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作者：杨硕齐鲁工业大学

学位级别：硕士

蛋白质(短肽)在疾病检测与治疗、酶、化学品和生物能源等方面的应用一直备受关注。近年来,微生物胞外表达蛋白因独特优势成为新的研发热点。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为典型真核生物模式菌,其遗传背景清晰、生长速度快、翻... 详细信息

蛋白质(短肽)在疾病检测与治疗、酶、化学品和生物能源等方面的应用一直备受关注。近年来,微生物胞外表达蛋白因独特优势成为新的研发热点。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为典型真核生物模式菌,其遗传背景清晰、生长速度快、翻译后修饰系统完整、鲁棒性高及食品级生物安全等特点,使其成为微生物胞外蛋白表达研究的佼佼者。但酿酒酵母蛋白胞外表达能力较弱局限了其应用范围。酿酒酵母的芽殖极化途径调控囊泡运输,而囊泡运输是蛋白胞外表达的重要环节,强化囊泡运输能够有效增强蛋白胞外表达。同时,细胞壁的适度缺陷也能够促进酿酒酵母蛋白的胞外表达。为此,本论文主要从这两个生物学途径出发点以分泌和表面展示为胞外表达方式,对芽殖极化和细胞壁合成途径进行改造提高酿酒酵母胞外表达。主要进展有:一、改造芽殖极化途径促进酿酒酵母蛋白胞外表达1、酿酒酵母蛋白胞外表达体系建立以酿酒酵母(***)*** 113-5D作为底盘菌株,敲除TPI1(磷酸丙糖异构酶编码基因)解除其葡萄糖利用能力,并在质粒上以源于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的磷酸丙糖异构酶编码基因POT1为显性标记回补葡萄糖利用,建立以葡萄糖作为筛选标记的α-淀粉酶胞外表达体系。甄选乳酸克鲁维酵母(Kluvveromvces lactis)的INU1分泌肽,连接于报告蛋白α-淀粉酶N端,上述元件融合后置于TDH3启动子和TPI1终止子调控下建立蛋白分泌表达体系。进而在α-淀粉酶C端连接SED1锚定蛋白,建立酿酒酵母蛋白表面展示表达体系。2、筛选促进蛋白胞外表达的芽殖极化途径基因选取细胞芽殖极化途径中轴向出芽、双极出芽及细胞骨架合成相关的必需基因13个。通过单拷贝质粒逐一将这些基因引入上述表面展示和分泌表达体系中,结果显示多个基因的强化能够提升α-淀粉酶的胞外表达,但对这两种表达体系影响的趋势并不完全一致,仅有RAS蛋白GTP酶基因BUD1和细胞膜蛋白基因BUD10在表面展示和分泌表达体系中均能提高蛋白的胞外表达。进而,将这两个基因分别整合到基因组上,结果显示,BUD1和BUD10稳定的超表达状态,在表面展示体系中使总α-淀粉酶活性分别提升了56.1%和37.2%;在分泌表达体系中使总α-淀粉酶活性分别提升了49.7%和20.4%。由此可见,BUD1的超表达在这两个体系中对α-淀粉酶胞外表达的促进效果均为最显著。3、BUD1与芽殖极化途径基因的组合强化促进蛋白胞外表达在上述基因组整合表达BUD1的基础上,通过单拷贝质粒逐个分别引入13个芽殖极化途径基因,这两个胞外表达体系中均有一些基因能够进一步促进α-淀粉酶胞外表达。选取提升效果明显的基因也整合到基因组上。在蛋白表面展示体系中,BUD7和CDC42分别协同BUD1,使总α-淀粉酶活性提升了14.1%和24.6%。而在分泌表达体系中,BUD1自身拷贝数的增加使总α-淀粉酶活性提升了31.2%;而BUD1与BUD10协同也使总α-淀粉酶活性提升了25.3%。相对于没有改造芽殖极化途径的出发菌株,双基因超表达的最佳组合在这两种胞外表达体系中使总α-淀粉酶活性提升均在100.0%左右。4、上述双基因超表达的最佳组合,在这两种体系中,对β-葡萄糖苷酶的胞外表达也有促进作用,且表面展示最佳组合BUD1和CDC42的组合超表达亦能促进以AGA1和DAN4锚定蛋白构建的表面展示系统的蛋白胞外表达。二、细胞壁合成的适度损伤促进蛋白胞外表达1、细胞壁合成途径基因敲除影响蛋白胞外表达在BY4742单基因敲除库中选取79个直接参与细胞壁合成基因单敲除的菌株,使用扣馕复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)来源的β-葡萄糖苷酶及SUC2分泌肽,置于TEF1启动子和PGK1终止子控制下,得到质粒p JBGL1;在β-葡萄糖苷酶C端通过linker连接SED1锚定蛋白获得质粒p JBGL-L-SED1,使用上述两个质粒分别在单基因敲除菌株中引入β-葡萄糖苷酶的胞外表达体系。酶活分析结果表明,在蛋白分泌体系中,19个基因单敲除促进β-葡萄糖苷酶的胞外表达,其中Ypk1Δ、Dfg5Δ、Fyv5Δ、Ccw12Δ使酶活分别提升了109.2%、89.3%、78.4%、41.0%。蛋白表面展示体系中,26个基因单敲除促进β-葡萄糖苷酶的胞外表达,其中Ypk1Δ、Dfg5Δ、Fyv5Δ、Kre1Δ分别将总酶活提升了182.1%、167.0%、147.4%、62.9%。Ypk1Δ、Dfg5Δ、Fyv5Δ在这两种胞外表达体系中都对β-葡萄糖苷酶的胞外表达有明显的促进作用,且Ypk1Δ对两种体系的胞外表达均影响最大。2、细胞壁合成途径基因双敲除促进蛋白胞外表达选取能够促进蛋白胞外表达的YPK1、DFG5

关键词：蛋白胞外表达芽殖极化细胞壁合成酿酒酵母

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酿酒酵母Snf1/AMPK蛋白激酶通过调节细胞壁合成相关基因的表达影响细胞壁完整性

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微生物学报 2016年第7期56卷 1132-1140页

作者：张萍赵强魏东盛杨娇朱项阳朱旭东南开大学生命科学学院微生物学系天津300071 北京师范大学生命科学学院生化与分子生物学研究所北京100875

【目的】初步探讨酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Snf1/AMPK蛋白激酶影响细胞壁完整性的机制。【方法】通过同源重组交换的方法,构建酿酒酵母Snf1/AMPK蛋白激酶催化亚基的敲除菌株snf1Δ,并通过基因回补对敲除菌株表型进行验证。... 详细信息

【目的】初步探讨酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Snf1/AMPK蛋白激酶影响细胞壁完整性的机制。【方法】通过同源重组交换的方法,构建酿酒酵母Snf1/AMPK蛋白激酶催化亚基的敲除菌株snf1Δ,并通过基因回补对敲除菌株表型进行验证。在含有刚果红(Congo red)和荧光增白剂(Calcofluor white)的平板上检测snf1Δ菌株细胞壁的完整性,通过q RT-PCR的方法检测snf1Δ菌株中已知的细胞壁合成相关基因的表达情况。【结果】SNF1基因敲除影响细胞壁的完整性,并影响酿酒酵母对热激应答的反应。进一步研究发现,SNF1突变菌株中β-1,3-葡聚糖合成相关基因与β-1,6-葡聚糖合成相关基因的表达量均明显降低。【结论】结果显示酿酒酵母Snf1蛋白激酶影响细胞壁的完整性,此影响发生在转录水平上,即通过调节细胞壁合成相关基因的转录来实现,揭示了Snf1蛋白的一个新角色。

关键词：酿酒酵母 Snf1/AMPK蛋白激酶细胞壁合成 β-葡聚糖

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真菌细胞壁的合成抑制物质

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农药译丛 1986年第6期 23-28页

作者：磯野清杨慧心日本理化学研究所

微生物具有动物细胞所没有的细胞壁和生物合成途径,这从两方面引起人们兴趣。一是学术上的兴趣,由于细胞的形状是由细胞壁决定的,故而细胞壁是细胞生长和分化有关的形态学研究的很好材料。因此细胞壁合成抑制剂可为该研究提供重要的方... 详细信息

微生物具有动物细胞所没有的细胞壁和生物合成途径,这从两方面引起人们兴趣。一是学术上的兴趣,由于细胞的形状是由细胞壁决定的,故而细胞壁是细胞生长和分化有关的形态学研究的很好材料。因此细胞壁合成抑制剂可为该研究提供重要的方法。抑制细菌肽聚糖生物合成的抗生物质为数甚多,但抑制真菌细胞壁生物合成的抗生物质却很少。而且对于它们的结构与生物合成的详情尚不十分清楚。另一方面是实用上的兴趣。目前寻求新型抗真菌剂已变得十分必要,随着抗细菌抗生物质、免疫抑制物质等的使用,深部真菌病急剧增加,原来几乎不显示致病性的真菌感染已日趋严重。目前,多烯类抗生素、两性霉素B和合成药剂5-氟胞嘧啶以及咪唑类化合物虽有使用,但终因其毒性问题而受到限制。另

关键词：真菌细胞壁细胞壁合成深部真菌病多烯类抗生素氟胞嘧啶抗生两性霉素生物合成抑制物质抗真菌剂

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新型杀菌剂氟吗啉对黄瓜疫霉病菌细胞壁主要组分合成及分布的影响

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高等学校化学学报 2007年第4期28卷 658-662页

作者：朱书生刘西莉刘鹏飞李健强司乃国王慧敏中国农业大学农学与生物技术学院北京100094 沈阳化工研究院沈阳110021

应用同位素示踪和组织特异性荧光染色等生物化学方法研究了新型杀菌剂氟吗啉对黄瓜疫霉病菌细胞壁主要组分合成及分布的影响.结果表明,氟吗啉对细胞壁的主要组成物质纤维素和非纤维素葡聚糖的合成没有抑制作用,但破坏细胞壁物质在菌丝... 详细信息

应用同位素示踪和组织特异性荧光染色等生物化学方法研究了新型杀菌剂氟吗啉对黄瓜疫霉病菌细胞壁主要组分合成及分布的影响.结果表明,氟吗啉对细胞壁的主要组成物质纤维素和非纤维素葡聚糖的合成没有抑制作用,但破坏细胞壁物质在菌丝正确位置的形成和分布,扰乱菌丝的极性生长.

关键词：氟吗啉细胞壁合成细胞极性同位素示踪荧光增白剂

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RNA干扰Fus3基因对二态性真菌马尔尼菲青霉菌的孢子形成和细胞壁组分合成功能的影响

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菌物学报 2009年第3期28卷 415-421页

作者：王峰董辉钱震陶菊红游松任双喜上海人类基因组南方中心上海201203 沈阳药科大学制药工程学院沈阳110016

马尔尼菲青霉菌Penicillium marneffei是一种重要的条件致病真菌,可致艾滋病患者产生严重的系统性霉菌病并发症。基因组学的研究和RNA干扰技术,为马尔尼菲青霉菌致病基因和致病机制的深入探讨提供了可能。我们研究马尔尼菲青霉菌的一个... 详细信息

马尔尼菲青霉菌Penicillium marneffei是一种重要的条件致病真菌,可致艾滋病患者产生严重的系统性霉菌病并发症。基因组学的研究和RNA干扰技术,为马尔尼菲青霉菌致病基因和致病机制的深入探讨提供了可能。我们研究马尔尼菲青霉菌的一个新基因Fus3,它是丝氨酸/苏氨酸-特异性激酶丝裂原活化蛋白激酶家族的成员。为了研究Fus3的功能,我们利用根癌农杆菌介导的双链RNA干扰技术构建了Fus3 RNA干扰菌株(Fus3-i)。RNA干扰的活性是由木糖诱导的启动子xylP控制的。Fus3基因活性下降后影响了马尔尼菲青霉菌生长,包括孢子的生成,细胞壁组分的合成。实验表明,Fus3基因对于马尔尼菲青霉菌细胞生长发育起着重要的调控作用,为研究真菌疾病提供了帮助。

关键词：丝裂原活化蛋白激酶双链RNA干扰孢子生成细胞壁合成真菌疾病

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基于转录组测序分析扭果花旗杆抗旱的主要代谢途径

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分子植物育种 2022年第11期20卷 3548-3561页

作者：马薇邹丽媛赵惠新葛风伟新疆师范大学生命科学学院新疆特殊环境物种保护与调控生物实验室新疆特殊环境物种多样性应用与调控重点实验室干旱区植物逆境生物学实验室乌鲁木齐830054

扭果花旗杆(Dontostemon elegans Maxim)是新疆达坂城荒漠地区广泛分布的旱生植物,在维持荒漠植被的稳定性中发挥重大作用。为了揭示干旱胁迫下扭果花旗杆整个基因组水平的表达特性,对25%PEG胁迫处理12 h、72 h的扭果花旗杆幼苗进行了... 详细信息

扭果花旗杆(Dontostemon elegans Maxim)是新疆达坂城荒漠地区广泛分布的旱生植物,在维持荒漠植被的稳定性中发挥重大作用。为了揭示干旱胁迫下扭果花旗杆整个基因组水平的表达特性,对25%PEG胁迫处理12 h、72 h的扭果花旗杆幼苗进行了转录组测序分析。经拼接组装共获得64672 Unigene,平均长度为753 bp,N50长度为1527 bp。与七大数据库进行注释,共有48046条Unigene获得了基因注释,占总Unigene的74.29%。其中有29633条Unigene获得了GO注释。通过差异表达基因GO分析显示,608个差异基因主要涉及植物型细胞壁组织或生物发生、细胞壁组织结构成分等功能。KEGG pathway富集分析共有16742 Unigene参与了131个代谢通路,差异基因主要富集到了苯丙素生物合成,类胡萝卜素的生物合成,蜡质、角质的生物合成及二苯乙烯、二芳基庚烷和姜酚生物合成等代谢途径。从扭果花旗杆转录组筛选出来的上调基因多为植物细胞壁组成成分中木质素、纤维素、蜡质、角质、脱落酸等物质的生物合成相关基因。研究表明扭果花旗杆能够通过促进生物合成代谢途经和细胞壁构建途径提高干旱胁迫适应能力,本研究结果有助于揭示扭果花旗杆对干旱的应答机理,为下一步筛选和挖掘抗旱功能基因提供数据支持。

关键词：扭果花旗杆干旱胁迫转录组细胞壁合成

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茄病镰刀菌农杆菌介导转化体系的建立及生长繁殖相关基因的研究

茄病镰刀菌农杆菌介导转化体系的建立及生长繁殖相关基因的研究

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作者：赵莹吉林大学

学位级别：硕士

镰刀菌属(Fusarium spp.)分布十分广泛,种类繁多。在农业上,该菌通过侵染植物和产生毒素严重影响植物生长,可以引发多种粮食和经济作物的根腐、穗腐、苗枯等病害,从而导致农作物的减产,对农业生产造成巨大的经济损失。在临床上,镰刀菌... 详细信息

镰刀菌属(Fusarium spp.)分布十分广泛,种类繁多。在农业上,该菌通过侵染植物和产生毒素严重影响植物生长,可以引发多种粮食和经济作物的根腐、穗腐、苗枯等病害,从而导致农作物的减产,对农业生产造成巨大的经济损失。在临床上,镰刀菌属作为一种机会致病菌,可以造成角膜炎、甲真菌病、蜂窝组织炎等浅层感染;镰刀菌造成的侵袭性感染如心内膜炎、真菌血症、肺炎等近年来发病率逐渐升高。由镰刀菌属引发的真菌感染中,茄病镰刀菌(***)占比最多,特别是引起真菌性角膜炎发病率较高,严重者可致盲;对于免疫缺陷人群,茄病镰刀菌引起侵袭性感染,病死率高。因镰刀菌具有多重耐药性,目前临床上尚无有效的治疗药物,对患者的健康和生命造成危害。因此,解析茄病镰刀菌基因功能、探讨其耐药机制迫在眉睫。本研究对43株临床来源的镰刀菌进行了形态学及分子生物学鉴定,共有5个种,其中茄病镰刀菌最多(25株,占58.1%)。根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)修订的液基微量稀释法检测了4种常见抗真菌药物(伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B及卡泊芬净)对镰刀菌的最小抑菌浓度。结果表明,镰刀菌对两性霉素B最敏感,伏立康唑的抑菌效果较好,伊曲康唑抑菌效果较差,而卡泊芬净无抑菌效果。初步了解了镰刀菌对常用抗真菌药物的敏感性,为临床治疗提供了依据。自上述分离株中选出一株耐药茄病镰刀菌(HD25)作为野生型,使用含遗传霉素抗性筛选标签的质粒,构建了农杆菌介导的茄病镰刀菌遗传转化体系。为提高转化效率,对转化条件进行了优化,将根癌农杆菌(OD=0.8)与茄病镰刀菌孢子悬液(1×10CFU/ml)等体积混合,在22℃的条件下共培养48h,转化率可达到170个转化子/10个孢子。该体系既可以用于基因组的随机插入突变,又可以进行基因的定向敲除,为深入探讨基因功能提供了一种可行、有效的实验技术。通过上述建立的ATMT体系,共获得213株茄病镰刀菌突变体,对突变体进行表型筛选,共获得3株菌落生长速度减缓的菌株,其中FSM156产生橙色色素;对突变株进行药物敏感性筛选,结果表明随机选取的突变体药物敏感性未发生改变。本课题组在前期工作中发现了一个与尖孢镰刀菌(***)生长繁殖相关的基因,在茄病镰刀菌中存在同源基因(本研究中命名为FSOG),该基因编码假定蛋白,具体功能尚不清晰。分析该假定蛋白的结构域发现,其部分区域与Zip A结构域有一定相似性。为进一步解析该基因功能,利用上述已建立的农杆菌介导的茄病镰刀菌遗传转化体系对茄病镰刀菌野生型进行了FSOG基因的定向敲除,所得敲除株△FSOG。表型观察发现,与野生型相比,敲除株△FSOG出现菌落生长缓慢,分生孢子形态异常的现象。将野生型和敲除株接种到含有刚果红和SDS的培养基上,观察菌落生长情况,发现敲除株△FSOG对刚果红表现出了耐受性。利用q PCR检测细胞壁完整性通路(Cell Wall Integrity,CWI)相关基因的表达水平,结果显示slt2、rlm1、fks2等基因的表达水平下调;同时检测了参与细胞壁合成相关基因的表达水平,结果显示几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)的基因表达水平有部分上调。上述结果表明该基因可通过调控CWI通路及细胞壁合成相关酶影响细胞壁的组成和完整性。研究发现,在大肠埃希菌中Zip A是参与细胞分裂的关键蛋白。还有研究表明细胞壁完整性对细胞周期有调控作用。故本研究进一步分析了参与细胞周期调控的蛋白和激酶的表达水平,结果显示,敲除株△FSOG中相关蛋白和激酶的编码基因表达水平均下调。表明该基因可通过调控细胞周期影响茄病镰刀菌的生长。综上所述,本研究成功建立了农杆菌介导的茄病镰刀菌遗传转化体系,并将其应用在随机插入突变和基因定向敲除两方面。成功构建了茄病镰刀菌FSOG基因的敲除株,发现该基因可调控细胞壁合成相关酶、CWI通路相关基因、细胞周期相关蛋白和激酶,影响茄病镰刀菌的生长发育。该研究结果将有助于解析基因未知功能,为寻找致病相关基因、筛选潜在药物靶标奠定基础。

关键词：茄病镰刀菌遗传转化生长繁殖细胞壁合成细胞壁完整性细胞周期

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OsPSS1/SUI1互作蛋白筛选及弱突变体sui1-5鉴定

OsPSS1/SUI1互作蛋白筛选及弱突变体sui1-5鉴定

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作者：杨晔安徽农业大学

学位级别：硕士

包穗是水稻生产上的不利性状,表现为穗下倒一节间伸长异常,穗部不能正常从叶鞘伸出。倒一节间的伸长和发育对水稻株高起着决定性作用,研究倒一节间相关基因的分子调控机制及其遗传网络,对解决水稻不育系包穗现象以及改良水稻株型具有重... 详细信息

包穗是水稻生产上的不利性状,表现为穗下倒一节间伸长异常,穗部不能正常从叶鞘伸出。倒一节间的伸长和发育对水稻株高起着决定性作用,研究倒一节间相关基因的分子调控机制及其遗传网络,对解决水稻不育系包穗现象以及改良水稻株型具有重要意义。Os PSS1/SUI1是一个磷脂酰丝氨酸合酶的编码基因,该基因突变会引起水稻倒一节间严重缩短。突变体细胞壁纤维素合成受阻,可能与细胞内的囊泡运输有关,但是,Os PSS1/SUI1与细胞壁合成的关系一直没有得到合理解释。本研究通过酵母文库筛选到了一个与SUI1发生相互作用的蛋白,借助生物信息学对该蛋白功能进行初步分析,同时我们还发掘并验证了一个新的Os PSS1/SUI1弱等位突变体。具体结果如下:1)本文鉴定了一个新的包穗突变体sui1-5。在营养生长阶段,野生型和突变体的株高差异不显著,生殖生长阶段开始,突变体倒一节间伸长受阻,穗部被剑叶叶鞘完全包裹,同时还伴随着分蘖数增加、剑叶宽变窄、一次枝梗增多、二次枝梗减少、穗长减短、每穗粒数减少、结实率降低、千粒重增加、籽粒变大等表型。突变体sui1-5矮化的主要原因是倒一节间极端缩短。对倒二节间组织进行细胞学观察,sui1-5节间缩短主要是纵向薄壁细胞缩短导致。2)遗传分析发现该包穗性状受一对隐性核基因控制。sui1-5突变基因定位在第1号染色体短臂端标记Y1-3和Y1-4之间,物理距离为38.05 Kb区间内。通过测序分析,ORF1第7个外显子存在一个单碱基替换,导致甘氨酸替换为缬氨酸,该基因编码磷脂丝氨酸合酶,为Os PSS1/SUI1的等位基因。3)本研究通过酵母文库初步筛选到59个可能与SUI1互作的蛋白,我们选择了其中一个纤维素酶GH9A3,并通过经酵母双杂交、萤光素酶互补实验(LCI)和双分子荧光互补实验(BIFC)验证了SUI1与GH9A3互作。对GH9A3同源蛋白的进化树分析和序列比对,GH9A家族蛋白在双子叶和单子叶植物进化过程中比较保守,表明GH9A3与其同源蛋白可能行使相似或相同的功能。4)幼苗期,GH9A3在sui1-5的表达量上调。但是在拔节抽穗期,SUI1和GH9A3在sui1-5中的表达量都相应降低,表明GH9A3也是节间伸长所必须的。对sui1-5抽穗期茎中的纤维素合酶CESAs家族基因的表达量进行分析,结果表明在突变体中参与次级细胞壁合成的纤维素合酶相关基因Os Ces A4,Os Ces A7,Os Ces A9的表达量相较于初级细胞壁合成的纤维素合酶基因Os Ces A1,Os Ces A3,Os Ces A8下调更为显著。

关键词： OsPSS1/SUI1 GH9A3 细胞壁合成节间伸长精细定位

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黄曲霉磷酸葡萄糖异构酶和磷酸甘露糖异构酶的功能研究

黄曲霉磷酸葡萄糖异构酶和磷酸甘露糖异构酶的功能研究

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作者：杜超广西大学

学位级别：硕士

黄曲霉(Aspergillus flavus)是一种分布十分广泛的病原真菌,能够侵袭花生、玉米等许多经济作物,在一定条件下产生黄曲霉毒素等高毒性次级代谢产物,造成极其严重的食品安全问题和巨大的经济损失。同时黄曲霉是诱发曲霉病的第二大病因,给... 详细信息

黄曲霉(Aspergillus flavus)是一种分布十分广泛的病原真菌,能够侵袭花生、玉米等许多经济作物,在一定条件下产生黄曲霉毒素等高毒性次级代谢产物,造成极其严重的食品安全问题和巨大的经济损失。同时黄曲霉是诱发曲霉病的第二大病因,给人类的健康也造成了极大的威胁。因此,关于黄曲霉侵染的防治研究具有重要的现实意义。真菌细胞壁是防治曲霉病的重要靶标。细胞壁合成途径中的关键酶对于细胞壁完整性的维持是必不可少的,其中磷酸葡萄糖异构酶(Phosphoglucose isomerase,Pgi)和磷酸甘露糖异构酶(Phosphomannose isomerase,Pmi)在糖代谢和细胞壁前体合成途径中发挥着重要作用。然而,Pgi和Pmi对黄曲霉生长及致病性的影响尚不明确。为了探究Pgi和Pmi对黄曲霉的生长与致病性的影响,本研究通过同源交换的方法分别构建了黄曲霉pgi和pmi的缺失突变株和回补株,并对突变株表型进行了分析。结果表明,Pgi和Pmi在黄曲霉的生长发育过程中至关重要。与野生株和回补株相比,pgi和pmi的缺失突变株分别需要果糖和甘露糖的补充才能生长,在最适生长条件下孢子产量显著减少,菌核生成受阻,在高渗、强氧化以及细胞壁胁迫条件下的生长受到显著抑制,表明突变株细胞壁完整性受损。此外,我们还发现pgi缺失突变株菌丝萌发严重延滞并对低温应激敏感,pmi缺失突变株在固体培养基上生长速度显著延缓,液体培养条件下菌丝的极性生长发生异常。在秀丽隐杆线虫与大蜡螟动物模型以及在花生与玉米种子侵染试验中,pgi和pmi突变株的毒力均显著下降。综上所述,通过对黄曲霉Pgi和Pmi的功能研究发现,Pgi和Pmi均参与调控黄曲霉的生长发育,在黄曲霉的碳代谢、抗逆性和毒力方面均发挥着重要作用。本研究的结果说明Pgi和Pmi对于黄曲霉的生长发育与致病性不可或缺,为黄曲霉病害的防控提供了新的靶标。

关键词：黄曲霉磷酸葡萄糖异构酶磷酸甘露糖异构酶细胞壁合成糖代谢

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水稻脆秆突变体bc86的理化特性分析与基因定位

水稻脆秆突变体bc86的理化特性分析与基因定位

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作者：许舒彦沈阳农业大学

学位级别：硕士

秸秆是粮食生产过程中产生的主要副产品,秸秆中富含钾、钙、氮、磷、镁和有机质等,是一种十分重要的生物资源,有很大的应用潜力。秸秆的回收以及综合利用不但可以保护生态环境,而且能促进农业的可持续发展。突变体在作物品种改良、功能... 详细信息

秸秆是粮食生产过程中产生的主要副产品,秸秆中富含钾、钙、氮、磷、镁和有机质等,是一种十分重要的生物资源,有很大的应用潜力。秸秆的回收以及综合利用不但可以保护生态环境,而且能促进农业的可持续发展。突变体在作物品种改良、功能基因研究等方面具有重要的意义,茎秆脆性突变体是研究茎秆机械强度和细胞壁形成代谢机制的重要材料。本研究以优良粳稻品种稻花香及利用其诱变得到的1个脆秆突变体bc86为材料,通过表型的观察、农艺性状的调查、茎秆细胞壁成分和叶绿素含量的测定、组织化学染色、茎秆细胞壁结构的观察、产糖效率的测定以及突变体基因定位对脆秆突变体bc86的生理生化特性进行分析,以期为水稻秸秆的整合利用提供参考。主要研究结果如下:1.三叶期时,脆秆突变体bc86的叶片、叶鞘、茎秆均表现出脆性,之后一直表现为脆性。与野生型稻花香相比,突变体bc86的叶片表现出明显的叶片尖部干枯、晚熟,穗长、穗重均极显著降低,且没有二次枝梗。2.与野生型稻花香相比,脆秆突变体bc86的株高和分蘖都极显著降低(P壁厚均显著增加。突变体bc86的倒一节间至倒四节间的穿透力、抗折力均显著低于稻花香的。3.与野生型稻花香相比,突变体bc86的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素的含量分别极显著地降低了67.08%、67.91%、64.66%和67.31%。4.台盼蓝染色实验表明,突变体bc86叶尖部位的细胞发生程序性死亡;NBT染色试验证明突变体bc86的叶尖部位存在O的沉积,DAB染色试验证明突变体bc86的叶尖部位存在HO的沉积。5.与野生型稻花香相比,脆秆突变体bc86的纤维素含量和晶体纤维素含量均极显著降低,半纤维素和木质素含量均极显著增加。其中纤维素含量下降了28.69%,晶体纤维素降低了54.69%,半纤维素增加了14.45%,木质素含量增加了20.29%。与野生型稻花香相比,脆秆突变体bc86可溶性糖的含量显著增加了27.86%。6.与野生型稻花香茎秆的组织相比,脆秆突变体bc86的厚壁组织变薄,薄壁组织细胞较小,大维管束和小维管束数量增加;与稻花香相比,突变体bc86的大维管束的面积和小维管束面积分别极显著降低了34.64%和18.53%。与野生型稻花香叶片的组织相比,突变体bc86的两个大维管束之间的小维管束数目极显著降低了40.74%,这导致了突变体bc86的叶片较野生型的窄。7.在生物质降解效率方面,通过不同浓度的Na OH和HSO预处理后,突变体bc86的生物质酶解的效率均有所增加,Na OH处理后的己糖释放量比HSO处理后的多。8.利用图位克隆的方法对突变体基因进行精细定位,将基因bc86定位在第1号染色体,位于标记Indel-1和Indel-3之间,区间物理距离约为83 kb,对该区间的候选基因进行分析及测序发现,第三个ORF的CDS上的一个碱基G突变成A,由天冬氨酸变成天冬酰胺。

关键词：水稻脆秆细胞壁合成生物质能源基因定位

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