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生物工程学报 2024年第9期40卷 3114-3126页

作者：乔倩倩宁舒展王瑞瑞郑宇路福平陈久洲刘娇郑平天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所、低碳合成工程生物学重点实验室天津300308 国家合成生物技术创新中心天津300308 深圳科兴天合生物科技有限公司广东深圳518000

谷氨酸棒杆菌是支链氨基酸工业生产的主力菌,乙酰羟酸合酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是支链氨基酸合成的关键酶,强化AHAS的表达是提高菌种水平的关键手段。然而目前还未实现高效调控AHAS,本研究首先基于前期开发的靶基因表达调... 详细信息

谷氨酸棒杆菌是支链氨基酸工业生产的主力菌,乙酰羟酸合酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是支链氨基酸合成的关键酶,强化AHAS的表达是提高菌种水平的关键手段。然而目前还未实现高效调控AHAS,本研究首先基于前期开发的靶基因表达调控报告系统,从6个组成型强启动子中筛选乙酰羟酸合酶编码基因ilvBN的高效表达启动子,成功获得P_(gpmA*)启动子,表达强度是PilvBN天然启动子的23.3倍。其次,在P_(gpmA*)启动子基础上,构建并通过平板荧光成像初步筛选了3种人工合成核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)文库,发现“R(9)N(6)”为优势的突变文库,通过进一步的孔板复筛,成功获得36个不同的强度增强的RBS突变体,最高强度可达天然启动子PilvBN的62.3倍。最后,选择P_(gpmA*)启动子分别组合3种RBS(野生型、RBS18和RBS36)调控ilvBNS155F的表达生产L-缬氨酸,L-缬氨酸产量随着表达调控元件强度的增强而提高,分别为1.17、1.38、2.29 g/L。在RBS18调控的基础上进一步组合ilvC过表达,L-缬氨酸产量可达7.57g/L。本研究获得的AHAS表达调控元件库,可为改造AHAS生产L-缬氨酸等支链氨基酸提供丰富元件,并为其他关键酶的表达调控提供思路和方法借鉴。

关键词：谷氨酸棒杆菌支链氨基酸乙酰羟酸合酶组成型强启动子人工合成核糖体结合位点文库

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Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中启动子P_(aziU1)的克隆及表达

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华中农业大学学报 2014年第5期33卷 26-31页

作者：周俊何璟华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

为鉴定和分析aziU1基因的启动子PaziU1,将该基因上游183bp的DNA片段和组成型强启动子PermE*(作为阳性对照)分别克隆到启动子探针载体pIJ8660中,以增强型的绿色荧光蛋白基因(egfp)作为报告基因,通过检测菌丝体中绿色荧光的强弱,对PaziU1... 详细信息

为鉴定和分析aziU1基因的启动子PaziU1,将该基因上游183bp的DNA片段和组成型强启动子PermE*(作为阳性对照)分别克隆到启动子探针载体pIJ8660中,以增强型的绿色荧光蛋白基因(egfp)作为报告基因,通过检测菌丝体中绿色荧光的强弱,对PaziU1的启动子活性进行了定性和定量分析。PaziU1在3种不同的链霉菌Streptomyces sahachiroi、Streptomyces lividans ZX1和Streptomyces albus中均表现出启动子活性。PaziU1的启动子活性在初始培养的36h略低于PermE*,在培养48h后,PaziU1的表达活性高于PermE*。结果表明,Pazi U1与PermE*一样,是一个可以在链霉菌中组成型表达的强启动子。

关键词： Streptomyces sahachiroi ATCC 33158 PermE* 启动子探针载体 PaziU1 增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 组成型强启动子

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印度芥菜CE家族成员BjCET1的功能解析与应用研究

印度芥菜CE家族成员BjCET1的功能解析与应用研究

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作者：曾柳河北农业大学

学位级别：硕士

近些年来,我国的城市化、工业化、农业化的规模不断扩大,工业“三废”的排放、化肥的过度使用等不断加剧土壤的重金属污染,对动植物都产生了严重的毒害。如何有效地治理和修复土壤重金属污染已成为当下和长期面临急需解决的重大课题。... 详细信息

近些年来,我国的城市化、工业化、农业化的规模不断扩大,工业“三废”的排放、化肥的过度使用等不断加剧土壤的重金属污染,对动植物都产生了严重的毒害。如何有效地治理和修复土壤重金属污染已成为当下和长期面临急需解决的重大课题。目前植物修复技术在操作上、经济和技术上都具有一定的优势,其中印度芥菜(Brassica juncea L.)作为植物修复技术的主要模式植物之一,对多种重金属离子如Cd、Zn、Pb、Se、Au等具有富集或超富集能力。探索和解析其富集/超富集重金属离子的分子机制,对于开发可用于重金属污染土壤植物修复的人工超富集植物,以及改善人类膳食中必需微量元素的含量均具有重要科学意义和应用价值。CE(cation-efflux)家族蛋白成员被认为与植物体微量金属元素Cd、Zn、Ni、Co或Fe的转运和富集有关,本实验室前期从镉胁迫下的印度芥菜cDNA pool中克隆了该家族的BjCET1基因,利用Genome Walking技术克隆了其启动子序列BjCET1P。本研究利用农杆菌侵染法获得了稳定遗传的的T3代BjCET1P与BjCET1拟南芥转化植株,通过重金属胁迫分析、酵母功能互补、GUS染色、非损伤微测技术(Non-invasive Micro-test Technique,NMT)等手段对BjCET1P启动子和BjCET1基因的功能机制及污染土壤修复潜力进行了研究。研究结果如下:***1P-GUS转基因拟南芥GUS染色验证了BjCET1P是组成型强启动子,表达定位在根尖和维管组织中。2.酵母功能互补实验表明,在酵母中表达BjCET1可显著提高酵母菌对Zn、Cd、Co、Ni,特别是Zn胁迫的耐受性;ICP-MS检测显示,表达BjCET1显著降低了酵母细胞的Zn含量,说明BjCET1表达提高了酵母细胞外排泵出Zn的能力。3.采用共聚焦激光扫描显微技术(Confocal),我们观察了 BjCET1-GFP蛋白融合表达的烟草植株的根部,通过质壁分离实验,验证了 BjCET1蛋白在根部主要表达在细胞质膜上。4.采用NMT技术分析了 Cd胁迫条件下BjCET1P2驱动的BjCET1基因表达对拟南芥根部Cd2+离子流速影响,结果表明BjCET1表达提高了拟南芥根部Cd2+净内流速率,部分揭示过表达BjCET1提高植物Cd富集量的生理机制。5.转基因拟南芥抗重金属分析表明,BjCET1P2启动子驱动的BjCET1蛋白的表达,显著提高了植株的抗Cd、Cu、Hg、Mn和Zn胁迫的能力,植株鲜重及生长状况明显好于对照。重金属富集量初步分析,转基因植株地上部Cd富集量显著高于对照,显示出该基因及启动子用于植物修复土壤的潜力。

关键词：印度芥菜 CDF家族组成型强启动子拟南芥植物修复重金属富集机制

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