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线粒体ros调控肝再生作用及机制研究

线粒体ROS调控肝再生作用及机制研究

作者：方从文中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

背景肝脏作为机体中重要的消化腺,不仅能够排除体内毒素,而且参与众多营养及非营养物质的生物代谢过程。肝脏还具有强大的再生能力,在受到急慢性感染或损伤后,均会自主进行再生,以维持机体的健康。肝再生（Liver regeneration,LR）对肝... 详细信息

背景肝脏作为机体中重要的消化腺,不仅能够排除体内毒素,而且参与众多营养及非营养物质的生物代谢过程。肝脏还具有强大的再生能力,在受到急慢性感染或损伤后,均会自主进行再生,以维持机体的健康。肝再生（Liver regeneration,LR）对肝脏损伤后质量和功能的恢复至关重要,但LR过程复杂,阐明其中的分子机制,寻找潜在的干预靶点,对于临床肝损伤疾病的治疗,以及日益严重的肝损伤相关公共卫生问题的解决均具有重要理论和实践意义。细胞内的活性氧（Reactive oxygen species,ros）主要衍生于线粒体的氧化呼吸过程,它是细胞中普遍存在的活泼含氧物质,能够发挥信号传导的作用,调控细胞周期。LR过程的发展依赖于细胞增殖的观点已得到普遍认同,而线粒体作为细胞中ros的最主要来源,它可能是调控LR过程的潜在干预靶点,但目前两者间的调控作用和其中的分子机制如何尚不清楚。为了明确上述问题,本研究采用70%部分肝切除术（Partial hepatectomy,PH）诱导的小鼠LR模型,观察线粒体ros对LR的调控作用,试图阐明发挥调控作用的ros种类及其中可能的分子机制,为将来调控LR提供实验室依据。目的通过小鼠PH后诱导的LR模型,研究线粒体ros对LR的调控作用,并阐明线粒体ros调控LR的具体分子机制。方法1.采用经典70%PH手术建立小鼠PH后LR模型。将C57小鼠随机分成假手术组（Sham组）、PH组和干预组,Sham组只打开腹腔不切除肝脏,PH组进行70%PH手术,干预组分别注射药物MitoQ、Mito TEMPO、Mn（Ⅲ）TMPyp、Catalase和Tic10。2.对肝组织切片分别进行HE和免疫组化染色,观察术后小鼠LR过程中肝组织的病理学变化和其中细胞增殖的情况。3.对肝组织切片分别进行DHE和Mito SOX染色,观察细胞整体ros和线粒体ros的水平。4.对PH中切除的肝组织与再生后收取的肝组织分别称重,测算肝再生率。5.采用试剂盒分别检测肝组织和线粒体中的丙二醛（Malondialdehyde,MDA）水平。6.采用Western Blot方法检测肝组织中Cyclin D1、PCNA、Ki67的蛋白水平。7.采用试剂盒检测肝组织中O和HO的水平。8.采用试剂盒提取肝组织中的总mRNA,之后对其进行反转录,Q-PCR方法检测p27基因转录表达水平。9.采用Western Blot方法检测肝组织中Akt、Erk、FoxO3a蛋白水平及相应磷酸化水平,以及p27分子的蛋白水平。结果***过程中细胞增殖水平和线粒体ros水平都具有“先升高,后恢复”的变化趋势,二者具有一定的相关性。肝组织切片HE染色和免疫组化染色的结果显示,小鼠LR过程中细胞的体积、内部脂滴数目的积累和细胞增殖的水平均会出现先增加后恢复的变化。Western Blot和再生率的结果提示细胞增殖的水平改变也与之对应。同时,肝组织切片的DHE和Mito SOX染色结果显示,细胞整体ros与线粒体ros变化水平一致,与细胞增殖的改变趋势相一致,MDA水平的检测结果也证实了ros的变化规律。2.调控线粒体ros能够调控LR。对线粒体ros水平的检测结果表明,小鼠PH后能够使线粒体ros明显升高,而给予线粒体靶向ros清除剂MitoQ或Mito TEMPO干预能够明显降低其水平。同时,LR过程中细胞增殖水平的检测结果表明,PH后细胞中的增殖相关蛋白（Cyclin D1、PCNA和Ki67）水平明显增高,但在MitoQ或Mito TEMPO干预后其水平明显下降,细胞增殖和肝再生率均受到抑制。提示调控线粒体ros能够调控LR。3.线粒体ros调控LR主要与HO有关。小鼠肝组织内O和HO的水平检测结果表明,LR过程中HO水平会发生先升后降的改变,而O变化不明显。采用不同的ros清除剂Mn（Ⅲ）TMPyp(O清除剂)和Catalase（HO清除剂）干预,细胞增殖和再生率的检测结果表明,清除HO后,能够降低PH后增殖相关蛋白（Cyclin D1、PCNA和Ki67）抗原阳性的细胞占比,抑制肝再生率,而清除O则没有这些作用。另外,HO的水平检测结果表明,线粒体靶向ros清除剂能够降低PH后的HO水平。表明线粒体ros调控LR主要与HO有关。***&Erk/FoxO3a/p27信号通路参与调控LR。对小鼠PH后的肝组织进行Western Blot检测,结果表明FoxO3a分子对应的磷酸化水平（Ser253、Ser294）在PH后明显升高,同时该分子相关信号通路上游Akt、Erk分子的磷酸化水平也出现相应变化。胞核与胞浆蛋白的水平检测结果表明,PH后FoxO3a分子在胞核内的水平明显降低,而胞浆中的水平则相应升高。FoxO3a分子下游靶基因p27的Q-PCR和West

关键词：部分肝切除术(PH) 肝再生(LR) 线粒体ros H2O2 FoxO3a

Nano-Co通过线粒体ros诱导肝细胞L02中NLRP3炎症小体的激活

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Nano-Co通过线粒体ROS诱导肝细胞L02中NLRP3炎症小体的激活

作者：冯思思福建医科大学

学位级别：硕士

目的将在建立Nano-Co诱导的肝细胞L02损伤模型的基础上观察细胞的毒性损伤效应,以此探究Nano-co刺激对肝细胞NLRP3分子的激活作用,初步探讨NanoCo通过线粒体ros诱导NLRP3分子激活的相关机制。这将进一步丰富和完善人们对纳米材料具有... 详细信息

目的将在建立Nano-Co诱导的肝细胞L02损伤模型的基础上观察细胞的毒性损伤效应,以此探究Nano-co刺激对肝细胞NLRP3分子的激活作用,初步探讨NanoCo通过线粒体ros诱导NLRP3分子激活的相关机制。这将进一步丰富和完善人们对纳米材料具有潜在健康危害的认识,对于研究Nano-Co的毒理学作用机制及针对NLRP3的潜在治疗前景提供理论依据。方法 1.应用透射电镜观察肝细胞L02对Nano-Co的摄取。2.将肝细胞L02暴露在不同剂量的Nano-Co中来建立肝细胞的损伤模型。通过CCK-8、LDH试剂盒检测的方法观察Nano-Co刺激产生细胞毒性效应。3.采用Western blot法检测Nano-Co刺激后细胞NLRP3激活、ASC和Caspase-1p20的表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测Nano-Co刺激后细胞IL-1β和IL-18的释放水平。4.调控NLRP3的表达对Caspase-1 p20,IL-1β和IL-18表达的影响:用RNA干扰技术调控NLRP3的表达,采用Western blot法检测细胞Caspase-1 p20表达,ELISA试剂盒检测细胞IL-1β和IL-18表达水平。5.应用ros,线粒体ros检测试剂盒检测Nano-Co刺激后胞内ros和mtros的生成量。6.验证mtros在Nano-Co诱发肝细胞NLRP3分子激活过程中的调节作用:利用总ros清除剂NAC和mtros特异性清除剂Mito-TEMPO（TEMPO）分别预处理细胞,再用Nano-Co刺激细胞,采取空白对照方式,用Western blot法检测细胞Caspase-1 p20等分子表达。通过ELISA法检测细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达水平。7.调控NF-κB的表达对Caspase-1 p20,IL-1β和IL-18表达的影响:用NF-κB抑制剂预处理后再进行Nano-Co暴露细胞,采用Western blot法检测细胞Caspase-1 p20表达,ELISA试剂盒检测细胞IL-1β和IL-18表达水平。结果 1.透射电镜下观察到L02细胞摄取、内吞纳米钴颗粒并出现细胞超微结构变化。2.与对照组相比,不同剂量的Nano-Co刺激组的细胞存活率下降,LDH的释放量增多。且存在着时间与剂量的依赖性,表明Nano-Co对L02细胞具有细胞毒性效应。3.不同浓度Nano-Co暴露诱导L02细胞24 h后,Western blot结果显示:NLRP3的蛋白表达随着Nano-Co的浓度升高而增加,而pro-caspase-1（ProCasp1）、pro-IL-1β和ASC表达均无明显差异（P＞0.05）。Nano-Co暴露可促进L02细胞内Casp1（20-kDa）和成熟的IL-1β（17-kDa）的蛋白表达,且7.5μg/mL的Nano-Co刺激细胞后,可明显使NLRP3炎症小体的活化蛋白Casp1（20-kDa）和IL-1β（17-kDa）升高（P＜0.05）。ELISA检测结果显示在7.5μg/mL组和10μg/mL Nano-Co刺激组细胞中IL-18和IL-1β表达水平明显升高（P＜0.01）。在转染siRNA NLRP3成功抑制NLRP3表达后,结果显示:NanoCo暴露的L02细胞中LDH释放量减少,且有效地抑制Casp1（20-kDa）和IL-1β（17-kDa）分子表达（P＜0.01）。4.不同浓度Nano-Co处理L02细胞后,结果显示:ros和mtros水平随NanoCo的浓度增加呈上升趋势。分别用NAC（ros抑制剂）和TEMPO（mtros抑制剂）预处理细胞后,western blot结果显示:TEMPO组和NAC组均显著下调Casp1（20-kDa）和IL-1β（17-kDa）相关因子表达（P＜0.01）。5.用BAY11-7082（NF-κB抑制剂）预处理肝细胞后,再暴露于Nano-Co。Western blot结果显示:不同浓度刺激组NF-κB在肝细胞中的表达量呈浓度依赖性增加,在NAC抑制组中P65表达被显著抑制（P＜0.01）。而NF-κB抑制组明显地抑制Casp p20分子的表达（P＜0.05）,ELISA结果显示IL-1β、IL-18分子的表达量无明显变化。结论 ***-Co通过诱导细胞发生氧化应激,引起ros、mtros生成增加,继而促使L02肝细胞内NLRP3炎性体的激活。2.氧化应激损伤、NLRP3可能是Nano-Co致肝损伤的治疗靶点,为Nano-Co细胞毒性的预防和治疗提供依据。

关键词：纳米钴颗粒 NLRP3炎症小体氧化应激线粒体ros

调控线粒体ros和NLRP3对高糖诱导的H9C2心肌细胞死亡的影响

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调控线粒体ROS和NLRP3对高糖诱导的H9C2心肌细胞死亡的影响

作者：王佳慧蚌埠医学院

学位级别：硕士

目的探讨抑制线粒体氧化应激和NLRP3炎症小体对高糖诱导的H9C2心肌细胞焦亡和铁死亡的作用,分析线粒体ros和炎症小体之间可能的上下游关系。方法采用35 mM浓度的高糖干预H9C2心肌细胞24 h复制糖尿病损伤模型。H9C2心肌细胞进行随机分组:... 详细信息

目的探讨抑制线粒体氧化应激和NLRP3炎症小体对高糖诱导的H9C2心肌细胞焦亡和铁死亡的作用,分析线粒体ros和炎症小体之间可能的上下游关系。方法采用35 mM浓度的高糖干预H9C2心肌细胞24 h复制糖尿病损伤模型。H9C2心肌细胞进行随机分组:(1)药物干预分为5组:正常对照组(CON);高糖损伤组(HG);高糖+线粒体抗氧化剂Mitoquinone(Mito Q)组(HG+Mito Q);高糖+NLRP3炎症小体抑制剂MCC950组(HG+MCC950);高糖组+MCC950+线粒体电子传递抑制剂Rotenone(ROT)组(HG+MCC950+ROT)。(2)采用NLRP3-sh RNA慢病毒感染H9C2心肌细胞,构建NLRP3基因稳定敲减的细胞株(sh-NLRP3),H9C2心肌细胞随机分为7组:正常对照组(CON);高糖损伤组(HG);慢病毒空载组(NC);高糖+慢病毒空载组(HG+NC);NLRP3基因敲减组(sh-NLRP3);高糖+NLRP3基因敲减组(HG+sh-NLRP3);高糖+NLRP3基因敲减+线粒体电子传递抑制剂ROT组(HG+sh-NLRP3+ROT)。分组干预H9C2心肌细胞24 h后,CCK-8法测定细胞活性;分光光度法检测细胞ATP水平和细胞上清培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的水平;Cell Rox和Mito Sox荧光探针分别测定心肌细胞内和线粒体氧化应激水平变化;免疫荧光法检测胞质内NLRP3和caspase-1炎症小体水平;Western blot检测心肌细胞中炎症小体复合物组成部分NLRP3、ASC、Cleaved-caspase-1和焦亡相关因子GSDMD、Cleaved-GSDMD(GSDMD-NT)、IL-1β和IL-18以及铁死亡相关因子GPX4的蛋白表达。结果与CON组相比,HG组细胞活性、ATP水平明显下降(P线粒体内ros荧光强度增高,NLRP3和caspase-1免疫荧光强度以及炎症小体NLRP3、ASC、Cleaved-caspase-1和焦亡相关因子GSDMD、GSDMD-NT、IL-1β、IL-18的蛋白表达明显升高,铁死亡相关因子GPX4蛋白表达下降(P线粒体内ros荧光强度、NLRP3免疫荧光强度和蛋白表达,GSDMD-NT蛋白表达均明显降低,GPX4蛋白表达增高(Pros荧光强度、NLRP3炎症小体表达和NLRP3、GSDMD-NT的蛋白表达均明显升高,GPX4蛋白表达降低(P线粒体ros的产生减轻了高糖诱导的H9C2心肌细胞中NLRP3炎症小体的生成,减少焦亡和铁死亡的发生,MCC950抑制NLRP3炎症小体亦通过减少线粒体ros的产生减轻焦亡和铁死亡的发生;NLRP3参与调控铁死亡的发生。***敲减NLRP3基因减轻了高糖诱导的H9C2心肌细胞焦亡和铁死亡。***促进线粒体ros生成取消了MCC950或sh RNA抑制NLRP3、降低焦亡和铁死亡的作用;线粒体ros和NLRP3之间可能存在着相互影响。

关键词：高糖线粒体ros NLRP3炎症小体焦亡铁死亡

不同程度过氧化氢通过线粒体ros调控PC12细胞存活与死亡的实验研究

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不同程度过氧化氢通过线粒体ROS调控PC12细胞存活与死亡的实验研究

作者：孙月吉林大学

学位级别：硕士

传统观点认为,线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,m ros)的作用仅仅是引起细胞损伤而导致众多疾病的发生,因此m ros被认为是氧化代谢中的一种有害产物而缺少正常的生理功能。然而,越来越多的研究表明,m ros在维持正... 详细信息

传统观点认为,线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,m ros)的作用仅仅是引起细胞损伤而导致众多疾病的发生,因此m ros被认为是氧化代谢中的一种有害产物而缺少正常的生理功能。然而,越来越多的研究表明,m ros在维持正常细胞功能中也发挥关键作用,例如,在缺氧、饥饿、病原体感染以及生长因子刺激下通常诱导细胞产生m ros,转而激活下游m ros-依赖的信号转导途径,后者具有维持细胞稳态和促进细胞应对刺激适应性的功能。有研究报道氧化应激能扰乱内质网功能,活化内质网应激以及下游的自噬过程。根据氧化应激严重程度的不同,内质网应激及其后续活化的自噬可发挥促细胞存活或死亡的双重作用。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞是一个体外研究神经细胞的常用模型。当培养基中有动物血清存在时,PC12细胞呈圆形、胞体明亮、迅速增殖。在此条件下,PC12细胞表现出许多不成熟神经细胞特性,可以转变成肾上腺嗜铬细胞,也可以变成交感样神经细胞。在神经生长因子诱导下,PC12细胞能分化成交感神经样细胞,具有神经元的形态、生化和生理特征。PC12细胞的这些特性使得它成为研究神经系统疾病发病机制以及探索相关治疗手段的一种简单且便利的细胞模型。本实验以PC12细胞作为研究对象,采用不同浓度H2O2模拟不同程度氧化应激,探讨在不同程度氧化应激条件下,线粒体ros以及内质网应激-自噬途径相关联的信号转导在调控神经细胞存活与死亡过程中的作用。方法和结果:1、不同浓度H2O2刺激PC12细胞6h后,MTT实验检测细胞存活率。结果显示:与对照组相比,较低浓度H2O2刺激下PC12细胞的存活率无显著变化;高浓度H2O2刺激下PC12细胞的存活率显著降低。2、分别采用低浓度H2O2以及高浓度H2O2刺激PC12细胞6h,倒置光学显微镜下观察细胞形态的变化。结果显示:与对照组相比,低浓度H2O2刺激不引起光学显微镜下可见的细胞形态改变;高浓度H2O2刺激引起细胞形态发生明显变化。3、分别采用低浓度H2O2以及高浓度H2O2刺激PC12细胞6h,应用western blot检测细胞凋亡指示蛋白caspase-3的表达情况。结果显示:与对照组相比,低浓度H2O2刺激不改变caspase-3的活化即不引起细胞凋亡发生;高浓度H2O2刺激显著增加caspase-3的活化,即诱导细胞发生凋亡。4、分别采用低浓度H2O2以及高浓度H2O2刺激PC12细胞6h,应用流式细胞术检测线粒体膜电势的变化。结果显示:与对照组相比,低浓度H2O2刺激使PC12细胞的线粒体膜电势轻度降低;高浓度H2O2刺激使得PC12细胞的线粒体膜电势极显著降低。5、分别采用低浓度H2O2以及高浓度H2O2刺激PC12细胞6h,应用荧光染料Mito SoxTM红色试剂标记线粒体ros。结果显示,不同程度H2O2刺激对PC12细胞线粒体ros水平产生不同影响:与对照组相比,低浓度H2O2刺激使PC12细胞中线粒体ros水平降低;高浓度H2O2刺激使PC12细胞中线粒体ros水平显著增加。6、分别采用低浓度H2O2以及高浓度H2O2刺激PC12细胞6h,应用western blot检测线粒体介导的凋亡途径相关信号蛋白的表达情况。结果显示,不同程度H2O2刺激对PC12细胞的线粒体-介导的凋亡信号通路产生不同影响:与对照组相比,低浓度H2O2刺激上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,不影响线粒体凋亡蛋白caspase-9的表达;高浓度H2O2刺激显著降低Bcl-2的表达,同时显著上调caspase-9的表达。7、分别采用低浓度H2O2以及高浓度H2O2刺激PC12细胞6h,应用western blot检测内质网应激-自噬通路中相关蛋白的表达情况。结果显示:与对照组相比,低浓度H2O2刺激上调内质网应激标志蛋白GRP78的表达,不影响内质网应激途径的凋亡蛋白CHOP的表达以及自噬相关蛋白LC3、P62的表达;高浓度H2O2刺激显著上调GRP78、CHOP、LC3、P62蛋白的表达。结论:细胞应对不同程度氧化应激刺激时调动不同的应答反应。轻度氧化应激条件下,通过线粒体途径(降低线粒体ros,上调抗凋亡Bcl-2信号)维持细胞的稳定状态;重度氧化应激条件下,通过线粒体ros以及内质网应激-自噬途径同时触发死亡信号,诱导细胞发生线粒体介导的凋亡以及内质网应激介导的凋亡。

关键词：过氧化氢 PC12细胞线粒体ros 凋亡内质网应激-自噬途径

丙烯酰胺诱导线粒体ros释放致大鼠肝星状细胞死亡机制研究

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丙烯酰胺诱导线粒体ROS释放致大鼠肝星状细胞死亡机制研究

作者：李玉彩吉林大学

学位级别：硕士

丙烯酰胺(Acrylamide,AA)作为热加工食品美拉德反应的重要产物,具有生殖毒性、神经毒性、肝毒性和潜在的致癌性。肝脏是AA代谢的主要场所也是AA攻击的主要靶器官,热加工食品中AA的肝毒性引起广泛关注。AA诱导的肝毒性与氧化应激关系密切... 详细信息

丙烯酰胺(Acrylamide,AA)作为热加工食品美拉德反应的重要产物,具有生殖毒性、神经毒性、肝毒性和潜在的致癌性。肝脏是AA代谢的主要场所也是AA攻击的主要靶器官,热加工食品中AA的肝毒性引起广泛关注。AA诱导的肝毒性与氧化应激关系密切,线粒体ros(mt ros)引发的线粒体氧化应激是机体氧化应激的主要来源。氧化应激直接参与铁死亡和细胞焦亡等细胞死亡方式。铁死亡依赖铁离子,以脂质过氧化和抗氧化系统失调为特征。氧化应激通过激活炎性小体,诱导炎症因子释放,打开细胞焦亡经典通路。本研究旨在通过建立AA染毒大鼠肝星状细胞(HSC-T6细胞)模型,探究AA对HSC-T6细胞mt ros释放以及诱导铁死亡、细胞焦亡发生的机制,进一步阐明mt ros对铁死亡和细胞焦亡的作用,为最终揭示AA肝毒性机制奠定研究基础。本论文主要研究内容及结果如下:(1)AA损伤HSC-T6细胞线粒体功能并释放mt ros。建立AA(0,0.5,1,2 m M)染毒HSC-T6细胞模型,通过检测LDH、ALT和AST的水平变化,HSC-T6细胞被2 m M AA处理后LDH、ALT和AST水平值分别为对照组的1.4、2.9、3.5倍,确定AA对细胞造成损伤;通过Western Blot考察HSC-T6细胞膜孔蛋白VDAC1表达水平,测定线粒体膜电位(MMP),ATP水平以及透射电镜观察线粒体结构,得出AA诱导VDAC1蛋白表达升高,MMP和ATP水平下降,线粒体结构受损,确定AA造成线粒体结构功能损伤;通过检测mt ros释放水平,确定AA增加mt ros释放量。(2)AA诱导的mt ros释放致XCT-GSH-GPX4抗氧化信号通路失衡,引发HSC-T6细胞铁死亡。通过Western Blot对HSC-T6细胞铁死亡关键蛋白表达水平考察,测定HSC-T6细胞GSH、MDA和Fe,得出AA影响关键蛋白表达,提高MDA和Fe水平含量,下调GSH水平,确定AA影响HSC-T6细胞XCT-GSH-GPX4抗氧化信号通路;采用5μM铁死亡抑制剂Fer-1,通过Western Blot考察HSC-T6细胞铁死亡关键蛋白表达水平,测定GSH、MDA和Fe,确定AA通过造成XCT-GSH-GPX4抗氧化信号通路失衡诱导HSC-T6细胞铁死亡;通过加入50μM mt ros清除剂Mito-TEMPO检测铁死亡关键蛋白表达,得出Mito-TEMPO恢复XCT-GSH-GPX4抗氧化系统,确定AA诱导HSC-T6细胞mt ros释放促进铁死亡的发生。(3)AA诱导mt ros释放激活NLRP3-caspase1-GSDMD通路致HSC-T6细胞焦亡。通过对SOD酶活性和ros释放水平检测,得出AA诱导ros释放量增加,SOD酶活性受到抑制,确定AA诱导氧化应激;通过Western Blot考察NLRP3-caspase1-GSDMD通路相关蛋白表达情况、通过试剂盒检测下游炎症因子水平,发现AA上调NLRP3、GSDMD、caspase1蛋白表达和IL-18、IL-1β炎症因子释放水平,确定AA激活NLRP3-caspase1-GSDMD信号通路致HSC-T6细胞焦亡;通过加入mt ros清除剂Mito-TEMPO检测细胞焦亡关键蛋白表达,得出Mito-TEMPO抑制NLRP3-caspase1-GSDMD信号通路,确定AA诱导HSC-T6细胞mt ros释放促进细胞焦亡的发生。综上所述,AA通过诱导线粒体功能障碍从而释放mt ros。mt ros能够诱导XCT-GSH-GPX4抗氧化信号通路失衡致HSC-T6细胞铁死亡。又通过激活NLRP3-caspase1-GSDMD信号通路诱导HSC-T6细胞焦亡。

关键词：丙烯酰胺线粒体ros 铁死亡细胞焦亡 HSC-T6细胞

高血糖诱导肝星状细胞5-羟色胺降解在2型糖尿病致肝脏炎症和纤维化时起关键作用

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北京大学学报(医学版) 2022年

作者：梁秀睿闪雪纯关晶张锐杨静张怡金佳琦张誉馨徐凡傅继华中国药科大学基础医学与临床药学学院生理系中国药科大学基础医学与临床药学学院

目的：探讨5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)引起肝脏炎症及纤维化时的作用。方法：雄性C57BL/6J小鼠，通过高脂饲料喂养结合腹腔注射链脲佐菌素，建立T2DM模型；然后，T2DM小鼠继续用... 详细信息

目的：探讨5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)引起肝脏炎症及纤维化时的作用。方法：雄性C57BL/6J小鼠，通过高脂饲料喂养结合腹腔注射链脲佐菌素，建立T2DM模型；然后，T2DM小鼠继续用高脂饲料喂养9周或同时用5-HT受体(5-HT 2A receptor，5-HTR)拮抗剂盐酸沙格雷酯(sarpogrelate hydrochloride，SH)及5-HT合成抑制剂卡比多巴(carbidopa，CDP)分别或联合给药进行治疗。细胞实验用人肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)株LX-2，高浓度葡萄糖刺激或同时用SH、CDP或单胺氧化酶A(monoamine oxidase A，MAO-A)抑制剂氯吉兰(clorgyline，CGL)处理细胞，观察高糖诱导LX-2细胞肌成纤维细胞化时5-HT的作用。用苏木精-伊红(hematoxylin & eosin，HE)及马松(Masson)三色染色法检测肝组织切片病理变化，免疫组织化学及Western blot分析蛋白表达，ELISA或酶试剂法检测生化指标，荧光探针法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species，ros)含量。结果：T2DM小鼠肝脏的5-HTR、5-HT合成酶和MAO-A表达上调，且5-HT含量升高。SH和CDP治疗，在降低肝脏5-HT含量及下调MAO-A表达的同时，可有效地改善肝脏病变：不仅改善肝功能及肝脂肪变性，还明显抑制肝脏ros(HO)含量升高，改善氧化应激，并抑制转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的产生，以及炎症和纤维化的发生，且SH和CDP的作用呈协同效应。LX-2细胞研究表明，高糖可上调5-HTR、5-HT合成酶和MAO-A表达，升高细胞内5-HT含量，使细胞的ros产生增多及肌成纤维细胞化，从而增加TGF-β1合成、炎症及纤维化因子产生。通过SH拮抗5-HTR，高糖刺激效应可被明显抑制；通过CGL抑制线粒体5-HT降解，高糖作用可被强烈抑制。SH还可抑制高糖诱导的5-HT合成酶及MAO-A表达上调。结论：高血糖诱导HSCs肌成纤维细胞化和TGF-β1产生，从而导致T2DM小鼠肝脏炎症及纤维化损伤，其发生的原因是诱导了5-HTR表达上调，5-HT合成及降解增加，使线粒体的ros产生增多。其中，5-HTR的作用是参与了对5-HT合成和MAO-A表达的调控。

关键词： 5-HT降解线粒体ros 肝星状细胞炎症纤维化

运动对衰老骨骼肌卫星细胞成肌分化中线粒体活性氧生成的影响及调控机制

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中国运动医学杂志 2012年第6期31卷 475-482页

作者：薄海王逊陈啟祥吉力立张勇军事医学科学院卫生学与环境医学研究所天津300050 天津体育学院天津市运动生理学与运动医学重点实验室天津300381 明尼苏达大学运动科学系美国MN55455 武警后勤学院部队训练医学教研室天津300162

目的:观察耐力运动训练对衰老骨骼肌卫星细胞成肌分化中线粒体活性氧(ros)生成的影响,并探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1(PGC-1α)对ros生成调控的潜在机制。方法:C57BL/6小鼠分为青年对照组(YN组,2月龄,12只)、老年对照组... 详细信息

目的:观察耐力运动训练对衰老骨骼肌卫星细胞成肌分化中线粒体活性氧(ros)生成的影响,并探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1(PGC-1α)对ros生成调控的潜在机制。方法:C57BL/6小鼠分为青年对照组(YN组,2月龄,12只)、老年对照组(ON组,12月龄,12只)和老年运动训练组(OT组,12月龄,12只),其中OT组进行中等强度跑台训练(0°,17 m/min,25 min/天,5天/周)。12周后,HE染色鉴定骨骼肌萎缩程度。两步酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,原代培养并体外诱导成肌分化24 h。倒置显微镜观察卫星细胞成肌分化程度,测定线粒体呼吸功能、细胞ros水平、线粒体ros生成速率、肌球蛋白重链(MyHC)各亚基mRNA表达,及MyHC、PGC-1α、Tfam、COXⅣ、MnSOD蛋白表达量。结果:与YN组比较,ON组肌纤维横截面积、肌管形成数量、My-HC蛋白表达、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡx mRNA表达、态3呼吸速率(ST3)、呼吸控制比(RCR)和PGC-1α、Tfam、COXⅣ、MnSOD蛋白表达均显著降低(Pros水平、线粒体ros生成速率及MyHCⅡb mRNA表达显著升高(Pros水平、线粒体ros生成速率及MyHCⅡb mRNA表达显著降低(P线粒体能量代谢,减少线粒体ros产生,以促进成肌分化。

关键词：耐力运动衰老线粒体ros PGC-1α 成肌分化

长亚型转录因子Nrf1在无机砷暴露致小鼠骨髓间充质干细胞损伤中的作用及机制

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长亚型转录因子Nrf1在无机砷暴露致小鼠骨髓间充质干细胞损伤中的...

作者：娄彬中国医科大学

学位级别：硕士

目的:砷是一种常见的有毒环境类金属污染物,在自然界中分布广泛。长期无机砷暴露可引起恶性肿瘤、皮肤损伤和代谢相关疾病等多种健康效应。脂肪组织和骨组织等是无机砷作用的重要靶点,即使是在低剂量长期暴露也会引起这些组织的损伤,导... 详细信息

目的:砷是一种常见的有毒环境类金属污染物,在自然界中分布广泛。长期无机砷暴露可引起恶性肿瘤、皮肤损伤和代谢相关疾病等多种健康效应。脂肪组织和骨组织等是无机砷作用的重要靶点,即使是在低剂量长期暴露也会引起这些组织的损伤,导致2型糖尿病和骨质疏松等疾病的发生。间充质干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能成体干细胞,可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。研究表明间充质干细胞是砷毒性作用的重要靶细胞。砷可以通过氧化应激等多种途径影响间充质干细胞的细胞活力,从而抑制脂肪和成骨细胞新生而影响脂肪和骨组织的健康。核因子E2相关因子（Nuclear Factor E2-related Factor,Nrf）1作为CNC-bZIP（CNC-basic Leucine Zipper）家族的重要转录因子,除了调节细胞氧化还原稳态外,还在细胞增殖与衰老、葡萄糖代谢、线粒体呼吸、胚胎发育与细胞分化等方面发挥重要调控作用。多项研究发现Nrf1在无机砷暴露诱导的细胞毒性作用中发挥重要作用。本研究拟用原代小鼠骨髓间充质干细胞（mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,mBM-MSCs）作为细胞模型,探讨长型Nrf1在急性无机砷暴露致间充质干细胞损伤中的作用并探索其潜在机制,为将来探索Nrf1在无机砷暴露致干细胞功能紊乱的机制研究提供新的思路。研究方法:本研究采用贴壁法分离原代小鼠骨髓间充质干细胞,国际细胞治疗协会推荐的鉴定方法进行鉴定。此分离技术在本研究组前期已完成条件摸索。不同浓度无机砷暴露后通过CCK-8实验检测细胞活力,免疫印迹实验检测NRF1不同分子量蛋白对砷的反应性。利用含有shRNA的慢病毒建立Scramble和LNrf1基因沉默（L-Nrf1-KD）稳定转染的细胞。无机砷暴露后通过观察细胞形态完整性、细胞活力、细胞凋亡率以及检测凋亡相关蛋白表达来判断Scramble和L-Nrf1-KD细胞的砷敏感性差异。5μM无机砷暴露24小时后,收集细胞;相同浓度无机砷暴露24小时后,替换为无砷完全培养液培养24小时后,收集细胞培养液,利用原子荧光法检测细胞对砷的蓄积和外排能力;通过mRNA-seq数据分析水通道蛋白（Aquaporin,AQP）和ATP结合盒式蛋白家族（ATP-binding Cassette Transporter C Family,ABCC）转运蛋白mRNA在mBM-MSCs中的表达丰度;检测基础状态和无机砷暴露对关键分子的mRNA和蛋白表达的影响。通过检测Nrf2的m RNA、蛋白以及下游基因表达水平;MitoSox Red探针检测线粒体源性活性氧（Reactive Oxygen Species,ros）水平,来评估基础状态和无机砷暴露时Nrf2所介导的抗氧化防御作用。使用线粒体源性ros特异清除剂Mito-quinone干预后观察细胞的形态完整性、细胞凋亡率以及细胞凋亡蛋白表达。结果:与对照细胞相比,无机砷暴露能显著诱导间充质干细胞细胞内长型NRF1蛋白表达水平（p＜0.05）。与Scramble细胞相比,L-Nrf1-KD细胞形态与间充质干细胞表面标志物表达均未发生改变。砷（＞10μM）暴露24小时后,LNrf1-KD细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3和cleaved-PARP表达显著高于Scramble细胞（p＜0.05）。与Scramble细胞相比,L-Nrf1-KD细胞砷蓄积量无明显差异,但外排量降低15%（p＜0.05）。通过对ABCC和AQP家族分子检测后发现,ABCC4可能是引起砷外排降低的主要原因。15μM无机砷暴露不同时点检测发现,L-Nrf1-KD细胞内NRF2蛋白水平在12小时后显著低于Scramble细胞（p＜0.05）,且NRF2下游抗氧化基因Gclc、Gclm、Nqo1以及Hmox1的m RNA水平亦显著低于Scramble细胞（p＜0.05）。15-20μM无机砷暴露24小时,L-Nrf1-KD细胞线粒体源性ros水平显著高于Scramble细胞（p＜0.05）;线粒体活性氧特异清除剂Mito-quinone处理后无机砷暴露所致L-Nrf1-KD细胞凋亡率显著降低（p＜0.05）。结论:1.无机砷暴露诱导mBM-MSCs中NRF1的蛋白表达,且以L-NRF1为主。2.L-Nrf1缺失除可抑制ABCC4表达而抑制砷外排,还可增加mtros水平,进而增强无机砷诱导mBM-MSCs毒性效应。

关键词：间充质干细胞砷细胞毒性 Nrf1 Nrf2 线粒体ros

巨噬细胞AHR/TLR/STAT3信号轴在黄曲霉毒素B1诱发小鼠结肠炎中的作用机制研究

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巨噬细胞AHR/TLR/STAT3信号轴在黄曲霉毒素B1诱发小鼠结肠炎中的...

作者：张砾文山东大学

学位级别：硕士

研究目的黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是最常见、毒性最大的一种真菌毒素,广泛存在于谷物及其食品制品中。由于其高度的化学和热稳定性,即使食品加工后也很难完全消除,是动物及人类健康潜在的危险因素。AFB1具有致癌性、致突变性、... 详细信息

研究目的黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是最常见、毒性最大的一种真菌毒素,广泛存在于谷物及其食品制品中。由于其高度的化学和热稳定性,即使食品加工后也很难完全消除,是动物及人类健康潜在的危险因素。AFB1具有致癌性、致突变性、致畸性和免疫抑制作用,对肝脏、肾脏、神经系统均具有毒性作用,大量的研究对其相关毒性机制进行了探讨。近年来的研究显示低剂量AFB1亚急性暴露与肠道炎性损伤相关,但其机制尚不明确。新近研究表明,AFB1是芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AHR)的配体,其结合活性得到了鉴定和确认。配体-受体结合是细胞敏感且有效的应答外界刺激的启动机制,AHR被认为可通过靶向炎性相关基因表达、调控免疫细胞分化影响免疫或炎性疾病的发生发展。因此,我们推测AHR可能参与介导了AFB1对肠道的炎性损伤效应。为进一步观察和确认AFB1与肠道炎性损伤及与AHR的关系,本研究观察了 AFB1亚急性暴露对小鼠结肠组织的损伤效应及与肠道组织内巨噬细胞的关系;采用体外实验进一步探索了 AFB1通过影响巨噬细胞功能损伤肠上皮细胞的潜在机制,并经多组学技术联合应用分析了 AFB1诱导的巨噬细胞AHR/TLR/STAT3相关信号轴改变与小鼠结肠炎间的相关性,以有助于AFB1及其它环境污染物致结肠炎的有效防治。研究方法体内实验中,BALB/c雄性小鼠经口染毒AFB1 30d,通过血常规及血清炎性脂质组学检测评价体内炎性状态,结肠组织切片病理形态学观察评估AFB1对小鼠结肠的损伤,HE染色观察炎性细胞浸润并采用免疫荧光染色观察髓系来源的免疫细胞在肠道损伤部位的聚集情况。体外实验中,将人单核细胞白血病(THP-1)细胞首先诱导分化为巨噬细胞(M0)后给予AFB1暴露,采用Transwell与人结直肠腺癌(Caco-2)细胞进行共培养,观察AFB1经巨噬细胞介导对肠道上皮细胞的损伤作用;并进一步通过Western blot、多组学等多种技术手段分析AFB1对THP-1诱导分化的M0型巨噬细胞的影响及相关蛋白改变,探究AHR/TLR/STAT信号轴在AFB1诱导结肠损伤中的机制作用。实验结果体内实验结果表明,AFB1(5～50μg/***)经口暴露小鼠导致小鼠肠道长度缩短、结肠隐窝模糊甚至消失、杯状细胞黏蛋白分泌增多、上皮细胞损伤,伴有明显的炎性细胞浸润;血清炎性脂质组学检测显示与炎症反应相关分子发生明显变化;小鼠结肠组织中活性氧(reactive oxygen species,ros)及一氧化氮(nitric oxide,NO)呈现剂量依赖性升高;免疫荧光染色可见明显的髓系免疫细胞聚集和浸润。体外实验结果表明,AFB1暴露导致THP-1诱导分化的M0巨噬细胞吞噬能力增强,伴随 ros、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)水平明显升高。将THP-1诱导分化的M0型巨噬细胞经AFB1暴露后与Caco-2细胞共培养,采用7-AAD/Annexin V染色经流式细胞术检测显示AFB1引起Caco-2细胞死亡增加,同时升高培养基中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factors-α,TNF-α)及白介素-6(interleukin-6,IL-6)水平。转录组测序(RNA-seq)及蛋白质组学分析显示,巨噬细胞暴露于AFB1后,炎性通路相关mRNA及蛋白发生明显改变;Western blot检测进一步证实AFB1暴露诱导巨噬细胞炎症相关功能蛋白表达呈现显著上升趋势,AHR及AHR/TLR/STAT3信号轴关键蛋白变化显著。结论***1亚急性暴露导致BALB/c小鼠结肠炎,表现为小鼠肠道长度缩短、结肠隐窝模糊、杯状细胞和上皮细胞受损,伴随明显的炎性细胞浸润。***1可通过AHR/TLR/STAT信号轴,上调M0巨噬细胞AHR、TLR2、TLR4蛋白表达,下调线粒体ros调节因子STAT3和p-STAT3(Ser727)的表达,使其处于炎性状态,导致肠道上皮损伤。

关键词：黄曲霉毒素B1 芳香烃受体结肠炎巨噬细胞线粒体ros