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氯菊酯对乳腺肿瘤细胞模型的促增殖作用机制研究

氯菊酯对乳腺肿瘤细胞模型的促增殖作用机制研究

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作者：史明会贵州大学

学位级别：硕士

氯菊酯可通过干扰激素的合成分泌来干扰生物体内稳态,导致各种疾病的发生,其中最重要的一种激素紊乱表现形式是肿瘤的发生和发展。而当前的许多研究发现,氯菊酯对激素依赖性强和激素依赖性弱的肿瘤细胞表现出不同的作用,也对激素依赖性... 详细信息

氯菊酯可通过干扰激素的合成分泌来干扰生物体内稳态,导致各种疾病的发生,其中最重要的一种激素紊乱表现形式是肿瘤的发生和发展。而当前的许多研究发现,氯菊酯对激素依赖性强和激素依赖性弱的肿瘤细胞表现出不同的作用,也对激素依赖性不同的细胞是否由激素的参与来调节细胞生理活性的看法,众说不一。一般认为乳腺癌和内分泌激素紊乱有很大关系,乳腺癌细胞模型是研究激素紊乱效应的经典模型。由此,本文利用氯菊酯处理乳腺肿瘤细胞模型,通过测定细胞生长曲线并运用细胞划痕、细胞集落形成和流式细胞术检测来揭示氯菊酯对乳腺癌细胞系生理活性的影响。在此基础上,运用串联质谱(TMT)技术分析氯菊酯处理前后差异蛋白质的表达情况,从中筛选相关的关键因子;对相关的关键因子与氯菊酯小分子进行模拟结合并对相关关键因子进行功能验证。通过以上方法得到以下研究结果:1、运用CCK-8法检测氯菊酯对MCF-7、MDA-MB-231细胞的增殖影响。结果显示:氯菊酯(0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L和1000μmol/L)处理24 h时,MCF-7和MDA-MB-231细胞在氯菊酯1-100μmol/L处理范围内细胞活力逐渐增强,而在氯菊酯≥1000μmol/L处理时细胞活力下降。在各浓度氯菊酯处理48 h时,MCF-7细胞分别在氯菊酯(100μmol/L、1000μmol/L)处理时细胞增殖极显著;MDA-MB-231细胞在氯菊酯100μmol/L处理时细胞活力最强。而在氯菊酯100μmol/L、48 h处理时,两类细胞均呈现最强的生殖活力且细胞增殖呈现剂量效应。对MCF-7、MDA-MB-231细胞进行细胞划痕,结果显示:氯菊酯(100μmol/L、48 h)处理下,两种细胞的迁移愈合率差异极显著(P细胞进行细胞集落形成发现,氯菊酯(100μmol/L、48 h)处理下,两种细胞的贴壁能力显著增强且细胞的黏附能力提升。同时,流式细胞术检测氯菊酯处理下两种细胞的细胞周期,结果表明,氯菊酯(100μmol/L、48 h)处理促进了两种细胞细胞周期的进程。2、采用串联质谱(TMT)技术对总蛋白质进行差异表达分析,氯菊酯(100μmol/L、48 h)处理细胞(MDA-MB-231),与无氯菊酯处理组比较,差异表达的蛋白一共117个,其中上调84个,下调33个。通过生物信息学方法,用基因本体论GO功能蛋白聚类进行差异表达蛋白的分析,结果显示:差异表达的蛋白主要富集在细胞增殖、脂肪酸生物合成及细胞外基质组织等生物学过程中;另外,蛋白质分子功能主要表现为粘多糖结合、跨膜运输活性、跨膜信号受体活性以及G蛋白偶联受体活性。其中,G蛋白偶联受体家族蛋白(GPR39)、锌转运受体SLC39A7和SLC25A5它们是通路的上游关键因子,在氯菊酯(100μmol/L、48 h)处理后,三种膜转运受体蛋白表达的差异倍数分别为:1.284、1.309和1.264且差异表达极显著。3、结合文献报道本研究选取了GPR39进行验证,对它进行了分子模拟结合分析。通过氯菊酯小分子和GPR39蛋白分子的分子模拟结合模型分析,结果显示:氯菊酯与GPR39受体蛋白有10个结合构象,所涉及的氨基酸残基有丝氨酸、组氨酸和天冬酰胺等,且每个结合构象都存在大小各异的结合能。其中,最大的结合能为6.03KJ,最小的为3.1KJ。4、为了验证氯菊酯是否通过GPR39来促进细胞增殖,并且是否促进GPR39及下游相关通路进行细胞增殖。本研究采用了sh-RNA敲减GPR39后,再联合运用氯菊酯作用进行验证。通过蛋白免疫印迹法检测发现,与正常细胞组比较,氯菊酯单一作用下,在MCF-7、MDA-MB-231细胞中,上游主效基因GPR39及下游主效基因Cyclin D1、PCNA蛋白表达水平显著上调,中间的主效基因ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达显著下调。另外,下游主效基因ER-α的蛋白表达,在MCF-7细胞中显著上调,在MDA-MB-231细胞中不表达。与氯菊酯单一作用组比较,敲减GPR39联合氯菊酯作用下,在MCF-7细胞中,上游主效基因GPR39及下游主效基因ER-α、PCNA蛋白表达极显著下调,中间的主效基因ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达均显著上调。在MDA-MB-231细胞中,上游主效基因GPR39及下游主效基因Cyclin D1和PCNA蛋白表达显著下调,中间的主效基因ERK1/2显著上调而p-ERK1/2蛋白表达不显著。同时,这也进一步验证了氯菊酯能够上调ERK1/2和p-ERK1/2下游的Cyclin D1、PCNA蛋白表达,且Cyclin D1和PCNA是细胞增殖的下游标志蛋白。综上所述,本研究得出氯菊酯能够上调MCF-7、MDA-MB-231细胞内上游主效基因G

关键词：氯菊酯乳腺肿瘤细胞细胞分子调控蛋白质组学分子模拟 GPR39

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