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马氏珠母贝组蛋白h1基因家族的鉴定及功能分析

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基因组学与应用生物学 2022年第3期41卷 472-481页

作者：梁雪茹曹艳飞杨帅焦钰杜晓东广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心湛江524088 广东省海水养殖生物育种工程实验室湛江524088

组蛋白h1参与高级染色质结构的形成,除结构作用外,组蛋白h1还通过翻译后修饰或特定变体等影响染色质功能和动力学,并具有参与生物免疫反应以及控制细胞增殖等功能。本研究通过构建系统进化树和多序列比对等方法比较分析了马氏珠母贝(Pin... 详细信息

组蛋白h1参与高级染色质结构的形成,除结构作用外,组蛋白h1还通过翻译后修饰或特定变体等影响染色质功能和动力学,并具有参与生物免疫反应以及控制细胞增殖等功能。本研究通过构建系统进化树和多序列比对等方法比较分析了马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)、长牡蛎(Crassostrea gigas)和人(homo sapiens)等9个物种的组蛋白h1基因家族,分析了马氏珠母贝中的组蛋白h1基因在不同发育阶段以及植核后不同时间血细胞转录组中的表达变化,旨在揭示马氏珠母贝中组蛋白h1基因家族的分子进化和功能。结果表明,马氏珠母贝基因组包含23个组蛋白h1基因变体,呈现了该生物的特异性扩张。对马氏珠母贝、长牡蛎和人的组蛋白h1的氨基酸序列进行多序列比对,结果显示,组蛋白h1在物种间的保守性较高。在马氏珠母贝不同发育阶段的转录组中检测到12个组蛋白h1基因转录本,3个组蛋白h1基因在原肠胚期、早期担轮幼虫期、D型幼虫期、担轮幼虫、D型幼虫、投饵前D型幼虫、早期壳顶幼虫期、眼点期、变态后时期和稚贝期表达量升高,1个组蛋白h1基因在卵期和受精卵期显著性高表达,说明组蛋白h1在发育过程中形成了不同的表达机制,产生功能分化,在不同的发育阶段由不同h1基因发挥不同的功能。在血细胞转录组中表达了11个组蛋白h1基因,在植核后3~6 d有9个组蛋白h1基因的表达量有明显增加,在植核后6~12 h,有2个组蛋白h1基因显著性高表达,在植核后12 d其组蛋白h1基因的表达量都基本恢复到植核前水平,进一步证实不同的组蛋白h1基因的功能分化特征。上述结果表明组蛋白h1基因在马氏珠母贝基因组中产生了特异性扩张并形成功能分化,参与调控马氏珠母贝的发育和植核免疫过程。本研究为进一步探究组蛋白h1基因在马氏珠母贝中的功能提供理论基础。

关键词：马氏珠母贝组蛋白h1 基因家族转录组分析基因组分析

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组蛋白h1序列固有无序特性分析

原子与分子物理学报 2016年第6期33卷 1082-1086页

作者：王春玲于家峰王红梅王吉华德州学院物理与电子信息学院德州253023 德州学院生物物理研究所山东省生物物理重点实验室德州253023

组蛋白h1对于高阶染色质结构的形成和基因表达调控具有重要作用.为了揭示组蛋白h1在染色质结构形成中的生物学机制,本文对组蛋白h1三个结构域C-terminal domain(CTD)、N-terminal domain(NTD)和Globular domain(GD)及各区域连接位点对... 详细信息

组蛋白h1对于高阶染色质结构的形成和基因表达调控具有重要作用.为了揭示组蛋白h1在染色质结构形成中的生物学机制,本文对组蛋白h1三个结构域C-terminal domain(CTD)、N-terminal domain(NTD)和Globular domain(GD)及各区域连接位点对应序列氨基酸偏好、复杂度等序列特征进行了系统对比研究,并对各区域进行了固有无序蛋白有序区/无序区预测分析.结果表明,组蛋白h1三个结构中,中间的球状结构域(GD)中的氨基酸序列是非常保守的,NTD富含疏水氨基酸,CTD末端富含碱性氨基酸.进一步的研究表明,CTD和NTD两个结构域普遍具有固有无序特性,因此这些区域具有较大的柔性结构,对其在染色质形成中行使的重要生物学功能具有重要意义.

关键词：组蛋白h1 固有无序蛋白序列分析

组蛋白h1和TAT融合蛋白向细胞内转运DNA能力的研究

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组蛋白H1和TAT融合蛋白向细胞内转运DNA能力的研究

作者：宋红肖吉林大学

学位级别：硕士

组蛋白h1包括了多个亚型,但这些亚型有相类似的结构域:中心球形结构域、N末端区和C末端区,该家族成员都是富含碱性氨基酸的蛋白质,因而能够与带负电荷的DNA通过静电引力相结合,参与细胞内染色体高级结构的形成。Thomas等长期研究发现,C... 详细信息

组蛋白h1包括了多个亚型,但这些亚型有相类似的结构域:中心球形结构域、N末端区和C末端区,该家族成员都是富含碱性氨基酸的蛋白质,因而能够与带负电荷的DNA通过静电引力相结合,参与细胞内染色体高级结构的形成。Thomas等长期研究发现,C末端区在染色质凝聚方面比另两个区域更为重要,即,就与DNA作用而言,该区的氨基酸构成非常重要。研究证实,C末端区氨基酸对DNA凝聚起了决定作用。而且经Schwamborn等的研究发现,h1组蛋白的C末端序列(sequence of h1 C terminatio以下统称h1ct)可能含有多个核定位信号。蛋白转导(protein transduction)是指蛋白具有自主跨过细胞膜转运蛋白的功能,即蛋白自身及和其携带的一些生物大分子(蛋白质、多肽、DNA、寡核苷酸等)组成的融合蛋白均能在无任何辅助条件介导下(如脂质体、磷酸钙、电转化、病毒载体等)快速、高效、无障碍的穿过多种哺乳动物细胞膜进入细胞内,并可在周围细胞间传递,而且被转入细胞内的外源蛋白保留其原有的生物学活性与功能。这种独特的蛋白转导功能对于高效新型疫苗和药物的开发及基因治疗具有重要意义。最早被发现能跨过细胞膜进入细胞的蛋白是人免疫缺陷病毒(hIV-1)的转录激活蛋白(TAT),即hIV-TAT。研究表明,完整的TAT和截短的TAT蛋白(47～57位氨基酸)均具有蛋白转导功能,从而确定了TAT的蛋白转导结构域。由于TAT为穿膜肽,目前的研究表明穿膜肽可携带多种物质,包括亲水性蛋白、多肽、DNA甚至颗粒性物质等进行细胞间或细胞内的传输,并且不受细胞类型的限制。为了证明TAT在没有靶向的情况下可以携带蛋白进入细胞,我们做了第一个实验作为第二个实验的阳性对照。我们通过PCR重叠延伸技术将hIV-ⅠTat蛋白基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因重组获得TAT-GFP融合基因,并通过原核表达系统实现融合基因TAT-GFP(TG)的表达和纯化。通过重组融合蛋白TG作用hela细胞后荧光强度检测显示TAT有很高的转膜效率。由于TAT的转膜效率高,我们将TAT基因和hIct蛋白基因融合,构建了基因转运载体。利用大肠杆菌通过基因工程技术表达TAT-h1ct融合蛋白,获得了TAT-h1ct蛋白的高效制备,通过融合表达his-Tag抗原表位标签对TAT-h1ct重组蛋白进行检测和纯化。用已纯化的TAT-h1ct融合蛋白作为DNA转运载体,对hela细胞和鼠成纤维细胞进行绿色荧光蛋白质粒的转导实验并检测其表达情况。融合蛋白与绿色荧光光蛋白质粒以最佳配比形成复合物后,将其加入培养在24孔板的hela细胞和鼠成纤维细胞,48小时后在激光共聚焦荧光显微镜下观察到hela细胞和鼠成纤维细胞内有较强的绿色荧光,表明绿色荧光蛋白基因得到了表达。而对照组hela细胞和鼠成纤维细胞中没有绿色荧光。这一结果显示TAT-h1ct融合蛋白可以介导DNA进入细胞,有较强的转运DNA的能力,为其发展成为基因导入系统奠定了基础。

关键词：组蛋白h1 穿膜肽TAT 非病毒基因转运载体

应用光学生物传感器测定DNA与组蛋白h1的结合常数

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武汉大学学报（理学版） 2005年第6期51卷 753-756页

作者：汤凯胡兴邹国林武汉大学生命科学学院湖北武汉430072

用一种新的基于共振镜技术(resonant mirror)的IAsys光生物传感器分别测定了小牛胸腺DNA(ctDNA),鲑鱼精DNA(hsDNA),pUC-18质粒DNA与组蛋白h1相互作用的结合和解离的动力学速率常数(ka,kd)和解离平衡常数(KD).结果表明ctDNA与h1的结合作... 详细信息

用一种新的基于共振镜技术(resonant mirror)的IAsys光生物传感器分别测定了小牛胸腺DNA(ctDNA),鲑鱼精DNA(hsDNA),pUC-18质粒DNA与组蛋白h1相互作用的结合和解离的动力学速率常数(ka,kd)和解离平衡常数(KD).结果表明ctDNA与h1的结合作用最强,其KD值为5.44×10-7mol.L-1,hsDNA,pUC-18质粒DNA与组蛋白h1的KD值分别为73.34×10-7,67.93×10-7mol.L-1.

关键词：结合常数 DNA 组蛋白h1 光牛物传感器

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菲咯啉铜配合物与组蛋白h1的相互作用

武汉大学学报（理学版） 2008年第4期54卷 443-446页

作者：蔡小强潘逆娜郑忠亮邹国林武汉大学生命科学学院湖北武汉430072

用IAsys光学生物传感器与荧光淬灭法研究了菲咯啉铜配合物与组蛋白h1的相互作用,得出了在25℃和ph 7.4条件下两者的结合常数和结合位点数.结果表明,菲咯啉铜配合物与组蛋白h1具有较强的相互作用,其结合常数数量级可达到105,两者相互作... 详细信息

用IAsys光学生物传感器与荧光淬灭法研究了菲咯啉铜配合物与组蛋白h1的相互作用,得出了在25℃和ph 7.4条件下两者的结合常数和结合位点数.结果表明,菲咯啉铜配合物与组蛋白h1具有较强的相互作用,其结合常数数量级可达到105,两者相互作用时只有一个结合位点,菲咯啉铜配合物与组蛋白h1的结合常数是单独的菲咯啉配体的6倍.推测菲咯啉铜配合物在诱导细胞凋亡的过程中在与组蛋白h1结合处切割核小体上的DNA,从而产生凋亡所特有的DNA片段化阶梯现象.

关键词：菲咯啉铜配合物组蛋白h1 相互作用

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组蛋白h1的研究进展

江苏农业科学 2020年第13期48卷 34-40页

作者：马佳琦刘鹏扬州大学江苏省作物遗传生理国家重点实验室/植物功能基因组学教育部重点实验室/江苏省作物基因组学与分子育种重点实验室/粮食作物现代产业技术协同创新中心江苏扬州225009 扬州大学农业科技发展研究院/教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

核小体是染色质的基本结构单位,DNA缠绕在组蛋白八聚体外侧形成核小体。核小体的串珠结构在组蛋白h1的存在下形成紧密的30 nm染色质纤维。多种h1亚型的存在及其不同翻译后修饰揭示组蛋白h1功能的复杂性。本文综述了组蛋白h1的生物学功能... 详细信息

核小体是染色质的基本结构单位,DNA缠绕在组蛋白八聚体外侧形成核小体。核小体的串珠结构在组蛋白h1的存在下形成紧密的30 nm染色质纤维。多种h1亚型的存在及其不同翻译后修饰揭示组蛋白h1功能的复杂性。本文综述了组蛋白h1的生物学功能,h1在表观修饰、基因转录和DNA复制方面的调控机制,并概括了h1翻译后修饰及其功能调控的研究进展,为h1的研究工作提供了参考。

关键词：组蛋白h1 表观遗传修饰基因转录翻译后修饰

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水稻连接组蛋白h1的克隆与鉴定

水稻连接组蛋白H1的克隆与鉴定

作者：马佳琦扬州大学

学位级别：硕士

染色质(Chromatin)是在细胞中发现的大分子复合物,由DNA,蛋白质和RNA组成,核小体是染色质的基本结构单位,由组蛋白和DNA构成。组蛋白h1是连接核小体与DNA的连接组蛋白,作为染色体的基本蛋白,主要参与染色体高级结构的维持与稳定。在哺... 详细信息

染色质(Chromatin)是在细胞中发现的大分子复合物,由DNA,蛋白质和RNA组成,核小体是染色质的基本结构单位,由组蛋白和DNA构成。组蛋白h1是连接核小体与DNA的连接组蛋白,作为染色体的基本蛋白,主要参与染色体高级结构的维持与稳定。在哺乳动物人和小鼠的研究中普遍发现,组蛋白h1对大部分基因表达具有明显的抑制作用,在表观遗传修饰水平如组蛋白修饰和高度DNA甲基化的异染色质区域发挥重要作用。目前,这些研究结论主要在哺乳动物中被证实,在水稻中未见组蛋白h1功能的报道与相关研究。本研究以水稻日本晴品种为研究材料,克隆了4个水稻组蛋白h1基因,构建了h1过表达载体和亚细胞定位载体,培育了稳定转化水稻材料,并对h1过表达转基因水稻株系进行了初步的鉴定与分析。同时在水稻原生质体瞬时转化体系中观察h1亚细胞定位,Western Blot验证h1蛋白表达水平,系统分析了水稻中组蛋白h1与基因表达的关系。相关研究结果有助于在全基因组水平更好地理解水稻组蛋白h1在水稻基因组中的调控功能。主要研究结果如下:1.根据生物信息学分析结果,结合水稻公共数据库中和已发表的文献中查阅到4个已注释为组蛋白h1的基因,分别为LOCs04g18090(Csh1.1)、LOCs06g04020(Osh1.2)、LOC-Os03g58470(Osh1.3)、LOCs07g08710(Osh1.4)、将其与人、拟南芥组蛋白h1进行序列比对分析,发现水稻组蛋白h1与拟南芥组蛋白h1亲缘关系较近,与人类组蛋白h1亲缘关系较远。2.提取日本晴品种苗期叶片的RNA,成功克隆4个组蛋白h1的编码序列,构建了由水稻Ubi启动子启动的h1过表达载体。通过农杆菌介导法侵染水稻愈伤组织,经过筛选分化、生根培养等过程,分别获得Osh1.1、Osh1.2、Osh1.4各20个以上的转化子,经潮霉素抗性鉴定表明,其中约70%为阳性转基因植株。自交获得转基因T0代籽粒,发现T0代籽粒粒型变化显著,籽粒明显变细长,千粒重下降。3.构建由CaMV35S启动子启动的h1-GFP融合蛋白的亚细胞定位载体。利用水稻原生质体瞬时表达系统,在原生质体中进行亚细胞定位,结果表明4个组蛋白h1均定位在细胞核中。Western Blot实验验证水稻h1蛋白在原生质体中的表达。***1.1转化原生质体后提取RNA进行高通量转录组测序分析,4个样品(对照组和过表达组各两个重复)经过测序质量控制共得到7.5 Gb clean data。将各个样品测序序列分别比对到水稻参考基因组进行基因表达量分析,发现水稻Osh1.1的对照组和过表达组的表达量分别为134.178,51638;过表达组表达量是对照组的385倍。筛选了3721个差异表达基因,其中1669个基因显著上调,2052个基因显著下调。结合GO和KEGG分析,发现Osh1.1表达量的变化主要影响光合作用、焦磷酸酶活性等途径的相关基因表达。Osh1.1过表达同时也影响一些粒型相关基因的表达。

关键词：组蛋白h1 转基因水稻原生质体转化 RNA-seq

中华绒螯蟹精子发生过程中组蛋白h1及其变体和分子伴侣的表达特征

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中华绒螯蟹精子发生过程中组蛋白H1及其变体和分子伴侣的表达特征

作者：李路河北大学

学位级别：硕士

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)隶属节肢动物门(Arthropod)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae),是我国重要的经济蟹类之一。雄性中华绒螯蟹精子核为非浓缩核,染色质不同于一般动物精子核的致密结构,且形成机制... 详细信息

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)隶属节肢动物门(Arthropod)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae),是我国重要的经济蟹类之一。雄性中华绒螯蟹精子核为非浓缩核,染色质不同于一般动物精子核的致密结构,且形成机制未知。组蛋白作为核小体的重要组成部分,其翻译后修饰产物、组蛋白变体对蛋白质和DNA结合程度、DNA转录水平产生影响,进而调控染色质或染色体的结构,发挥所需生物学功能。同时在体内,分子伴侣对组蛋白与DNA形成正确构象的核小体具有辅助作用。为探究中华绒螯蟹精子发生过程中非浓缩核形成的原因,本文以保守性低的组蛋白h1为切入点,研究其变体组蛋白h1.1等、分子伴侣核质蛋白1-假基因9(Nucleophosmin1 pseudogene9,NPM1P9)、核小体组装蛋白1样1(Nucleosome assembly protein 1 like 1,NAP1L1)在精子发生过程的表达和动态分布特征。同时,研究组蛋白h1与分子伴侣NPM1P9间的相互作用,旨在从分子和细胞水平进行全面探究。本研究利用分子克隆技术,构建h1、h1.1和NPM1P9的表达载体并表达相应蛋白;利用单克隆抗体制备技术获得组蛋白h1单克隆抗体(Monoclonal antibody h1,McAb-h1)和组蛋白h1.1单克隆抗体(Monoclonal antibody h1.1,McAb-h1.1);通过免疫印迹、免疫荧光技术探究它们在精子发生过程中的表达及动态分布特征;利用实时荧光定量PCR探究h1与h1.1基因在心脏、肌肉、肝胰腺、精巢中的相对表达;通过生物信息学分析组蛋白h1和h1.1的氨基酸组成和蛋白结构;利用免疫共沉淀技术探究组蛋白h1与其分子伴侣NPM1P9间的相互作用。实验结果表明:成功构建h1、h1.1和NPM1P9的表达载体,经转化、诱导、纯化,成功在体外表达组蛋白h1、h1.1和NPM1P9蛋白;经小鼠免疫、细胞融合获得McAb-h1和McAb-h1.1,其效价均达到1:204800以上。在中华绒螯蟹精子发生过程中,精巢中存在组蛋白h1、磷酸化修饰的组蛋白h1.1;精子中可能存在组蛋白h1、h1.1相应剪接变体h1-delta-like、h1-delta。在精巢中,h1.1基因较h1基因表达量高,且呈显著性差异(Ph1.1基因在精巢中的表达量较心脏、肌肉、肝胰腺中的高,且呈极显著性差异(P蛋白从细胞质向细胞核转移,且精子中可能存在NPM1P9变体;同时,组蛋白h1和其分子伴侣NPM1P9存在相互作用。本研究为解释中华绒螯蟹精子发生过程中,组蛋白h1、h1变体及其分子伴侣对精子核染色质的包装、非浓缩核的形成奠定基础;同时,为研究其他十足目动物精子提供参考和借鉴。

关键词：中华绒螯蟹精子发生组蛋白h1 组蛋白变体分子伴侣单克隆抗体

中华绒螯蟹组蛋白h1基因的克隆及其在精巢发育中的表达特征

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中华绒螯蟹组蛋白H1基因的克隆及其在精巢发育中的表达特征

作者：钱陪陪河北大学

学位级别：硕士

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis),是我国重要的经济蟹类之一。为了研究组蛋白h1在中华绒螯蟹非浓缩核形成中的作用及在其精子发生过程中的动态变化,本文采用PCR和RACE技术获得了中华绒螯蟹组蛋白h1基因的全长c DNA序列。通过生物信息学... 详细信息

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis),是我国重要的经济蟹类之一。为了研究组蛋白h1在中华绒螯蟹非浓缩核形成中的作用及在其精子发生过程中的动态变化,本文采用PCR和RACE技术获得了中华绒螯蟹组蛋白h1基因的全长c DNA序列。通过生物信息学方法对该基因进行了分析,其中包括:组蛋白h1的氨基酸分析,三级结构分析和比较,同源性分析,系统树分析和基因组结构特征分析。同时采用实时定量PCR技术分析了组蛋白h1及h1-delta在中华绒螯蟹精巢发育不同时期的表达特征。研究结果如下:中华绒螯蟹组蛋白h1基因的全长c DNA序列为804 bp,包括79 bp的5′非编码区(5′UTR)、185 bp的3′非编码区(3′UTR)和540 bp的开放阅读框(ORF),共编码179个氨基酸,所编码多肽的相对分子量为18.28 k Da,理论等电点p I为10.93。此研究首次成功确定、克隆并测序了中华绒螯蟹h1基因的全长c DNA序列。对比中华绒螯蟹、家鼠和鲫鱼的h1结构域的三级结构,证明h1的结构域在进化上是保守的。氨基酸序列同源性分析发现,组蛋白h1在同一属间的保守性很高(90%以上),但在不同属间的保守性却较低(50%左右),尤其是C末端结构差异很大。实时定量PCR技术的结果显示,h1及h1-delta在中华绒螯蟹精巢不同发育期均具有表达,且表达量均在精母细胞时期达到最大,之后逐渐下降,到精子期时下降至最低。h1在精原细胞期、精母细胞期、精细胞期的表达量与精子期相比均呈现出显著差异(Ph1-delta的表达量只有精母细胞期与精子期有显著差异。这些研究将为探讨组蛋白在中华绒螯蟹精子发生中的动态变化及进一步探究中华绒螯蟹精子核的非浓缩成因提供依据。

关键词：中华绒螯蟹非浓缩精子核组蛋白h1 基因克隆实时定量PCR