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细胞免疫化学p16/Ki-67双染结合DNA倍体分析预测HSIL的研究

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重庆医学 2017年第13期46卷 1770-1772页

作者：张金秋朱萍陆敏华董建峰印永祥赵华南京医科大学附属无锡市妇幼保健院病理科江苏无锡214002

目的探讨DNA倍体分析联合细胞免疫化学p16/Ki-67双染检测对宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)及宫颈鳞癌(SCC)的诊断价值。方法随机收集细胞学检查73例,其中有少量DNA倍体异常细胞53例,DNA倍体阴性20例,通过细胞免疫化学双染检测p16/Ki-6... 详细信息

目的探讨DNA倍体分析联合细胞免疫化学p16/Ki-67双染检测对宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)及宫颈鳞癌(SCC)的诊断价值。方法随机收集细胞学检查73例,其中有少量DNA倍体异常细胞53例,DNA倍体阴性20例,通过细胞免疫化学双染检测p16/Ki-67结果。以病理结果为金标准,对比分析DNA倍体分析和DNA倍体分析联合p16/Ki-67双染对HSIL+的诊断价值。结果 20例DNA倍体阴性的标本中p16/Ki-67双染结果全部阴性。DNA倍体分析对HSIL+的阳性预测值为34.62%,DNA倍体分析联合p16/Ki-67双染对HSIL+的敏感性为84.62%,特异性为92.31%,阳性预测值为78.57%,阴性预测值为94.74%,明显高于DNA倍体分析对HSIL+的阳性预测值(P<0.05)。结论 p16/Ki-67双染可以明显提高HSIL检出的预测值,DNA倍体分析联合p16/Ki-67双染是预测HSIL+的有效方法,适合在医疗资源缺乏的地区实施。

关键词：宫颈上皮内瘤样病变 p16/Ki-67双染细胞免疫化学 DNA倍体分析

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细胞免疫化学在白血病中的应用

浙江检验医学 2003年第2期 45-49页

作者：卢兴国浙江大学医学院附属二院

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脑脊液细胞学结合细胞免疫化学诊断脑膜癌病

脑脊液细胞学结合细胞免疫化学诊断脑膜癌病

人源性抗肝癌单克隆抗体的免疫组化及细胞免疫化学研究

2008年浙江省神经病学学术年会

作者：胡兴越夏萍邵宇权浙江大学医学院附属邵逸夫医院神经内科

目的:回顾性分析本科室629例脑脊液细胞学检查结果,并结合脑脊液细胞免疫化学,探讨其对脑膜癌的诊断价值。方法:2006年3月至2008年4月间我科共行脑脊液细胞学检查629例,所有脑脊液标本经自然沉淀法,常规采用迈-格-姬染色,部分标本行细... 详细信息

目的:回顾性分析本科室629例脑脊液细胞学检查结果,并结合脑脊液细胞免疫化学,探讨其对脑膜癌的诊断价值。方法:2006年3月至2008年4月间我科共行脑脊液细胞学检查629例,所有脑脊液标本经自然沉淀法,常规采用迈-格-姬染色,部分标本行细胞免疫化学染色后进行观察。结果在629例脑脊液细胞学结果中,特异性发现恶性肿瘤33例,占全部的5.25%,其中包括中枢神经系统白血病4例(急淋3例,急非淋1例),中枢神经系统淋巴瘤5例(其中以中枢神经系统表现首发4例),转移性癌23例(肺癌13例,乳腺癌2例,肾癌1例,不明原发病灶7例),原发性小脑毛细胞型星形细胞瘤1例。白血病和淋巴瘤患者的脑脊液行细胞免疫组化,可见CD3和(或) CD20等标记物阳性,其中1例急非淋细胞免疫组化见人髓过氧化物酶(MPO)阳性:转移性癌的细胞免疫组化多可见细胞角蛋白(CK)或癌胚抗原(CEA)阳性。结论:脑脊液细胞学对脑膜癌病的诊断有确诊意义,其对肿瘤细胞的特异性发现以转移性癌多见,尤其以中枢神经系统为首发表现时更有助于早期诊断和及时治疗:而脑脊液细胞免疫化学方法有助于鉴别肿瘤细胞的来源,作为常规细胞学的补充,并能为寻找原发灶提供有力的佐证。

关键词：脑脊液细胞学脑膜癌病细胞免疫化学

来源： cnki会议评论

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中华国际医药杂志 2002年第1期1卷 16-17页

作者：张洪德张雪等广东省深圳市龙岗中心医院中国深圳518116

目的建立人源性抗肝癌单克隆抗体细胞株，探讨其特异性。方法用IL-2和美洲商陆（PWM）体外刺激肝癌患者外周血淋巴细胞，再与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合，获得3株人源性抗肝癌单克隆抗体AF3，CB7，CH1，同时进行免疫组化及细胞免疫化学... 详细信息

目的建立人源性抗肝癌单克隆抗体细胞株，探讨其特异性。方法用IL-2和美洲商陆（PWM）体外刺激肝癌患者外周血淋巴细胞，再与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合，获得3株人源性抗肝癌单克隆抗体AF3，CB7，CH1，同时进行免疫组化及细胞免疫化学研究。结果 3株人源性抗肝癌单克隆抗体AF3，CB7，CH1，可以和肝癌组织发生强阳性反应，和胃癌有微弱阳性反应，和其他3种癌组织无反应，3株单抗均能和肝癌QGY-7703细胞呈强阳性反应，与胃癌细胞有微弱阳性反应，与其他3种癌细胞反应为阴性。结论通过人-鼠杂交瘤技术获得了3株能分泌人源性抗肝癌单克隆抗体杂交瘤细胞株，免疫组化与细胞免疫化学证实该单抗具有较好的特异性。

关键词：细胞免疫化学肝癌免疫组化人源性抗肝癌单克隆抗体

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并发心包积液的恶性间皮瘤1例

浙江实用医学 2023年第5期28卷 435-436,446页

作者：柳正贇龚伟郑旭娟丽水市中心医院浙江丽水323000

本文报道浙江省丽水市中心医院2023年5月9日就诊并发心包积液的恶性间皮瘤1例。患者因“咳嗽伴发热、胸闷腹胀半月”就诊,B超提示心包积液,予穿刺置管引流,细胞学涂片见大量散在或成簇可见明显大核仁的肿瘤细胞,细胞边界不清,胞浆浓稠,... 详细信息

本文报道浙江省丽水市中心医院2023年5月9日就诊并发心包积液的恶性间皮瘤1例。患者因“咳嗽伴发热、胸闷腹胀半月”就诊,B超提示心包积液,予穿刺置管引流,细胞学涂片见大量散在或成簇可见明显大核仁的肿瘤细胞,细胞边界不清,胞浆浓稠,一个或多个细胞核,行细胞块及免疫细胞化学,肿瘤细胞免疫细胞化学示,AE1/AE3(+)、EMA(+)、CR(+)、CK5/6(+)、HBME-1(部分+)、D2-40(部分+)、WT-1(部分+)、KI67(约40%+)、Vim(部分+)、Desmin(-)、TTF-1(-)、NapsinA(-)、CK7(-)、CD5(-)、CD117(-)、S100(-)、MelanA(-)、HMB-45(-),诊断为恶性间皮瘤。

关键词：恶性间皮瘤心包积液细胞学细胞免疫化学

采用噬菌体展示结合高通量测序技术筛选和鉴定抗FSH纳米抗体

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采用噬菌体展示结合高通量测序技术筛选和鉴定抗FSH纳米抗体

作者：邱玲玲新疆大学

学位级别：硕士

卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）是由垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种促性腺糖蛋白激素,主要功能为促进颗粒细胞增生,刺激类固醇生成,调节配子细胞的发育和成熟,是下丘脑-垂体-性腺轴中的主要激素之一。研究发现FSH还在... 详细信息

卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）是由垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种促性腺糖蛋白激素,主要功能为促进颗粒细胞增生,刺激类固醇生成,调节配子细胞的发育和成熟,是下丘脑-垂体-性腺轴中的主要激素之一。研究发现FSH还在生殖系统肿瘤、骨质疏松和肿瘤血管形成过程中发挥重要作用,提示FSH有可能作为以上疾病治疗和诊断的新靶标。纳米抗体是源自骆驼科动物重链可变区的分子最小的单域抗体。目前主要通过噬菌体展示技术获得。但是传统的噬菌体展示文库存在多样性不足、筛选所得的克隆代表性不够以及筛选过程费时费力等缺点。高通量技术能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,覆盖了几乎全部B细胞库容（107）,解决了传统噬菌体文库筛选的限制。通过高通量测序技术对筛选前后的噬菌体进行测序,通过前后抗体序列的富集情况,可以获得抗体基因序列。本研究采用FSHβ33-53肽段进行文库的筛选,通过高通量测序技术以及辅助噬菌体文库展示技术,筛选出特异性的纳米抗体。本研究主要进行三方面研究:1.VHH噬菌体展示天然文库的构建以及亲和筛选采集未免疫的骆驼血液,分离总淋巴细胞,提取总的RNA,反转录获得cDNA。PCR获得VHH基因构建到pMECS载体上,电转化到TG1细胞中构建天然噬菌体骆驼文库。库容大小在1.6×109（CFU）/mL。通过噬菌体展示技术进行四轮筛选,用单克隆phage ELISA进行鉴定,挑选阳性的单克隆测序。获得抗体序列VHH-FA7、VHH-FC7、VHH-FB8并亚克隆到原核表达载体pET22b,转化到BL21（DE3）细胞中进行诱导、表达和纯化。ELISA实验中测纳米抗体与FSHβ33-53的结合活性和亲和力。结果表明,单克隆噬菌体ELISA阳性的三个克隆VHH-FA7、VHH-FC7、VHH-FB8纯化蛋白与FSHβ33-53结合力都不高。2.高通量测序鉴定和筛选展示文库亲和筛选前后的噬菌体序列将第一轮输入沉降的噬菌体和第四轮输出的噬菌体进行高通量测序。得到五个富集的抗体序列VHH-1296,VHH-6254,VHH-27036,VHH-40740,VHH-32180,分别将5个抗体基因构建到pET22b载体并转化到BL21（DE3）细胞中,IPTG诱导表达。FSHβ33-53浓度为10μg/mL作为一抗,二抗为链霉素-HPR（1:2500）。TMB显色,450nm下测定OD值。根据OD值确定抗体VHH蛋白与抗体的结合能力。结果:VHH6254在5μg/mL时的结合力为0.4左右,而VHH40740,VHH1296,VHH32180,VHH40740在浓度为5μg/mL时与与FSHβ的结合力较低。3.采用亲和力转移方法将FSHR结合肽移植到骆驼纳米抗体抗原结合区快速获得抗FSHR抗体将FSHR结合肽FSH33-53编码序列分别移植入纳米抗体cAbBCII10的CDR1和CDR3区域中命名为VHH-hFSH1和VHH-hFSH3。并克隆到pET22b载体上,分别转化大肠杆菌BL21（DE3）。IPTG诱导蛋白。采用ELISA方法鉴定纯化的cAbBCII10,VHH-hFSH1、VHH-hFSH3与FSHR的结合力及特异性。结果:通过框架移植获得的VHH-hFSH1,VHH-hFSH3和cAbBCII10蛋白均在细菌胞间质可溶性表达。ELISA实验表明将FSH33-53移植到cAbBCII10的CDR3获得的VHH-hFSH3具有特异结合FSHR活性。结论:cAbBCII10具有作为非抗体亲和力转移骨架的潜能的,但需要进一步优化移植序列以获得高亲和力的抗体。本研究表明,利用高通量测序技术与生物信息学分析相结合,可获得并制备得到具有一定结合力的抗FSHβ33-53的骆驼纳米抗体,说明利用高通量测序技术有可能发现新的纳米抗体。但欲获得高亲和力的抗体还需要结合免疫前的抗体序列丰度分析,以及对实验条件进行优化和对数据进行深入挖掘。

关键词：高通量测序技术纳米抗体卵泡刺激素FSH 细胞免疫化学

采用高通量测序技术发现和鉴定抗卵泡刺激素受体骆驼纳米抗体

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采用高通量测序技术发现和鉴定抗卵泡刺激素受体骆驼纳米抗体

作者：马晓玲新疆大学

学位级别：硕士

卵泡刺激素受体(Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)不仅在生殖系统中发挥重要作用,最近研究发现其在多种肿瘤血管内皮细胞特异性表达,与肿瘤血管新生有密切关系,并且可能参与骨质疏松症的发生。所以FSHR在肿瘤和女性绝经后... 详细信息

卵泡刺激素受体(Follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)不仅在生殖系统中发挥重要作用,最近研究发现其在多种肿瘤血管内皮细胞特异性表达,与肿瘤血管新生有密切关系,并且可能参与骨质疏松症的发生。所以FSHR在肿瘤和女性绝经后骨流失的诊断以及治疗方面是一个潜在的靶点。骆驼纳米抗体是天然缺少轻链的重链抗体的可变区片段,具有分子小(15 k D),免疫原性弱,稳定性强等优点,在疾病的诊断和治疗中具有广阔应用前景。目前主要通过噬菌体展示技术获得纳米抗体,但该技术存在文库多样性有限、筛选结果不确定和不容易得到高亲和力抗体等缺点。高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology,NGS),能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。采用NGS技术可以比较免疫前后的抗体库序列的富集情况,有可能发现和获得抗原特异的抗体。本研究的主要目的在于利用高通量测序技术制备抗FSHR骆驼纳米抗体并验证其特异性以及亲和力,探讨NGS在抗体的发现和鉴定过程中的价值。本研究内容主要包括以下两方面:1、FSHR免疫后骆驼淋巴细胞重链可变区基因库的DNA高通量测序及分析:首先,利用IPTG诱导BL21-pET30a-fshr234原核表达FSHR抗原蛋白,利用镍柱纯化得到的重组蛋白FSHR对新疆双峰驼进行皮下免疫。分离免疫前以及免疫第五次、第六次后的骆驼血清并利用间接ELISA测定血清中抗FSHR抗体滴度;大量采集骆驼全血并分离骆驼外周血淋巴细胞提取总RNA,以反转录c DNA为模板,利用巢式PCR扩增VHH片段并进行高通量测序。最后通过生物信息学软件对二代测序数据进行深度分析得到目的抗体VHH序列。间接ELISA表明在抗原FSHR蛋白免疫六次后,新疆双峰驼血清中抗FSHR抗体滴度到达1:128000,说明抗原FSHR在骆驼体内激起了较高的体液免疫反应,为后期高通量测序的质量提供保证。提取骆驼外周血淋巴细胞的总RNA并反转录得到c DNA,以c DNA为巢式PCR扩增的模板获得目的VHH片段。NGS测序后共获得2,344,304条序列,去除接头拼接后得到1,172,152条VHH序列,低质量序列处理后,最终符合要求的可用的抗体序列有839,219条,质量分数>30%的序列占所有序列的80%。测序后得到的核苷酸长度主要分布在300-350nt附近,且核苷酸长度以325 nt为中心呈泊松分布;通过对CDR3序列的频数统计以及CDR3长度的统计,选择了CDR3频数最高的10个序列作为目的抗体序列并将这些序列构建到pET28b载体上用于纳米抗体的原核表达。2、抗FSHR骆驼纳米抗体的制备以及性质鉴定首先将NGS分析得到的10个VHH序列克隆到原核表达载体pET28b上进行原核蛋白表达,命名为BL21-pET28b-S1-10,利用终浓度为0.2 mM IPTG诱导表达S1-S10蛋白,采用镍离子亲和层析方法纯化诱导表达的S1-S10蛋白。其次利用间接ELISA和Western-Blot检测诱导纯化得到的抗体S1-S10对抗原FSHR的特异性以及结合能力,从而挑选出对抗原结合力较高的特异性抗FSHR抗体。除此之外,利用细胞免疫化学方法检测抗体S6和S9与表达FSHR抗原的真核细胞Caov-3的结合能力。实验结果表明,重组质粒pET28b-S1-10经0.2 mM IPTG、30℃诱导,其中抗体S2、S3、S8、S9、S10有部分上清表达,抗体S5、S6、S7全部为包涵体表达,抗体S1和S4蛋白未成功表达,所有蛋白大小均在19 k D左右。间接ELISA和Western Blot表明,与阴性对照相比较,S6和S9抗体对抗原FSHR有极显著的特异性(p细胞免疫化学检测S6和S9与FSHR阳性表达的人卵巢癌细胞Caov-3无明显结合。本研究表明,原核表达抗原FSHR在新疆双峰驼体内可以激发较高的体液免疫反应。利用高通量测序技术与生物信息学分析相结合,成功获得并制备得到具有一定结合力的抗FSHR骆驼纳米抗体,说明利用高通量测序技术有可能发现新的纳米抗体。但欲获得高亲和力的抗体还需要结合免疫前的抗体序列丰度分析,以及对实验条件进行优化和对数据进行深入挖掘。

关键词：高通量测序技术纳米抗体卵泡刺激素受体细胞免疫化学

简易改良细胞蜡块制作对老年胸腹腔积液诊治临床研究

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甘肃科技纵横 2021年第11期50卷 83-85页

作者：白菊萍张菊梅张掖市第二人民医院甘肃张掖734000

目的:探索细胞蜡块制作技术在胸腹腔积液细胞学诊断中的应用价值。方法:选取我院老年性胸腹腔积液标本129例作为研究对象,均进行常规涂片、液基细胞学制片、细胞蜡块制作石蜡切片,经染色后进行细胞学检查。结果:改良细胞蜡块制作技术操... 详细信息

目的:探索细胞蜡块制作技术在胸腹腔积液细胞学诊断中的应用价值。方法:选取我院老年性胸腹腔积液标本129例作为研究对象,均进行常规涂片、液基细胞学制片、细胞蜡块制作石蜡切片,经染色后进行细胞学检查。结果:改良细胞蜡块制作技术操作流程简单,不需要特殊设备,且能够有效提升胸腹腔积液恶性细胞检出率及细胞学检查的应用范围,此次研究胸腹腔积液标本129例,经细胞学检查良性病变91例(71%),转移性肿瘤35例(27%),原发性肿瘤3例(2%)。结论:胸腹腔积液细胞蜡块技术避免了传统细胞学涂片检查的局限性,通过细胞蜡块制作技术的实施,使细胞蜡块成为细胞学检查通向组织病理及分子病理联系,为临床疾病的诊断和治疗提供更多可靠依据。

关键词：胸腹腔积液脱落细胞学细胞蜡块制作细胞免疫化学靶向治疗

通路抑制剂LY294002、PD98059对SDF-1介导的卵巢癌细胞增殖和侵袭能力的影响

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通路抑制剂LY294002、PD98059对SDF-1介导的卵巢癌细胞增殖和侵袭...

作者：王会军郑州大学

学位级别：硕士

背景与目的基质衍生因子-1（stromalcell-derived factorl,SDF-1）是由骨髓基质细胞及其他相关的间皮细胞和上皮细胞分泌的一种趋化蛋白，系统命名为CXCL12。趋化因子受体4（chemokine receptor4,CXCR4）是SDF-1的主要受体。SDF-1与... 详细信息

背景与目的基质衍生因子-1（stromalcell-derived factorl,SDF-1）是由骨髓基质细胞及其他相关的间皮细胞和上皮细胞分泌的一种趋化蛋白，系统命名为CXCL12。趋化因子受体4（chemokine receptor4,CXCR4）是SDF-1的主要受体。SDF-1与CXCR4特异性结合后形成的SDF-1/CXCR4生物轴广泛参与体内多种病理生理过程，研究证实SDF-1/CXCR4与肿瘤的增殖、浸润和转移密切相关。SDF-1与CXCR4的结构和相互作用机制是发挥其病理、生理功能的基础。尽管有报道称SDF-1、CXCR4在卵巢癌组织及细胞中呈高表达，SDF-1可促进卵巢癌细胞的增殖和侵袭、迁移能力，但关于SDF-1/CXCR4对卵巢癌增殖和侵袭能力影响的作用机制尚不清楚。信号通路的激活是癌发生的早期事件，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号途径是细胞内重要的信号传导通路;分裂原活化抑制剂/蛋白激酶（MEK/ERK）信号途径是重要的细胞外信号传导通路。本实验主要研究SDF-1对卵巢癌细胞的增殖、侵袭能力的促进作用是否能被MEK抑制剂PD98059、Akt抑制剂LY294002所阻断，从而探讨SDF-1/CXCR4生物轴与信号通路MEK/ERK及PI3K/AKT信号通路的关系。方法 1.细胞培养卵巢癌细胞系SKOV3，应用含12%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，置于5%CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中孵育。 2.采用细胞免疫化学检测SDF-1作用不同时间以及不同作用浓度，卵巢癌细胞表达磷酸化AKT（P-AKT）和ERK（P-ERK）水平的变化;3.采用四甲基亚唑蓝（MTT）法检测卵巢癌SKOV3细胞在100ng/ml SDF-1、10μg/ml CXCR4中和抗体、1μg/ml CXCR4抑制剂AMD3100、50μmol/L LY294002、50μmol/L PD98059作用下细胞增殖能力的变化。 4.采用Transwell细胞侵袭实验法检测卵巢癌SKOV3细胞在100ng/ml SDF-1、10μg/ml CXCR4中和抗体、1μg/ml CXCR4抑制剂AMD3100、50μmol/L LY294002、50μmol/L PD98059作用下细胞侵袭能力的变化。 5.采用SPSS16.0统计软件处理数据，定性资料采用等级资料秩和检验;定量资料以x±s表示，方差齐性检验，多组间的比较采用方差分析，多个样本均数的两两比较采用LSD-t检验。检验水准=0.05，以P＜0.05为差异具有统计学意义。结果 1.磷酸化的ERK蛋白主要表达于SKOV3细胞的胞质和胞核中，以胞核表达为主，磷酸化的Akt主要表达于卵巢癌细胞的胞质中，镜下可见棕黄色颗粒。根据阳性细胞数及细胞染色程度表示蛋白表达水平，随着100ng/mlSDF-1作用时间的延长,棕黄色颗粒由浅至深，差异具有统计学意义（P-ERK:2=24.011,P=0.000;P-AKT:2=16.408,P=0.003）;30分钟组与60分钟组相互比较，细胞内棕黄色颗粒的染色程度基本一致，无明显差异（P-AKT:2=4.835，P=0.089;P-ERK:2=1.725，P=0.422）。可见100ng/mlSDF-1的最佳作用时间为30分钟;当作用时间为30分钟时，随SDF-1浓度的增加，P-ERK、P-Akt蛋白的染色程度也随之加重，差异具有统计学意义（P-ERK:2=8.467,P=0.015;P-AKT:2=8.345,P=0.015）。 2.与无血清对照相比，SDF-1组的吸光度值（OD492）明显较高（d=-0.12378，P=0.007）;但同时加入10μg/mlCXCR4中和抗体（d=0.12956,P=0.005）、1μg/mlCXCR4抑制剂AMD3100后（d=0.13900,P=0.003），与SDF-1组相比，吸光度值（OD492）则无明显升高;此外，在SDF-1中同时加入50μmol/L PD98059（d=0.11594,P=0.014）、50μmol/L LY294002（d=0.10978,P=0.025）后，与SDF-1组相比，吸光度值（OD492）亦无明显升高。 3.与无血清对照相比，SDF-1组的迁移细胞数（平均70.2±9.22316个）明显多于无血清对照组（平均23.1±1.64007个），差异具有统计学意义（d=-47.1,P=0.000）;但同时加入10μg/mlCXCR4中和抗体（平均27.7±4.73873个）、1μg/mlCXCR4抑制剂AMD3100（平均30.3±6.25478个）后，细胞穿透数目无明显增多，与SDF-1组相比差异具有统计学意义;此外，同时加入50μmol/L PD98059（平均20.7±4

关键词：卵巢癌细胞基质细胞衍生因子1通路抑制剂细胞免疫化学细胞增殖实验细胞侵袭实验