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细菌趋化性组氨酸激酶CheA的催化结构域与调节结构域之间连接的功能研究

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细菌趋化性组氨酸激酶CheA的催化结构域与调节结构域之间连接的功...

作者：丁薛晔扬州大学

学位级别：硕士

细菌趋化性是双组分信号转导系统中一典型信号转导途径。在该途径中,组氨酸激酶CheA自磷酸化,催化ATP的水解,并将高能磷酸基团传递给CheA的同源应答调控分子CheY。磷酸化的CheY蛋白与鞭毛马达蛋白相互作用,引起鞭毛转动方向的改变,进而... 详细信息

细菌趋化性是双组分信号转导系统中一典型信号转导途径。在该途径中,组氨酸激酶CheA自磷酸化,催化ATP的水解,并将高能磷酸基团传递给CheA的同源应答调控分子CheY。磷酸化的CheY蛋白与鞭毛马达蛋白相互作用,引起鞭毛转动方向的改变,进而改变细菌游动的方向。细菌趋化性信号的转导除了双组分CheA和CheY,还需要耦合蛋白CheW和跨膜化学受体的配合。CheA的调节结构域(P5)、CheW和跨膜化学受体三者相互作用,形成非常稳定的信号复合物。在信号复合物内,CheA的激酶活性受到调节,跨膜化学受体感受到外界环境信号后,信号复合物表现出激酶开或者激酶关的输出状态,细菌的游动行为就反应了受体信号复合物在这两种状态下的比例。所以,组氨酸激酶CheA在细菌趋化性信号的融合、转换和放大过程中发挥着核心作用。尽管近些年来本研究领域在理解信号复合物结构方面取得了突破,但是在这一结构框架内CheA激酶活性被调节的分子机制依然不清晰。前期的研究结果显示,CheA的催化结构域(P4)和调节结构域之间的域间连接,P4-P5连接,可能介导从P5-CheW-受体相互作用界面到催化结构域P4的调节信号的传递。为了研究这个结构域间连接是否具备影响CheA活性的能力,即在不同情况下实现CheA活性的激活或抑制,我们将激酶CheA的P4-P5连接的碱基序列进行了随机突变,通过细菌体内筛选实验来搜寻能够导致不同CheA激酶活性(高活性或者低活性)的P4-P5连接突变序列,分离出了几种具有代表性的CheA突变体,并进行了相关的体内和体外CheA自磷酸化活性的测定。所获得的CheAP4-P5连接突变体最低激酶活性仅是野生型CheA蛋白激酶活性的30%,而最高的激酶活性则达到了野生型CheA蛋白激酶活性的670%。在体内状态下所有的CheA突变蛋白不能够支持趋化性。在不影响CheA与CheW和受体形成复合物的情况下,体外的CheA激活实验表明在受体介导下,所有的CheA突变蛋白的激酶被激活能力均有缺陷。这一结果表明天然存在的受体介导的信号传递通路在这些突变体中不约而同地受到了影响。此外,在缺少P5结构域的情况下,P4-P5连接突变对激酶活性造成了如P4-P5连接突变在全长CheA蛋白中的改变,即无论调节结构域存在与否,P4-P5连接的改变足以对激酶活性造成显著的改变。因此,结构域间的P4-P5连接是一个活跃的模块,能够对P4结构域的催化活性和CheA的激酶活性施以调节作用。这些结果表明化学受体可能通过对P4-P5连接构象的操纵来达到在信号复合物层面上对CheA进行调节的目的。

关键词：细菌趋化性组氨酸激酶结构域间连接激酶调节

硅藻CRISPR/Cas9基因编辑技术的建立及组氨酸激酶基因的起源和进化分析

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硅藻CRISPR/Cas9基因编辑技术的建立及组氨酸激酶基因的起源和进...

作者：张薇中国农业科学院

学位级别：硕士

硅藻是全球生态系统中重要的初级生产力,占世界海洋初级生产力的40%,从热带、亚热带地区到极地的各级生态系统中均有分布,是微藻中物种最丰富的一类。对环境胁迫的极强耐受能力是硅藻占据各级生态系统生态位的必要条件,其中信号转导系... 详细信息

硅藻是全球生态系统中重要的初级生产力,占世界海洋初级生产力的40%,从热带、亚热带地区到极地的各级生态系统中均有分布,是微藻中物种最丰富的一类。对环境胁迫的极强耐受能力是硅藻占据各级生态系统生态位的必要条件,其中信号转导系统发挥了重要的作用。双组分信号转导系统是硅藻信号转导系统的重要构成组件,组氨酸激酶(Histidine Kinase,HK)基因家族是双组分信号转导系统的重要部分。组氨酸激酶基因家族在原核生物中普遍存在,同时具有较为深厚的研究背景,为在藻类中开展探索性研究奠定基础。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)由于其生长速度快、基因组小、富含丰富的遗传资源、成功的基因编辑技术和遗传转化体系等优势成为硅藻研究中的模式物种,在硅藻细胞生物学、生态生理学研究中作为典型物种发挥了重要作用。本文以三角褐指藻为研究对象,对硅藻组氨酸激酶基因的起源、进化进行探索,采用比较基因组学方法对组氨酸激酶基因从分布、结构、起源、进化等角度进行了系统的分析;建立CRISPR/Cas9基因编辑技术和三角褐指藻遗传转化体系,对组氨酸激酶基因进行基因敲除,对三角褐指藻组氨酸激酶基因功能进行验证。本研究采用实验室自主搭建的GNM1158的数据库和比较基因组学的方法,首次对硅藻中的组氨酸激酶基因进行全基因组鉴定和生物信息学分析,探究了硅藻组氨酸激酶的分布和结构特征。通过构建系统发育树确定了硅藻中组氨酸激酶的起源与进化。本研究发现三角褐指藻中的组氨酸激酶基因DHK2和DHKL分别通过水平基因转移事件从细菌(Pseudomonas oleovorans)获得和垂直基因转移事件从祖先中获得。根据组氨酸激酶结构信息,发现组氨酸激酶基因家族在转移到藻类后具有一定保守性,也发生了分化,均能正常地进行表达。该研究建立了组氨酸激酶中的基因-结构-功能的框架,为其功能的研究奠定了基础。本研究在实验室内建立CRISPR/Cas9基因编辑技术,利用Gibson、Golden Gate两种组装方法,构建两种(8个)三角褐指藻编辑质粒,成功建立了硅藻基因枪、细菌接合两种遗传转化体系。通过细菌接合转化导入组氨酸激酶编辑质粒的方法,目前暂未筛选到突变株。通过构建组氨酸激酶基因编辑质粒,利用基因枪导入三角褐指藻藻体,编辑质粒在藻体内发挥作用,可以实现组氨酸激酶基因敲除,当前已获得杂合突变株10株。本研究成功在实验室建立三角褐指藻CRISPR/Cas9基因编辑技术,为进一步研究真核生物组氨酸激酶的功能提供数据参考。

关键词：硅藻 CRISPR/Cas9基因编辑组氨酸激酶水平基因转移信号转导

盾壳霉双组份组氨酸激酶基因CmHK03的功能研究

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盾壳霉双组份组氨酸激酶基因CmHK03的功能研究

作者：梁纳华中农业大学

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核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]是一种世界性分布的植物病原真菌,能引起多种作物菌核病,造成严重的经济损失。盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌的一种重寄生真菌,可用于防治作物菌核病。双组份组氨酸激酶(Two-com... 详细信息

核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]是一种世界性分布的植物病原真菌,能引起多种作物菌核病,造成严重的经济损失。盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌的一种重寄生真菌,可用于防治作物菌核病。双组份组氨酸激酶(Two-component histidine kinases,HKs)参与调控真菌体内多种生命活动,但双组份组氨酸激酶对盾壳霉的生长发育、重寄生、杀菌剂抗性有何影响,目前尚不清楚。本研究采用PEG介导的原生质体转化技术对盾壳霉双组份组氨酸激酶Cm HK03基因进行了敲除、互补和超表达,对Cm HK03在盾壳霉菌丝生长发育、重寄生、抗药性、响应高渗胁迫中的作用进行了分析,取得的主要研究结果如下:1. 杀菌剂敏感性测定表明:Cm HK03的敲除导致盾壳霉对二甲酰亚胺类和苯吡咯类杀菌剂的抗药性显著增强,而对三唑类、嘧啶类、咪唑类、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的敏感性没有变化。2. 渗透压敏感性测定表明:Cm HK03敲除突变体对高渗胁迫(1 M山梨醇、1 M葡萄糖)和高盐胁迫(0.6 M Na Cl、0.6 M KCl)表现敏感。其他非生物胁迫敏感性测定表明:Cm HK03敲除突变体对Ca Cl(0.2 M)、HO(8 m M)、CFW(150μg/m L)和CR(50μg/m L)的敏感性没有显著变化。菌丝NBT染色结果表明:Cm HK03基因的敲除和超表达对盾壳霉菌丝内ROS含量没有显著影响。3. 菌丝内甘油含量测定表明:用1 M山梨醇处理5 h时,盾壳霉野生型和Cm HK03敲除突变体菌丝甘油含量显著升高,但Cm HK03敲除突变体菌丝中甘油含量显著低于野生型。而用5μg a.i./m L咯菌腈处理5 h时,野生型和Cm HK03敲除突变体菌丝中甘油含量均未发生显著变化。这说明Cm HK03可能参与调控甘油的合成来响应渗透压胁迫。4. RT-q PCR结果显示,咯菌腈(5μg/a.i.m L)处理12 h后,野生型中Cm HK03,Sho1和Hog1分别上调表达6.9倍,1.83倍和2.06倍;而在Cm HK03敲除突变体中,Sho1和Hog1却分别下调表达0.34倍和0.72倍。这说明Cm HK03参与杀菌剂抗性调控可能Hog1信号通路有关。5. 草酸敏感性测定表明:Cm HK03敲除突变体和超表达突变体对草酸(16m M和24 m M)的敏感性没有变化。6. Cm HK03的敲除和超表达对盾壳霉的菌丝生长发育、产孢、以及对核盘菌菌丝和菌核的重寄生能力均没有显著影响。以上研究结果表明,Cm HK03的敲除增强了盾壳霉对二甲酰亚胺类和苯吡咯类杀菌剂的抗药性,Cm HK03可能参与调控甘油的合成来响应高渗胁迫,而且Cm HK03的敲除对盾壳霉的菌丝生长发育、产孢和重寄生均没有显著影响。因此,Cm HK03敲除突变体可以与二甲酰亚胺类和苯吡咯类杀菌剂混用,来控制田间核盘菌抗药性菌株。

关键词：盾壳霉双组份信号系统组氨酸激酶抗药性渗透压

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拟南芥跨膜组氨酸激酶ATHK1研究进展

安徽农业科学 2014年第7期42卷 1923-1924,2036页

作者：陈一扬州大学生物科学与技术学院江苏扬州225009

由干旱、低温和高盐等引起的渗透胁迫是影响包括细菌、酵母和高等植物在内的多种生物生长和发育的主要环境因子。生物体自身已进化出多种机制以应答这些胁迫。文中介绍了细菌和酵母中响应渗透胁迫的双组分信号系统,对拟南芥中响应渗透... 详细信息

由干旱、低温和高盐等引起的渗透胁迫是影响包括细菌、酵母和高等植物在内的多种生物生长和发育的主要环境因子。生物体自身已进化出多种机制以应答这些胁迫。文中介绍了细菌和酵母中响应渗透胁迫的双组分信号系统,对拟南芥中响应渗透胁迫的重要分子ATHK1的研究进展作了简要综述,并简单讨论了ATHK1在拟南芥逆境胁迫响应过程中的主要功能,为组氨酸激酶ATHK1的进一步合理应用提供依据。

关键词：渗透胁迫双组分系统组氨酸激酶 ATHK1

甜菜耐盐相关转录因子WRKY及组氨酸激酶研究进展

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中国甜菜糖业 2019年第2期 45-48页

作者：王琮玉崔杰李俊良李昕晏罗成飞哈尔滨工业大学化工与化学学院黑龙江哈尔滨150086

转录因子在甜菜耐盐胁迫的调节中发挥重要作用,且有研究表明WRKY转录因子和组氨酸激酶在植物的耐盐的代谢通路中分别起着调节和感受器的作用。因此研究这两种调节蛋白在植物的抗逆中发挥的作用不仅具有理论意义,同时对指导生产具有应用... 详细信息

转录因子在甜菜耐盐胁迫的调节中发挥重要作用,且有研究表明WRKY转录因子和组氨酸激酶在植物的耐盐的代谢通路中分别起着调节和感受器的作用。因此研究这两种调节蛋白在植物的抗逆中发挥的作用不仅具有理论意义,同时对指导生产具有应用价值。本文将就WRKY转录因子、组氨酸激酶这两类调节蛋白在植物耐盐中的作用进行综述。

关键词：甜菜盐胁迫 WRKY转录因子组氨酸激酶

贝莱斯芽孢杆菌HN-1中组氨酸激酶ComP调控脂肽类物质活性研究

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贝莱斯芽孢杆菌HN-1中组氨酸激酶ComP调控脂肽类物质活性研究

苜蓿根瘤菌组氨酸激酶DctB的结构生物学分析

中国植物病理学会2023年学术年会

作者：林正祁天龙刘文波缪卫国靳鹏飞海南大学植物保护学院热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室

双组分系统是芽孢杆菌中磷酸信号传导途径的重要组成部分,组氨酸激酶ComP是芽孢杆菌双组分系统组成之一。膜蛋白组氨酸激酶ComP与信息素分子ComX结合,诱导ComP自磷酸化,进而将磷酸基团转移至调控蛋白ComA,使ComA被磷酸化,磷酸化的ComA... 详细信息

双组分系统是芽孢杆菌中磷酸信号传导途径的重要组成部分,组氨酸激酶ComP是芽孢杆菌双组分系统组成之一。膜蛋白组氨酸激酶ComP与信息素分子ComX结合,诱导ComP自磷酸化,进而将磷酸基团转移至调控蛋白ComA,使ComA被磷酸化,磷酸化的ComA结合在surfactin合酶基因srfA启动子的特定区域,激活RNA聚合酶引发srfA的转录。然而,本实验室前期通过构建贝莱斯芽孢杆菌HN-1 (Bacillus velezensis HN-1)突变体库发现了一株comP基因功能被破坏的菌株059,根据反向PCR测序结果发现059菌株的comP基因被转座子插入突变,导致其丧失了抑制真菌的活性。目前组氨酸激酶ComP调控伊枯草菌素的机制尚不清楚。因此推测组氨酸激酶ComP参与伊枯草菌素的合成与调控,从而影响了伊枯草菌素的合成及其抑制真菌活性。本实验室通过定点敲除HN-1的comP基因,得到一株组氨酸激酶缺陷菌株HN-1Δcomp,通过菌丝生长速率法测定抑菌活性、生长曲线、排油圈、生物膜等实验发现:HN-1Δcomp菌株的正丁醇萃取物对果生刺盘孢菌(Colletotrichum fructicola)的EC为1 284.73μg/mL,野生型HN-1菌株对***的EC为38.10μg/mL。生长曲线结果表明HN-1Δcomp菌株率先达到稳定期。通过排油圈、溶血圈实验表明HN-1Δcomp菌株产生的排油圈和溶血圈明显低于HN-1,其产生的表面活性素含量降低。通过qRT-PCR实验,发现HN-1Δcomp菌株的sfp、fenA、srfaA、bmyC等基因上调表达。综上所述:最终确定comP基因在贝莱斯芽孢杆菌HN-1中调控伊枯草菌素的生物合成,与伊枯草菌素的抑菌活性有极其重要的关系。

关键词：贝莱斯芽孢杆菌组氨酸激酶脂肽类物质调控机制抑菌活性

来源： cnki会议评论

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苜蓿根瘤菌组氨酸激酶DctB的结构生物学分析

中国晶体学会第四届全国会员代表大会暨学术会议

作者：周艳峰苏晓东北京大学生命科学学院结构生物学实验室

＜正＞DctB-DctD二元调控系统是根瘤菌生物固氮所必须的,控制着细菌对碳源的摄取与代谢。DctB作为定位在膜上的感应蛋白,有两个穿膜区。在两个穿膜区之间是伸在膜外用来接收信号的感应区。在第二个穿膜区入膜以后,紧接着是膜内的一个卷... 详细信息

＜正＞DctB-DctD二元调控系统是根瘤菌生物固氮所必须的,控制着细菌对碳源的摄取与代谢。DctB作为定位在膜上的感应蛋白,有两个穿膜区。在两个穿膜区之间是伸在膜外用来接收信号的感应区。在第二个穿膜区入膜以后,紧接着是膜内的一个卷曲.卷曲铰链区（coiled-coil region;HAMP linker）。在蛋白C-末端是含有组氨酸的磷酸转移结构域（HPt）及ATP结合与催化结构域。目前关于HPt结构域及催化结构域已经有较多的结构和突变体数据,而对于膜外感应区及膜内的HAMP铰链区的了解还很不充分。根据已有的几个受体的结构及膜内HAMP铰链区的结构,人们分别提出了信号接收与

关键词：跨膜信号传递组氨酸激酶二元调控系统

来源： cnki会议评论

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烟曲霉组氨酸激酶基因片段的隆及表达分析

中华皮肤科杂志 2001年第5期34卷 349-351页

作者：杜晨李若瑜马圣清王端礼北京大学第一医院皮肤科 100034

目的分离克隆烟曲霉组氨酸激酶基因,进一步探讨其在侵袭性感染中的作用。方法基于组氨酸激酶保守区设计简并引物,通过逆转录-聚合酶链反应获得特异性扩增产物,对目的产物克隆、测序。通过Blast分析进行相似性比较。以获得的目的基因片... 详细信息

目的分离克隆烟曲霉组氨酸激酶基因,进一步探讨其在侵袭性感染中的作用。方法基于组氨酸激酶保守区设计简并引物,通过逆转录-聚合酶链反应获得特异性扩增产物,对目的产物克隆、测序。通过Blast分析进行相似性比较。以获得的目的基因片段作为探针,通过Northern杂交比较该基因在体外与体内感染时表达的差异。结果逆转录-聚合酶链反应获得2个片段,长度分别为171bp、305bp,其中305bp片段与构巢曲霉tesA基因的同源性>80%。该基因在小鼠侵袭性肺曲霉病中表达水平明显增加。结论烟曲霉组氨酸激酶基因的表达可能有助于其在体内存活,该基因可能是烟曲霉潜在的毒力基因。

关键词：烟曲霉组氨酸激酶基因

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酵母蛋白质组氨酸激酶在昆虫细胞中的表达

中国免疫学杂志 1997年第5期13卷 259-261页

作者：王丽颖杨贵贞白求恩医科大学基础医学院

以ＤＮＡ聚合酶链式反应从酵母基因组ＤＮＡ中钓取编码酵母组氨酸激酶（ＹＨＫ）活性区的ＤＮＡ，将此ＤＮＡ克隆入Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ转递质粒（ｐＶＬ１３９３）。然后用ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＤＮＡ与重组质粒ｐＶＬ１３９３共转... 详细信息

以ＤＮＡ聚合酶链式反应从酵母基因组ＤＮＡ中钓取编码酵母组氨酸激酶（ＹＨＫ）活性区的ＤＮＡ，将此ＤＮＡ克隆入Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ转递质粒（ｐＶＬ１３９３）。然后用ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＤＮＡ与重组质粒ｐＶＬ１３９３共转染昆虫细胞（ＳＦ９），在感染了重组Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ的ＳＦ９细胞中表达了ＹＨＫ活性蛋白，该蛋白在体外组氨酸激酶试验中表现出自身组氨酸残基磷酸化的活性。

关键词：酵母蛋白激酶组氨酸激酶昆虫杆状病毒表达