.3%±2.4%(Ph (0.01～0.2μnmol/L)后干预LDh释放率呈浓度依赖性下降(r=-0.858、Ph化合物同时干预对MPP十诱导的PC12细胞存活率和LDh的影响：Cyth同时干预在0.05～0.2μmol/L范围内细胞存活率呈浓度依赖性上升(r=0.885、Ph浓度为0.2μmol/L时存活率达到96.60%±4.6%(Ph (0.05～0.2μmol/L)同时干预LDh释放率呈浓度依赖性下降(r=-0.913、Ph化合物对Mpp+诱导的PC12细胞损伤有一定的预防、治疗和修复作用。*** h对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用方法：分组同上,采用同时干预法加药。应用透射电镜观察细胞超微结构,AO/EB荧光染色观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞凋亡比率。结果：(1)透射电镜下细胞超微结构：电镜结果显示,Mpp+作用后可见细胞发生凋亡的形态学改变：细胞表面的微绒毛减少或者消失;细胞核膜皱缩,细胞核体积缩小;染色质致密并凝聚成块状聚于细胞核周边;细胞质中可见线粒体明显肿

关键词：帕金森病细胞松弛素h 细胞凋亡氧化应激 PC12

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