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代谢工程改造拜氏梭菌强化丁醇合成

代谢工程改造拜氏梭菌强化丁醇合成

作者：信欣大连理工大学

学位级别：硕士

生物丁醇作为石油替代品,具有能量密度高、挥发性低、腐蚀性弱等物理特性。拜氏梭菌是用于生物法生产丁醇的极具潜力的工业菌株,但是利用拜氏梭菌生产丁醇也存在一些缺陷,如丁醇产量低,发酵副产物丙酮比例较高,木糖利用效率低,以及适用... 详细信息

生物丁醇作为石油替代品,具有能量密度高、挥发性低、腐蚀性弱等物理特性。拜氏梭菌是用于生物法生产丁醇的极具潜力的工业菌株,但是利用拜氏梭菌生产丁醇也存在一些缺陷,如丁醇产量低,发酵副产物丙酮比例较高,木糖利用效率低,以及适用于拜氏梭菌的基因编辑技术有限等。因此,本论文主要针对以上问题进行了探究。参与调控因子Spo0A磷酸化的组氨酸激酶在一些产溶剂梭菌,例如丙酮丁醇梭菌中可以调控溶剂合成和孢子分化,而在拜氏梭菌中还没有相关研究。通过同源比对,筛选出6个与丙酮丁醇梭菌组氨酸激酶同源序列超过30%的候选基因,包括cbei2073,cbei4484,cbei2087,cbei2435,cbei4925和cbei1553。采用CRISPR-Cas9n基因编辑技术对上述基因进行删除。敲除基因cbei2073和cbei4484使丁醇产量发生显著性的变化,丁醇浓度分别从9.8 g/L提高到13.8 g/L和11.5 g/L,分别提高了40.8%和17.3%。而且,两株突变菌的丁醇合成速度更快,丁醇生产强度相对于野生菌株分别提高了40.0%和20.0%,证明这两个组氨酸激酶在拜氏梭菌中对胞内的产物合成代谢起到重要的调控作用。同时这两株组氨酸激酶失活菌株的孢子形成数量与野生菌株相比分别降低了96.9%和77.4%。另外四个组氨酸激酶(包括Cbei2087,Cbei2435,Cbei4925和Cbei1553)失活菌株的丁醇产量与野生菌株相比没有明显变化。对控制丙酮合成的乙酰乙酸脱羧酶编码基因adc进行敲除,发酵几乎不产丙酮,乙醇和丁醇浓度也降低,但是丁醇占总溶剂比例(B/ABE)由野生型的69.8%提高到95.0%,是拜氏梭菌产丁醇比例最高的报道;另外,乙酸和丁酸分别从0.5 g/L和0.6 g/L增加到4.0 g/L和1.9 g/L,有机酸积累严重抑制了突变株的生长,使OD的最大值从3.0降低到2.2。为了恢复丁醇产量,尝试了进一步敲除调控丁醇合成的组氨酸激酶编码基因cbei2073,添加甲基紫精调节电子流,过表达酸重吸收相关基因cbei0305和ald/ctfAB,以及通过dCas9技术抑制基因adc的表达,但均未能提高丁醇产量。在拜氏梭菌中,木糖的转运主要通过木糖质子转运体完成。为提高木糖利用率,通过带有硫解酶强启动子的pIMP1质粒过表达了编码基因xylT,以木糖为碳源进行发酵。与野生型相比,xylT过表达菌株的生长情况没有明显变化,利用木糖能力得到了显著提高,木糖消耗量从19.3 g/L提高到23.6 g/L,提高了22.3%。同时,丙酮、丁醇和乙醇的产量均有不同程度的提高,分别提高了71.2%,14.3%和50.0%,丁酸产量提高了约3倍。可见,xylT基因过表达菌株对木糖的转运能力和代谢木糖转化为代谢产物的能力均得到了强化。本论文表明组氨酸激酶参与拜氏梭菌的丁醇合成代谢和孢子发育过程,并提供了提高代谢产物浓度的有效的基因工程策略。此外,本课题得到的高丁醇浓度生产菌、高比例丁醇合成菌以及强化了木糖转运能力的改造菌,都具有潜在的实现工业化生产丁醇的应用价值。

关键词：丁醇 ABE发酵组氨酸激酶乙酰乙酸脱羧酶木糖转运

选择性标记方法研究HK853的酸碱调控机制

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选择性标记方法研究HK853的酸碱调控机制

作者：吉仕夏中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)

学位级别：硕士

双组分信号转导系统(Two-component signal transduction system,TCS)是细菌感知和响应周围环境的主要手段,细菌的绝大多数生理过程(例如感知渗透压、营养元素的代谢、细胞壁的合成、细胞的增值和分裂等)都受到双组分系统的调控。双组... 详细信息

双组分信号转导系统(Two-component signal transduction system,TCS)是细菌感知和响应周围环境的主要手段,细菌的绝大多数生理过程(例如感知渗透压、营养元素的代谢、细胞壁的合成、细胞的增值和分裂等)都受到双组分系统的调控。双组分信号转导系统在细菌中广泛存在,一些真菌和植物中也发现了一些双组分系统,但是目前为止还未在人类和其他哺乳动物中发现它的存在,双组分系统因此被认为有发展为抗菌药物靶点的潜力。组氨酸激酶(Histidine Kinase,HK)和应答调节蛋白(Response Regulator,RR)是双组分信号转导系统的两个主要组成蛋白。HK能感应环境刺激并将这种刺激信号通过磷酸基团的转移传递给下游的RR,而磷酸化的RR能通过与基因或蛋白质靶标的相互作用调控信号输出,或者通过去磷酸化对细胞调控进行终止。在细菌的双组分信号转导系统中,大多数HK具有多功能性,不仅能实现自身磷酸化并传递磷酸基团给RR蛋白,还能介导催化RR蛋白的去磷酸化。在不同pH条件下,组氨酸激酶HK853胞内全长蛋白(HK853cp)与底物应答调节蛋白RR468形成的复合物的晶体结构存在差异。His260残基是HK853参与去磷酸化反应关键位点,复合物晶体结构显示其咪哇侧链在不同pH下的空间位置明显不同。组氨酸的咪唑侧链在催化反应中常通过不同的质子化状态灵活调控反应进程,但是受限于晶体结构的分辨率,关键残基His260在催化去磷酸化反应时的质子化状态并不清晰。解析His260位点在HK853进行激酶和磷酸酶功能切换时的质子交换过程,是研究HK的酸碱调控机制的关键。核磁共振波谱技术在研究生物大分子之间的相互作用具有优势,但是由于HK853cp与底物RR468形成的复合物分子量超过85 kDa,普通的同位素标记方法无法获得可分辨的NMR信号。本文运用磷酸基团类似物BeF3-获得HK853与RR468的稳定磷酸化复合物,采用选择性标记的方法对HK853 DHp结构域(HK853)组氨酸残基侧链的ε1-C进行同位素标记,获得了清晰的NMR信号。将不同组氨酸位点分别进行定点突变,对H-CHSQC谱图进行了信号归属。H-CHSQC的pH滴定实验测定了HK853及其复合物质子交换过程的pKa值,活性位点His260的pKa值变化明显异于其他非活性位点的组氨酸,且该pKa值与去磷酸化实验获得的HK853行使磷酸酶功能的最佳pH值范围相对应。另外,运用定点突变的方法我们获得了HK853的一系列突变体,利用去磷酸化功能实验测定HK853及突变体的磷酸酶活性,结合19F NMR pH滴定的结果,确定了DHp结构域上的另一个保守残基Thr264对HK853的磷酸酶功能的影响。综上所述,本文运用C-His选择性同位素标记的方法,获得了 HK853及其复合物HK853-BeF--RR468的高分辨NMR谱图。通过H-CHSQC的pH滴定实验测定其pKa值,确定了 His260位点在HK853行使磷酸酶功能时的质子化状态;通过FNMR pH滴定和磷酸酶活性测定确定了 Thr264位点与His260协同作用影响HK853的磷酸酶功能,进一步阐明了组氨酸激酶HK853的酸碱调控机制,为双组分信号转导系统调控机制的研究提供了新的数据,有助于打开新型抗菌药物设计的思路,同时本文运用氨基酸侧链选择性标记研究TCS分子机制的方法为类似蛋白质体系的研究提供了可借鉴的经验。

关键词：双组分信号转导系统核磁共振选择性标记组氨酸激酶磷酸化

Sequence analysis of the Microcystis aeruginosa FACHB-912 phytochrome gene supports positive selection in cyanobacteria

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Chinese Science Bulletin 2012年第25期57卷 3270-3276页

作者： SHI Fei LI Nan LIU ShaoFang QIN Song Yantai Institute of Coastal Zone Research Chinese Academy of SciencesYantai 264003China Marine Biotechnology Research Center Korean Ocean Research&Development InstituteAnsan 425600Republic of Korea Graduate University of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049China Institute of Oceanology Chinese Academy of SciencesQingdao 266071China

The phytochrome gene from Microcystis aeruginosa FACHB-912,isolated from algal blooms in Taihu Lake in China,was sequenced and found to code for a wavelength transition light receptor *** gene was composed of five distinct domains:a PAS fold domain,a GAF domain,a phytochrome domain,a His Kinase A(phosphoacceptor) domain,and a histidine kinase ***-absorbing phytochrome,far-red-absorbing phytochrome,and photoconversion kinetics were monitored via the spectral characteristics of the *** detect positive selection,homologous sequences from cyanobacterium phytochrome genes were obtained from *** selective pressure was identified by phylogenetic analysis with maximum likelihood *** frequency of the phytochrome gene being subjected to selective constraints suggests that positive selection is a potentially important mechanism that promotes the evolution of the cyanobacteria phytochrome *** sites identified in this study provide targets for further research on the structural-functional role of these residues,and on the correlation with the mechanism of algal blooms.

关键词：光敏色素色素基因铜绿微囊藻蓝藻水华正选择序列分析 GenBank 组氨酸激酶

Bioinformatics analysis of two-component regulatory systems in Staphylococcus epidermidis

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Chinese Science Bulletin 2004年第12期49卷 1267-1271页

作者： QINZhiqiang ZHONGYang ZHANGJian HEYouyu WUYang JIANGJuan CHENJiemin LUOXiaomin QUDi MinistryofEducationandHealthKeyLaboratoryforMedicalMolecularVirology MedicalSchoolofFudanUniversityShanghai200032China MinistryofEducationKeyLaboratoryforBiodiversityScienceandEcologicalEngineering SchoolofLifeSciences.FudanUniversityShanghai200433China DrugDiscoveryandDesignCenter StateKeyLaboratoryofDrugResearchShanghaiInstituteofMateriaMedicaChineseAcademyofSciencesShanghai201203China BioinformaticsCenter ShanghaiInstitutesforBiologicalStudiesChineseAcademyofSciencesShanghai200031China

Sixteen pairs of two-component regulatory systems are identified in the genome of Staphylococcus epidermidis ATCC12228 strain, which is newly sequenced by our laboratory for Medical Molecular Virology and Chinese National Human Genome Center at Shanghai, by using bio- informatics analysis. Comparative analysis of the two- component regulatory systems in S. epidermidis and that of S. aureus and Bacillus subtilis shows that these systems may regulate some important biological functions, e.g. growth, biofilm formation, and expression of virulence factors in S. epidermidis. Two conserved domains, i.e. HATPase_c and REC domains, are found in all 16 pairs of two-component proteins. Homologous modelling analysis indicates that there are 4 similar HATPase_c domain structures of histidine kinases and 13 similar REC domain structures of response regulators, and there is one AMP-PNP binding pocket in the HATPase_c domain and three active aspartate residues in the REC domain. Preliminary experiment reveals that the bioinfor- matics analysis of the conserved domain structures in the two-component regulatory systems in S. epidermidis may provide useful information for discovery of potential drug target.

关键词：生物信息学二元调整系统葡萄状球菌表皮菌组氨酸激酶反应调节器药物目标

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拟南芥中的双组分信号系统

硅谷 2008年第20期 1-1页

作者：戴雅芳扬州工业职业技术学院

双组分系统是广泛存在于原核和真核细胞中的信号转导系统,主要由组氨酸激酶和响应调节因子组成。随着拟南芥基因组测序的完成和功能基因组的深入研究,发现在拟南芥基因组中有54种蛋白质参与了双组分信号系统的磷酸传递过程。综述近年来... 详细信息

双组分系统是广泛存在于原核和真核细胞中的信号转导系统,主要由组氨酸激酶和响应调节因子组成。随着拟南芥基因组测序的完成和功能基因组的深入研究,发现在拟南芥基因组中有54种蛋白质参与了双组分信号系统的磷酸传递过程。综述近年来拟南芥植物中双组分系统的研究进展。

关键词：双组分信号系统组氨酸激酶 ATHK1基因磷酸转移中间体响应调节因子

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植物信号转导中的双组分体系

首都师范大学学报（自然科学版） 2004年第3期25卷 65-68,72页

作者：李高岩蒋广龙杨奇志印莉萍首都师范大学生物系北京100037

双组分体系是广泛存在于原核和真核细胞中的信号转导体系 ,主要由组氨酸激酶和反应调节子两个组分组成 .双组分体系信号通路一般包括信号输入、组氨酸激酶自身磷酸化、反应调节子磷酸化和信号输出等环节 .本文综述了近年来。

关键词：植物信号转导双组分体系组氨酸激酶反应调节子

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异硫氰酸酯对玉米小斑病菌的抑菌机制研究

异硫氰酸酯对玉米小斑病菌的抑菌机制研究

中国植物病理学会2023年学术年会

作者：贾宛桐于汇琳范津毓张继月潘洪玉张祥辉吉林大学植物科学学院

玉米小斑病(Southern corn leaf blight,SCLB)是世界玉米主产区最主要的叶部病害之一,对玉米的产量和品质影响极大。异硫氰酸酯(ITCs)是十字花科植物产生的一种有毒的次生代谢产物,对多种能够侵染十字花科植物的病原菌有强烈抑制活性,... 详细信息

玉米小斑病(Southern corn leaf blight,SCLB)是世界玉米主产区最主要的叶部病害之一,对玉米的产量和品质影响极大。异硫氰酸酯(ITCs)是十字花科植物产生的一种有毒的次生代谢产物,对多种能够侵染十字花科植物的病原菌有强烈抑制活性,但是对于不能侵染十字花科植物的病原菌的抑制活性还未见报道。高渗透甘油促分裂原活化蛋白激酶(HOGMAPK)途径是细胞感受外界高渗胁迫环境,进行信号转导,调控下游转录因子和靶基因表达的重要信号途径,其不仅参与到植物病原真菌对非生物逆境胁迫的响应,也参与多种生物逆境胁迫应答过程。组氨酸激酶(histidine kinase,HKs)作为信号受体蛋白,其在HOG-MAPK途径上游起作用。笔者研究表明,ITCs对玉米小斑病菌的营养生长、分生孢子萌发和致病性有明显抑制作用,并可抑制病菌黑色素合成酶和细胞壁降解酶的表达,而氧化还原平衡相关蛋白ChTrx2和ChNox1的缺失突变体表现对ITCs更为敏感。通过转录组学和蛋白组学联合分析,笔者发现AITC处理后的玉米小斑病菌中多个HKs以及HOG-MAPK途径核心激酶Ssk2、Pbs2和Hog1显著上调表达,可能是ITCs的作用靶标。通过构建以上基因的缺失突变体,明确敲除ChSSK2、ChPBS2和ChHOG1后都会对ITCs的敏感性增加,同时该通路在氧化胁迫、高渗胁迫中都发挥着关键作用,并且突变体对玉米的致病力都明显下降。笔者也发现组氨酸激酶编码ChNIK1基因的缺失后对A-ITC、戊唑醇和嘧菌酯等更为敏感,并且不同的组氨酸激酶都参与病菌适应多种胁迫和生长发育过程。这些结果表明HOG-MAPK途径以及其上游的组氨酸激酶在玉米小斑病菌响应ITCs胁迫和发育致病中有重要作用,能为新型杀菌剂靶标的开发提供理论依据和技术支撑。

关键词： HOG-MAPK途径组氨酸激酶异硫氰酸酯敏感性玉米小斑病菌

来源： cnki会议评论

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二元信号系统的研究进展

河北医药 2015年第8期37卷 1229-1232页

作者：李宏波赵立斌河北省抚宁县人民医院 066300

二元信号系统（ two-component signaling system， TCSS）是一种普遍存在于细菌中的重要的信号传导系统，也是基因表达的重要调控系统［1，2］。病原菌在感染宿主的过程中，能通过该系统密切感受和应答体内外各种微环境的变化，进而调... 详细信息

二元信号系统（ two-component signaling system， TCSS）是一种普遍存在于细菌中的重要的信号传导系统，也是基因表达的重要调控系统［1，2］。病原菌在感染宿主的过程中，能通过该系统密切感受和应答体内外各种微环境的变化，进而调节各种基因表达以完成其致病过程［3］。因此，全面系统地了解和掌握 TCSS的结构功能和作用机制及病原菌毒力基因、耐药基因等的表达调控机制，将大大地促进我们对病原菌致病机理的认识，也有助于我们深入地了解细菌耐药性形成机制，为临床诊断、治疗和预防病原菌感染提供依据，为开发新型抗细菌耐药性药物提供指导。

关键词：二元信号系统组氨酸激酶应答调节蛋白抗生素耐药性抑制剂

YycG小分子抑制剂衍生物的抗菌及抗生物膜活性的研究

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