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温度对黄曲霉生长发育和次级代谢的影响

温度对黄曲霉生长发育和次级代谢的影响

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作者：仲红福建农林大学

学位级别：硕士

黄曲霉毒素是具有强致癌、致畸和致突变的作用的一种次级代谢产物,它能污染农作物,给食品行业带来重大的经济损失。同时,它也是人类的致病菌,严重威胁着人类健康。研究表明,黄曲霉毒素的产生与多种环境因素相关,温度是其中起主要作用的... 详细信息

黄曲霉毒素是具有强致癌、致畸和致突变的作用的一种次级代谢产物,它能污染农作物,给食品行业带来重大的经济损失。同时,它也是人类的致病菌,严重威胁着人类健康。研究表明,黄曲霉毒素的产生与多种环境因素相关,温度是其中起主要作用的因素之一。但是黄曲霉如何响应温度并对产毒进行调控的机制目前还不清楚。本实验首先在4个不同温度下培养黄曲霉标准菌株NRRL3357,研究其对生长发育和次级代谢的影响。结果发现黄曲霉在28℃时产毒最多,在37℃时生长最快而产毒较少。低温(20℃)抑制生长,对产毒抑制不明显,而高温(42℃)完全抑制产毒。温度对黄曲霉的产孢也有显著影响,在37℃培养条件下产孢数明显增加。黄曲霉在两个温度下(28℃、37℃)的形态没有明显差异,生长速度的差异仅体现在菌丝尖端长度和隔膜长度上——相较于28℃,在37℃培养条件下的菌丝尖端长度变短,隔膜长度增长。对两个温度下培养的菌株的转录组分析发现相对于在28℃培养的菌株,在37℃培养的菌株的转录组中有2285个基因表达上调,3202个基因表达量下调。蛋白组iTRAQ测序结果差异表达蛋白分析发现37℃相对于28℃中有337个蛋白表达上调,328个表达下调。对转录组和蛋白组关联分析发现这两者的相关性比较差,说明基因与蛋白的表达结果不完全对应。产毒基因簇中AflR的蛋白表达量不发生变化,但转录水平在28℃的表达量明显高于37℃。本研究最后对与响应温度相关的Spml基因进行了基因敲除,结果发现敲除菌株与野生型相比的生长明显受到抑制,表型也有很大差异,产毒量显著增加,对细胞壁稳定剂、渗透压、影响细胞壁完整性的试剂更为敏感。有意思的是,突变株对氧化压的反应与野生型类似。综上所述,本研究通过温度实验证实了温度确实能影响黄曲霉的生长和产毒,利用转录组合蛋白组测序分析找到了影响黄曲霉生长和产毒的基因表达产物。对Spml基因的敲除实验发现,细胞壁完整性通路对黄曲霉的生长和产毒十分重要。因此,本研究为揭示黄曲霉响应温度调节产毒机制奠定了基础。

关键词：温度黄曲霉转录组蛋白组细胞壁完整性通路

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薄荷醇对柑橘采后酸腐病抑制效果及其机理研究

薄荷醇对柑橘采后酸腐病抑制效果及其机理研究

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作者：徐哲陕西师范大学

学位级别：硕士

柑橘酸腐菌(Geotrichum citri-aurantii)引起的采后酸腐病是仅次于由青霉属(Pencillium spp.)引起的采后青绿霉病,其寄主选择范围较广,可侵染多种果蔬,严重影响果蔬品质和营养。目前绝大多数化学杀菌剂对酸腐病的防治均效果不佳,效果最... 详细信息

柑橘酸腐菌(Geotrichum citri-aurantii)引起的采后酸腐病是仅次于由青霉属(Pencillium spp.)引起的采后青绿霉病,其寄主选择范围较广,可侵染多种果蔬,严重影响果蔬品质和营养。目前绝大多数化学杀菌剂对酸腐病的防治均效果不佳,效果最好的联苯酚钠(SOPP)因其危害大而被禁用。除了常用的商业化学杀菌剂,天然植物提取物也具有抑菌能力,由于天然低毒,没有农残留且不会引起病原微生物的抗药性等优点而受到越来越多的关注。实验室前期已经研究过薄荷精油对酸腐菌的抑制效果,并筛选出主要抑菌成分为薄荷醇,但植物精油中薄荷醇含量往往存在差异。因此,本文通过体外实验研究薄荷醇对***-aurantii的抑制作用并探讨其潜在的抑菌机制。此外通过果实实验评估薄荷醇控制果实酸腐病的效果,并测定果实品质和酶活性变化,以评估薄荷醇对柑橘果实诱导抗性的能力。为进一步探索抗真菌机制,我们通过***-aurantii全基因组测序手段了解***-aurantii基因信息,提出可能的重要作用机制。该研究结果为探讨真菌抑制机制提供新视角,为进一步研究***-aurantii致病机制奠定基础。取得的主要研究结果如下:(1)通过体外实验,我们得到薄荷醇最小抑菌浓度MIC为6.4 mmol L,而4.8mmol L却能抑制酸腐菌孢子萌发。薄荷醇处理能够引发大量ROS的产生,导致过氧化产物MDA在短时间内快速积累,进而增加质膜通透性,严重影响质膜的功能和活力,破坏质膜完整性。此外,薄荷醇还可使***-aurantii细胞壁通透性受损,影响细胞壁完整性,***-aurantii细胞膜和细胞壁均为薄荷醇重要的抗真菌靶标。(2)果实体内实验表明,低浓度薄荷醇处理对柑橘果实酸腐病的效果有限,在贮藏120 h内,高浓度薄荷醇处理可有效降低酸腐病的发病率。随着贮藏时间的增加,薄荷醇的抑制效果逐渐减弱,这可能与其挥发性有关。薄荷醇处理对果实p H值、可溶性固形物含量变化没有影响,但对维持果实硬度、可滴定酸、抗坏血酸和还原糖含量方面起着重要作用。此外,薄荷醇处理可诱导果实CAT、POD、PPO和PAL酶活,增强果实的抗逆性。同时,我们还发现酸腐菌侵染也会激活这些逆境相关防御酶活性,但薄荷醇可以更好的维持这些酶活性。(3)通过全基因组测序获得了***-aurantii G近完成图基因组信息。*** G50的基因组大小约为25.41 Mb,组装到27个Scaffolds上,总长度27,548,716bp,基因组GC含量约为38.62%。共预测得到4181个编码蛋白基因,基因总长度5,848,379bp,占整个基因组的21.23%。3405个基因得到KOG功能分类,3039个得到GO注释,2449个与KEGG匹配。有1137个基因被PHI数据库注释;540个基因被DFVF数据库注释,得分靠前的多数与ATP转运、几丁质合成、1,3-β-葡聚糖酶合成、真菌甾醇合成等相关。(4)生物信息学分析表明,***-aurantii与Dipodascaceae科真菌在遗传进化上较为接近,其中***与其亲缘关系最为接近,***-aurantii与***共线性区域最多。通过基因组和转录组测序发现了细胞壁完整性通路通路(CWI-MAPK)中关键基因PKC1、三级信号激酶BCK1(MKKK)、MKK1(MKK)和SLT2(MPK)的核苷酸和氨基酸序列。系统发育分析表明,从进化的角度来看,***-aurantii与Galactomyces属和***更接近。蛋白结构域和motif分析结果表明,PKC1、BCK1、MKK1和SLT2蛋白激酶在结构上是保守的。PKC1预测有9个蛋白质结构域,与其复杂的生物学功能有关。它的结构域主要包括C2结构域、C1结构域以及传递磷酸化信息的C端丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域。BCK1、MKK1和SLT2的蛋白结构域比较简单,在C端都有一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域。薄荷醇处理4h后,Gci PKC1、Gci MKK1、Gci BCK1、Gci SLT2和Gci MIH1的表达水平显著降低。当薄荷醇达到6.4 mmol L时,Gci SLT2和Gci MIH1的表达水平极低,而Gci MSG5的表达水平明显升高。此外,Gci FKS2、Gci CHS2、Gci CHS3和Gci CHSG的表达水平显著下调。

关键词：柑橘酸腐菌薄荷醇抑菌机制柑橘果实细胞壁完整性通路

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